本文介绍了一种显性负性可诱导系统的构建方案，该系统可通过可逆地过表达目标蛋白的显性负性突变体，从而实现对任意蛋白的条件性失活。
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本文内容
摘要
摘要
显性负性（DN）蛋白抑制是一种调控蛋白功能的强有力方法，相较于其他基于基因组的策略具有多项优势。例如，尽管嵌合体和Cre-LoxP靶向策略已被广泛应用，但这些策略本身存在固有局限性（如启动子渗漏表达、Cre表达嵌合性等），显著限制了其应用范围。此外，许多内源性基因的完全敲除会导致胚胎致死，从而无法研究这些基因在出生后生命阶段中的功能。为应对这些挑战，我们对早期的基因工程方案进行了重要改进，将Rb1基因的短片段（转基因形式）与溶酶体蛋白酶前体组织蛋白酶B（CB）相结合，构建了一种Rb1基因的显性负性小鼠模型（CBRb）。由于含有溶酶体蛋白酶，整个CB-RB1融合蛋白及其相互作用复合物均被导向蛋白酶体介导的降解途径。此外，转基因结构中包含四环素诱导元件（rtTA），可实现对RB1蛋白的可诱导且可逆的调控。CBRb小鼠模型中存在广泛表达的ROSA-CAG启动子，使其成为一种有效的工具，可用于在几乎所有表达RB1的细胞类型中实现Rb1基因的瞬时且可逆的失活，为研究人员深入理解RB1的功能提供了重要资源。
引言
大多数旨在实现基因和蛋白质敲除的方法依赖于永久性过程，通常会导致目的基因、RNA序列或目的蛋白（POI）的完全消除或截短。本方法的总体目标是构建一种重组蛋白，以消除内源性野生型蛋白的功能。我们重新审视并改进了一种替代策略1,2，该策略可通过显性负性抑制（DN抑制）实现对目的蛋白（POI）的暂时性敲除。该方法适用于多聚体和单体肽，但尤其适用于以多聚体形式发挥功能的蛋白质。
该方法包括将溶酶体蛋白酶CB与多聚体目的蛋白（POI）的一个亚基融合，形成CB融合复合物。所形成的CB融合复合物能够与内源性蛋白相互作用并对其进行蛋白水解消化，或引导整个CB-POI复合物靶向溶酶体进而被降解3。此外，将CB融合复合物与四环素调控的转录激活系统（TetO）的可诱导特性相结合，可实现转基因可逆、可控的诱导表达2。尽管在许多情况下该方法具有实用性，但在体内完全删除基因或蛋白质可能导致生物体死亡4,5,6。同样，使用Cre/Lox系统进行某些基因或蛋白质的组织特异性条件性敲除可能并不理想，因为这最终将导致....
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方案
转基因CBRb小鼠的制备以及所有相关的动物护理和实验均经克雷顿大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照其指导原则进行。
1. 转基因 CB-Myc6-Rb1 构建体
注意：将CBRb克隆至pTet_Splice载体中是通过多步过程完成的（图 1A 和 1B）。
- 将第一阶段克隆操作导入 pCS2+CB-Myc6 载体中。
- 为构建 CBRb 转基因载体，使用以下引物扩增一段长度为 1583 bp 的 Rb1 cDNA 片段（对应 RB1 蛋白中第 369–896 位氨基酸，共 528 个氨基酸）：EcoRI+RB 1243F 引物序列为 GGGGAATTCATTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC，XbaI+EcoRV+RB 2826R 引物序列为 CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC。
- 如前所述1<....
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结果
通常，设计显性负性（DN）突变需要关于目标蛋白（POI）结构与功能的大量信息。相比之下，本文所介绍的DN策略在目标蛋白的结构与功能信息有限时尤为有用。如果目标蛋白为多聚体蛋白，则将其中一个亚基与溶酶体蛋白酶融合，可通过内源性亚基的蛋白水解以及多聚体向溶酶体的亚细胞定位转移，从而显性抑制组装完成的多聚体蛋白，并可能同时抑制其他配体。为验证克隆成功并检测Dox调控的转基因激活效果，将含有TetO-DN-CB-myc6-Rb1构建体的纯化pTet-Splice质粒转染至稳定表达rtTA蛋白但不表达Rb113的小鼠NIH3T3细胞中。在无Dox条件下，表达rtTA的细胞未显示RB1表达；而在加入Dox后，RB1表达显著增强（图2A）。接下来，为测试该系统的可逆性，我们将纯化的pTet-Splice/TetO-DN-CB-myc6-Rb1质粒与pCMV-Tet3G载体共转染至内源性表达Rb1
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讨论
为了克服传统转基因策略相关的局限性，我们尝试构建一种小鼠模型，可在特定时空条件下通过过表达目的蛋白（POI）的显性负性（DN）突变体，从而条件性失活内源性POI。针对消除内源性POI功能的问题，已有多种方案被提出15,16,17。我们改进了先前的一种遗传策略1，将依赖多西环素（Dox）的转录系统与一种简便的策略相结合，后者利用溶酶体蛋白酶CB的融合蛋白，生成一种突变肽段，其表达可影响内源性POI的表达2。最重要的是，该技术无需预先了解与POI相关的信号通路。目前这种针对DN蛋白抑制的策略表明，CBRb融合基因上的溶酶体定位信号可将整个RB相互作用复合物导向溶酶体2,3。一旦进入溶酶体，这些蛋白即启动蛋白水解加工过程，进而被降解
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
pCS2+CB-Myc6 载体由 Marshall Horwitz（美国华盛顿州西雅图市华盛顿大学）惠赠。HEI-OC1 细胞由 Fedrico Kalinec（美国加利福尼亚州洛杉矶市加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院）慷慨提供。技术援助由内布拉斯加大学医学中心小鼠基因组工程核心实验室（C.B. Gurumurthy、Don Harms、Rolen Quadros）和克瑞顿大学综合生物医学成像设施（Richard Hallworth、John Billheimer）提供。内布拉斯加大学医学中心小鼠基因组工程核心实验室获得了美国国立卫生研究院/普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）机构发展奖（IDea）的支持，资助号为 P20 GM103471。综合生物医学成像设施得到了克瑞顿大学医学院以及 NIH/NIGMS 资助号为 GM103427 和 GM110768 的项目支持。该设施的建设还获得了美国国立卫生研究院研究资源中心（NCRR）资助号 RR016469 和 NIGMS 资助号 GM103427 的资助。本研究中建立的小鼠品系保藏于克瑞顿大学动物资源设施，其基础设施的改善得益于 NIH/NCRR 资助号 G20RR024001 的支持。本研究曾获得 NIH/NCRR 5P20RR018788-/NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE 项目资助（Shelley D. Smith）、NIH/ORIP R21OD019745-01A1（S.M.R.-S.）以及听力健康基金会（Hearing Health Foun....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基，DMEM | GIBCO-BRL | 11965-084 | |
| 最低必需培养基伊格尔，MEME | Sigma | M8042 | |
| 胎牛血清 | Sigma | F2442 | |
| Lipofectamine | DharmaFECT | T-2010-03 | |
| Sal I | Roche | 11745622 | |
| EcoRV-HF | New England BioLabs | R3195S | |
| NotI | Roche | 13090730 | |
| CaspaTag | Millipore | APT523 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| 星形孢菌素 | Sigma | S4400 | |
| CyQuant NF 细胞增殖检测试剂盒 | Invitrogen | C35007 | |
| 视网膜母细胞瘤 1 抗体 | Abcam | Ab6075 | |
| c-Myc 抗体 | Sigma | M5546 | |
| b-actin | Sigma | A5316 | |
| Ki-67 | Thermofisher scientific | MA5-14520 | |
| 鬼笔环肽 | Thermofisher scientific | A12379 | |
| 荧光微孔板读板仪 | FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech | ||
| 落射荧光显微镜 | NikonEclipse80i | ||
| TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) 小鼠品系可从杰克逊实验室获取，编号为 JAX#032011。 |
参考文献
- Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
- Tarang, S., et al.
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重印与许可
