利用基于荧光素酶的大型肿瘤抑制因子（LATS）生物传感器监测Hippo信号通路活性

摘要

本文介绍了一种基于荧光素酶的生物传感器，用于定量检测大型肿瘤抑制因子（LATS）的激酶活性——LATS是Hippo信号通路中的核心激酶。该生物传感器在基础研究和转化研究中具有广泛的应用前景，可用于研究Hippo信号通路的调控因子。 体外 和 体内.

摘要

Hippo 信号通路是器官大小的保守调控因子，在发育和癌症生物学中具有重要作用。由于技术上的挑战，目前仍难以评估该信号通路的活性并将其置于生物学背景下进行解读。现有关于大肿瘤抑制因子（LATS）的文献依赖于定性方法，难以扩展用于高通量筛选。最近，我们开发了一种基于生物发光的生物传感器，用于监测 LATS（Hippo 激酶级联反应的核心组分）的激酶活性。本文描述了如何利用该 LATS 生物传感器（LATS-BS）来鉴定 Hippo 通路调控因子的操作流程。首先，我们提供了一个详细的实验方案，用于研究过表达候选蛋白（e.g., VEGFR2）对 LATS 活性的影响，该实验使用 LATS-BS 进行检测。接着，我们展示了如何利用 LATS-BS 进行小规模激酶抑制剂筛选。该方案可进一步扩展用于更大规模的筛选，有望发现 Hippo 通路的新调控因子。

引言

Hippo 信号通路最初在Drosophila中被发现，是一种调控细胞生长和动物体型的新型调节因子^1,2。自首次发现以来，越来越多的证据有力地表明，Hippo 通路在发育过程（例如，早期胚胎发育、器官大小控制以及三维[3-D]形态）、肿瘤发生（例如，肿瘤形成、转移、血管生成、免疫逃逸、基因组不稳定性、应激反应和耐药性）以及组织稳态（例如，干细胞自我更新与分化、损伤后组织再生）中发挥着关键作用^{3,4,5,6,7,8,9,10}。Hippo 信号通路在多种癌症中经常出现功能失调^7,8,....

方案

1. 利用LATS-BS研究Hippo信号通路的一个假定调控因子

1. 细胞铺板与转染
   1. 细胞培养的制备
      1. 将1×PBS、含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM以及0.25%胰蛋白酶-EDTA置于水浴中约37 °C预热30分钟。
      2. 用70%乙醇彻底清洁生物安全柜。
      3. 根据需要将培养皿、巴斯德吸管、血清移液管和移液器吸头放入组织培养超净台中。
      4. 从水浴中取出1×PBS、培养基和胰蛋白酶-EDTA，用70%乙醇擦拭清洁后，放入生物安全柜中。
   2. 细胞的培养与转染铺板
      1. 选择转染效率较高的细胞系（例如，HEK293）用于实验。通过蛋白质印迹检测该细胞系中Hippo信号通路组分的表达，以确认Hippo信号通路处于激活状态。
      2. 在37 °C、5% CO₂培养箱中，于10 cm培养皿内用DMEM培养HEK293细胞₂每天在显微镜下观察细胞。当细胞融合度达到80–90%时，按以下方法进行传代。
      3. 向培养板中加入 5 mL 1× PBS，轻轻摇晃培养板，然后完全吸除液体。
      4. 加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液至培养板中，轻轻晃动培养板，确保胰蛋白酶均匀覆盖细胞。
      5. 在37 °....

结果

将LATS-BS与不同基因共转染，以评估这些基因对LATS活性的影响（图3）。在本实验中，Renilla被用作内参对照。YAP-5SA（YAP的组成型活性形式）的瞬时表达会通过已知的反馈通路导致YAP转录靶基因水平升高，进而引起LATS激酶活性增强²⁵。MST是Hippo信号通路中LATS的上游激活因子（图1），也能增强生物传感器的信号强度。然而，VEGFR的过表达可激活PI3K/MAPK信号通路，抑制LATS并降低LATS-BS的信号强度。

在第二个实验方案中，将 LATS-BS 转染至 HEK293AD 细胞中，转染 24 小时后，将细胞接种至 96 孔板。转染 40 小时后，用已知的 Hippo 信号通路小分子调节剂处理细胞，随后进行荧光素酶检测（

讨论

尽管Hippo信号通路在多种生物学过程中发挥着关键作用，且其失调会导致癌症⁶，但目前对Hippo通路如何响应各种刺激而被调控的机制尚未完全阐明。此外，目前尚缺乏可用于定量且实时评估Hippo通路核心组分活性的系统。近期，我们开发并验证了一种新型生物传感器，用于检测Hippo通路中LATS激酶的活性²⁴。该生物传感器不仅可用于在活细胞中对Hippo信号活性进行定量和精确监测，还可用于筛选靶向Hippo通路以治疗癌症的药物。此外，基于该生物传感器的筛选有助于发现调控Hippo通路的新型基因。鉴于Hippo信号在癌症中的重要性，探索其他基因与Hippo通路之间的关键串扰，将是所有癌症生物学家值得开展的一项重要研究。因此，该生物传感器有望推动当前癌症治疗领域的创新，并可能为癌症的有效治疗提供一种有用的新策略。

使用LATS-BS时应考虑若干重要事项。首先，根据我们的经验，当用于转染的质粒为新鲜提取自细菌时，LATS-BS的灵敏度最高。其次，转染质粒的用量 LATS-BS 质粒转染细胞的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	2520056	0.25%
胎牛血清（FBS）	Sigma	F1051
DMEM	Sigma	D6429-500ml	高糖DMEM
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140122
PolyJet 体外 DNA转染试剂	Signagen	SL100688.5
5倍被动裂解缓冲液	Promega	E194A	30 ml
Dual-Glo® 荧光素酶检测试剂盒	Promega	E2940	100 ml 试剂盒
20/20 发光仪	Turner Biosystems	998-2036	单管型发光检测仪
GloMax® Navigator 双注射器型	Promega	GM2010	96孔板型发光检测仪