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自动化正电子发射断层扫描（PET）放射性示踪剂合成方案用于临床生产

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DOI：

10.3791/58428

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2018年10月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1SOFIE, 2Department of Molecular & Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles (UCLA), 3Ahmanson Translational Imaging Division, University of California, Los Angeles (UCLA), 4Crump Institute for Molecular Imaging, University of California, Los Angeles (UCLA)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

参与多项早期临床研究试验的正电子发射断层扫描（PET）成像机构需要具备强大且多功能的放射性示踪剂制备能力。以放射性示踪剂[18F]Clofarabine为例，我们阐述如何利用一种灵活的、基于卡匣式放射性合成仪实现放射性示踪剂的自动化合成，并验证该合成方法在临床应用中的可行性。

摘要

新型正电子发射断层扫描（PET）示踪剂的开发使研究人员和临床医生能够成像越来越多样的生物学靶点和生物过程。然而，示踪剂种类的不断增加给放射性药房的生产带来了挑战。传统上，为每种示踪剂配置专用的放射性合成仪和热室以进行重复生产是可行的，但这种工作流程正逐渐需要改变。近年来出现的基于一次性卡匣/试剂盒的商用放射性合成仪，通过消除对示踪剂特异性定制改造的需求，使得利用同一套设备生产多种示踪剂变得更加简便。此外，其中一些放射性合成仪还允许操作人员自行开发和优化合成方案，而不仅限于购买商业化的现成试剂盒。在本方案中，我们描述了如何将一种新型PET示踪剂的手动合成过程在上述放射性合成仪上实现自动化，并验证其用于临床级示踪剂生产的通用流程。作为示例，我们采用ELIXYS放射性合成仪，这是一种灵活的基于卡匣的放射化学工具，可在同一系统上支持PET示踪剂的研发以及常规临床探针的生产，用于制备[18F]氯法拉滨([18F]CFA），一种用于测量的PET示踪剂 体内 脱氧胞苷激酶（dCK）酶活性。将手动合成过程进行转化，需要将合成方案分解为基本的放射化学步骤，再将其转化为直观的化学操作。 "单元操作" 由合成器软件支持。随后可通过拖放界面将这些操作快速组合成自动合成程序。经过初步测试后，合成与纯化步骤可能需要优化，以达到预期的产率和纯度。当达到理想性能后，需对合成过程进行验证，以确定其是否适用于临床用放射性示踪剂的生产。

引言

通过分子影像技术PET，越来越多的生物学靶点可以在活体受试者中实现动态可视化。via 使用特异性放射性示踪剂（标记了正电子发射核素的分子），PET能够对特定的生物学、生物化学和药理学过程进行in vivo检测，这些示踪剂在成像前被注入受试者体内1。PET在基础科学和临床研究中被广泛用于研究多种此类过程2,3,4，以及在药物发现、开发和患者治疗中的临床应用5,6，这导致对多样化放射性示踪剂的需求不断增长7,8。为避免放射化学人员受到辐射暴露，并确保这些短半衰期示踪剂的可重复生产，通常采用在“热室”内的自动化放射合成仪进行制备"hot cell"。近年来的放射合成仪采用一次性盒式/试剂盒架构，在简化符合临床级生产要求操作的同时，仅通过更换盒式装置即可灵活地制备多种类型的放射性示踪剂9。然而，在早期临床阶段，通常尚无 commercially-available 的盒式装置/试剂盒可用于自动化放射合成；因此，PET药物生产机构难以在合理的时间范围内以可接受的成本定制系统，以实现cGMP级示踪剂的生产能力。为此，已开发出将盒式/试剂盒架构与支持示踪剂研发和优化功能相结合的放射合成仪。

ELIXYS FLEX/CHEM（ELIXYS）是一种灵活的基于卡盒的放射性合成仪，具有广泛的试剂、溶剂和反应温度兼容性10。该系统配备三个反应容器，并采用机器人机制，可根据特定的合成方案动态配置流体通路11。合成仪软件允许通过拖放诸如捕获同位素、洗脱同位素、添加试剂、反应和蒸发等单元操作，为不同的示踪剂创建合成程序（序列）12。每个单元操作均提供多种可由操作人员编程的参数，例如持续时间、温度或惰性气体驱动压力（压力）。通过理解各个单元操作的特性，可将手动合成方法轻松转化为一系列单元操作，并在优化方案过程中进行修改13。结合ELIXYS PURE/FORM模块，集成系统还可实现正电子发射断层扫描（PET）示踪剂的自动化纯化与制剂。利用该放射性合成仪，我们此前已报道了24种不同的18F标记示踪剂和连接基团的自动化合成11,14,15,16，以及在不改变系统配置的情况下仅通过更换试剂实现生物分子的自动化酶促放射性氟化标记17。其他研究团队也已实现[18F]RO6958948的自动化合成，用于tau蛋白神经原纤维缠结的成像18；[18F]F-Py-TFP连接基团的自动化合成及其后续对多肽的标记19；以及[18F]AM580的自动化合成，用于磷酸二酯酶10a（PDE10A）的成像20。此外，多个研究小组已展示了适用于临床应用的示踪剂的制备，包括用于线粒体膜电位成像的4-[18F]氟苄基-三苯基磷（[18F]FBnTP）21、用于前列腺特异性膜抗原（PSMA）成像的[18F]DCFPyL22，以及用于tau蛋白成像的[18F]THK-535123。

本文中，我们以[18F]CFA的使用经验为例，说明如何将手动放射性合成步骤直接且快速地转化为符合cGMP规范、适用于常规生产的自动化合成方法。示踪剂[18F]CFA的设计目的是用于成像dCK活性。[18F]CFA的手动放射性合成最初由Shu et al.24描述，该方法使用两个反应容器，经中间硅胶柱纯化，并通过最终的HPLC纯化步骤完成（详见补充材料中的第1节）。近期的体外和临床前研究表明，该示踪剂对dCK具有极高的特异性，首次人体研究也显示出良好的生物分布特性25。目前迫切需要开展更大规模的临床研究，以验证[18F]CFA PET对dCK活性变化的敏感性，同时长期来看，该示踪剂在临床上的应用潜力也备受关注26。它可能作为某些治疗手段的有效生物标志物，例如可激活T细胞、诱导DNA损伤或依赖dCK介导的核苷类似物前药的疗法。特别是，[18F]CFA可能有助于对接受氯法拉滨（Clofarabine）治疗的患者进行疗效反应的分层评估。此外，[18F]CFA还有助于推动正在进入临床试验阶段的dCK抑制剂的研究与开发。由于该示踪剂传统上采用手动合成方式，因此上述所有研究的推进均依赖于一种可靠、可用于临床的[18F]CFA自动化合成方法。

尽管我们此前已报道过用于临床前研究的[18F]CFA的自动化合成方法16，但本方案在此基础上进一步完善，描述了该示踪剂临床生产所需的额外改进，包括全自动纯化与制剂步骤的整合、方案验证以及质量控制检测。此处所述的一般性操作流程不仅适用于开发[18F]CFA的自动化且符合临床要求的合成方法，还可直接推广应用于其他氟-18标记放射性示踪剂的自动化合成，以满足其临床使用需求。

方案

1. 临床生产用放射性合成方案的自动化与验证通用操作流程

  1. 分析手动合成方案在临床生产中的适用性
    1. 对产品中可能存在的任何非预期残留化学物质污染进行风险分析。
      1. 避免使用1类溶剂（如苯），并以适当的替代溶剂（2类或3类）替换。
      2. 避免使用在最终配方中难以检测的化学物质，以防其作为潜在的残留杂质。
      3. 仅选择市售高纯度级别的化学品（建议使用美国药典或欧洲药典级别），并须附有分析证书。
    2. 如果风险分析中检测到任何不期望的化学品或溶剂，则优化合成路线，并重复步骤1.1，直至不再存在此类物质。
  2. 自动化合成方案
    1. 如果使用相同合成仪的示踪剂自动化方案已创建并上传至在线数据库，请下载该合成程序的副本。
    2. 如果尚无自动化合成程序，则创建一个。
      1. 使用纸笔，将手动合成过程划分为高层次的步骤（例如，干燥/活化[18F]氟化物，加热以促进放射化学反应，进行纯化步骤等）。进一步将这些高层次步骤分解为所需的具体基本过程。例如，[18F]CFA 如下所示 图1，高级步骤的识别如图所示 图2A，其分解为各个步骤的过程如图所示 图2B.
      2. 使用纸笔，将每个流程映射到合成软件提供的各个单元操作中。例如，对[18F]CFA 加入合成器软件中合适的单元操作13 如图所示 图2C.
      3. 使用放射性合成仪编程界面，创建一个空白程序，并通过点击按顺序添加每个已确定的单元操作 菜单 按钮（左上角）并选择 序列，然后点击 新序列 按钮。对于步骤 1.2.2.2 中确定的每个单元操作，将该单元操作从可用操作中拖动至胶片视图，并通过单击或输入来填写该单元操作各项参数的设定值。 图3 显示了完成所有合成操作后界面的一个示例［18F]CFA 已填充完毕，且用户已选择第一个 反应 用于编辑参数值的单元操作。最终的合成程序用于[18F]CFA 在文中被描述为 补充材料, 表 S1 和 S2.
    3. 验证合成程序。
      1. 进行一次预实验。按照步骤 2.1 - 2.3 设置并运行程序，使用除放射性核素以外的所有试剂和溶剂（例如，[18F]氟化物）以验证预期行为。
      2. 如有必要，调整程序中的单元操作参数值（例如，完全转移试剂所需的时间或驱动压力、将溶剂蒸发至目标程度所需的时间/温度等），并重新测试。要调整参数值，首先返回到 编辑 通过选择模式 序列 从主菜单（屏幕左上角）中选择新创建的程序。接着，在胶片视图（屏幕底部）中点击目标单元操作，导航至所需参数，然后选择或输入新值。
    4. 进行低活性（< 370 MBq）测试运行以评估该程序。
      1. 通过调整参数值来优化自动合成过程，以提高产率、合成时间、重复性及其他任何期望的可测结果。
  3. 制定质量控制（QC）检测程序
    1. 使用终产物的非放射性参照物及潜在化学杂质样品，建立一种分析性放射性高效液相色谱（radio-HPLC）和/或放射性薄层色谱（radio-TLC）方法，实现各组分的充分分离，以测定化学纯度、摩尔活性、放射化学纯度和放射化学同一性。对分析方法的重复性和线性进行验证，并确定其检出限和定量限。
    2. 类似地，开发并验证一种气相色谱法以分析挥发性杂质（例如，合成过程中使用的溶剂残留量。
    3. 开发并验证可检测和定量其他潜在杂质的分析方法例如，冠醚-222 通过 标准显色斑点试验
    4. 采用标准操作程序检测无菌性、pH值、放射性核素鉴定、放射性核素纯度、放射性活度浓度、产品体积和内毒素水平。
  4. 进行合成验证
    1. 建立合成及质量控制（QC）检测流程的标准操作规程（SOPs），并整合符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）要求的物料与设备追踪系统。
    2. 验证合成步骤 通过 按照标准操作规程，在与临床生产预期相同的放射性活度水平下，进行三次独立且连续的生产运行。记录合成过程的性能及质量控制检测结果。
    3. 所有连续的验证运行必须通过预设的质量控制限。若某次验证运行失败，应在妥善解决失败的根本原因后，重复整个验证过程。

2. 示例：用于临床的 [18F]CFA 的自动化合成

  1. 准备放射性合成仪
    1. 打开放射性合成仪电源。
    2. 确保惰性气体供应已开启并具有足够的压力，且相关阀门已打开，使放射性合成仪与气体供应系统正确连接。
    3. 在反应器1号和2号位置安装新的一次性卡盒，并插入含有磁力搅拌子的反应容器。确保每个卡盒的转移 dip tube 垂直向下。
    4. 根据图示准备试剂瓶并将它们安装到卡盒中 图4.
    5. 安装一个空的 [18O]H2O回收瓶中的 W1 1号卡带的位置。
    6. 通过先用12 mL的1 M KHCO₃溶液冲洗，活化一个季铵甲基（QMA）柱3 溶液通过，随后加入12 mL去离子水。用5 mL乙酸乙酯通过硅胶Sep-Pak小柱进行活化。
    7. 连接滤筒并按照图示完成所有盒式管路的连接 图 5A确认无卡带管路（包括未使用的管路）悬垂于内部，以免干扰机械臂运动。
    8. 连接[18F]氟化物源管线从回旋加速器到[18F]氟化物输入管路，位于卡匣#1上。
    9. 确保废液容器为空。将纯化/配制子系统的废液管路连接至废液容器（即，样品环1废液管、HPLC子系统废液管和注射泵废液管）。
    10. 连接高效液相色谱（HPLC）的进样管路。将HPLC流动相进样管路“A”置于含有25 mM乙酸铵的容器中，将HPLC流动相进样管路“B”置于含有乙醇（EtOH）的容器中。
    11. 平衡纯化/配制子系统和高效液相色谱柱。
      1. 通过在软件中选择纯化/配制模块的控制页面来打开 高效液相色谱法 从主菜单（左上角）开始。默认情况下， 纯化 标签页将已被选中。（此页面显示在 图6.)
      2. 将流速设定为5.0 mL/min（溶剂组成按预定比例），并选择纯化柱安装的柱位。开启高效液相色谱泵，以等度洗脱模式运行至少10分钟。
      3. 用流动相冲洗产品管线和所有组分收集管线，每条管线各冲洗1分钟。
      4. 使用注射器，分别用10 mL流动相冲洗每个高效液相色谱（HPLC）样品环及HPLC样品环转移管。
    12. 连接纯化/配制子系统的注射泵输入管路。使用高浓度氯化钠（90 mg/mL）作为 洗脱 线和0.9%生理盐水用于 重悬 线。
    13. 启动配制子系统。
      1. 导航至 配方 纯化/制剂控制页面的标签
      2. 为启动高浓度氯化钠溶液（90 mg/mL），请选择 洗脱 选项卡。按下 初始化 启动注射泵。分配5 mL。
      3. 为预冲0.9%生理盐水，选择 重悬 分装 5 mL。
    14. 连接 产品 和 最终产物 将纯化/配制子系统的前端管路通过三通连接。将三通的出口连接至无菌滤器（0.22 µm），再将滤器连接至最终的无菌产品小瓶。将带有无菌滤器的通气针插入最终产品小瓶的顶空部分。最终系统装置的照片如图所示 图5B.
    15. 向冷阱中加入干冰和乙醇或甲醇。
  2. 运行合成程序
    1. 通过选择导航至项目列表 序列 从主菜单按钮（左上角）选择[18F]CFA 程序，并通过按下 运行 按钮
    2. 仔细检查运行前清单上的每一项，并在完成时逐一勾选。运行前清单界面的一部分如图所示。 图7.
    3. 按压 继续 确认设置已完成，并启动自动合成。
      1. 必要时，可通过视觉反馈（反应器摄像头）、传感器读数（如温度、压力、真空度、辐射读数等）和倒计时定时器实时监测合成过程。图中显示了典型的截图示例 图8.
      2. 在……期间 纯化 单元操作，选择 产品 当产物峰开始在放射性检测器色谱图上出现时。此单元操作期间的代表性截图（包含紫外检测器和放射性检测器输出的色谱图）如下所示。 图9.
      3. 当辐射检测器色谱峰回到基线后，选择 废弃物 将高效液相色谱子系统的流路切换至废液容器。
  3. 设置并运行配方程序
    1. 从程序列表中（序列 屏幕），打开 [18F]CFA 配方 程序
    2. 调整制剂单元操作的参数。
      1. 计算所收集产物组分的体积（V组分根据HPLC泵的流速和馏分收集的持续时间计算。
      2. 计算为达到等渗所需添加的氯化钠（90 mg/mL）的体积，并计算为使乙醇浓度稀释至10%以下所需添加的生理盐水的量。
      3. 使用这些数值修改程序。输入氯化钠（90 mg/mL）的体积 洗脱 步骤以及生理盐水的体积被输入以用于 重悬 步骤。（计算方法在下文中描述） 补充材料, 图 S2.)
      4. 保存程序。
    3. 运行程序。系统将使用氯化钠和生理盐水稀释收集的纯化产物组分，以确保制剂的等渗性，并通过除菌过滤器将产物导入无菌产品小瓶中。
  4. 收集配制的[18F]CFA 用于质量控制和运输
    1. 去除配制的[18从热室中取出F]CFA产品。
    2. 使用无菌操作技术，吸取两份样品（每份300 µL）用于质量控制检测。
    3. 使用第一个样品通过接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰蛋白胨大豆肉汤培养基，培养14天未观察到任何微生物生长，以检测最终制剂的无菌性。
    4. 使用第二个样品，按照步骤1.3中建立的程序进行质量控制。以下为加州大学洛杉矶分校Ahmanson生物医学回旋加速器中心依据美国药典（U.S. Pharmacopeia）所制定的程序。
      1. 通过目视检查评估外观。
      2. 使用指示试纸测定pH值。
      3. 使用动态显色法细菌内毒素检测（BET）测定细菌内毒素含量。
      4. 采用分析型放射性高效液相色谱法（radio-HPLC）检测放射性化学纯度，通过验证放射性样品与非放射性参比化合物的共洗脱来确认其放射化学同一性。
      5. 通过比较γ-检测器色谱图中放射性杂质的曲线下面积（AUC）与目标产物对应的AUC，采用分析型放射性高效液相色谱法（radio-HPLC）评估放射化学纯度。
      6. 通过测定所有紫外吸收杂质在紫外检测器色谱图中的峰面积（AUC），利用分析型高效液相色谱法评估化学纯度。
      7. 通过测定紫外检测器色谱图中目标产物对应的峰面积（AUC），利用分析型放射性高效液相色谱法评估摩尔活性和载体质量。
      8. 通过在两个不同时间点测量探针的活性并拟合衰变曲线，评估其半衰期。
      9. 采用气相色谱法测定制剂中的残留溶剂含量。
      10. 使用伽马能谱仪评估放射性核素能量。
      11. 使用基于薄层色谱（TLC）的点斑试验评估冠醚222的含量。
    5. 如果所有测试均通过，则放行探针制剂，运往临床成像场所。
  5. 运行后处理与系统关闭
    1. 用水中的70%（v/v）乙醇冲洗HPLC纯化柱及用于产物收集的所有管路。此操作应通过PURE/FORM控制页面完成，类似于步骤2.1.12。
    2. 关闭放射性合成仪 通过 的 功率 软件中的按钮。弹出窗口将提示何时可以关闭系统电源。
    3. 关闭相应的截止阀，切断压缩空气和惰性气体供应。
    4. 让热室内残留的放射性物质衰变一段时间（通常过夜）。
  6. 清洁放射性合成仪
    1. 移除并妥善处理合成过程中使用过的所有盒式卡匣、柱盒、反应小瓶和试剂小瓶。
    2. 清空冷阱中的内容物。
    3. 清洁纯化子系统的流体管路。
      1. 打开一个现有的清洗程序，或创建一个包含一个处于清洗模式的纯化单元操作的新程序（即，带有 清洁 复选框已选中）。参见 补充材料, 图S9 例如。
      2. 在参数配置页面，选择用于纯化的色谱柱以及连接盛有70%乙醇水溶液瓶的HPLC流动相进样管线。设定流速为2 mL/min，每个进样环的冲洗时间为5 min，每个产物和馏分出口的冲洗时间为30 s. 选择 干燥线 并设置持续时间为30 s.
      3. 将所有馏分线输出物放入大型废液容器中。
      4. 运行程序。
      5. 实验结束后，清空废液容器。
    4. 清洁配制子系统的流体管路。
      1. 打开一个现有程序或创建一个新程序，该程序包含一个处于清洗模式的配方单元操作（即，带有 清洁 复选框在下方被选中 清洁 标签）。参见 补充材料, 图 S10 例如。
      2. 在纯化/配制子系统的前端，向一个洁净的稀释储液槽中加入 100 mL 的 EtOH。
      3. 放置纯化/配制子系统 洗脱 乙醇储液罐中的输入管（含有 > 50 mL 乙醇
      4. 放置 洗涤 和 重悬 将输入管线与最终产品输出管线一同接入废液容器。
      5. 运行程序。
      6. 实验结束后，清空废液容器。

结果

开发了一种自动化生产[18F]CFA的方法，并合成了三个验证批次。[18F]CFA的合成、纯化和制剂制备在90 ± 5分钟内完成（n = 3），未经衰变校正的放射化学产率为8.0 ± 1.4%（n = 3）。三次运行的放射性活度产率分别为3.24 GBq、2.83 GBq和3.12 GBq，起始放射性活度分别为34.3 GBq、41.8 GBq和41.1 GBq。所获得的[18F]CFA制剂均通过了所有质量控制检测（表1）。目前，该自动化方案正用于临床级[18F]CFA的生产，以支持临床试验。

质量控制数据验证运行 1验证运行 2验证运行 3
[“通过”要求]
外观通过通过通过
[澄清、无色、无颗粒物]
结束合成时的放射性浓度213 MBq/mL210 MBq/mL180 MBq/mL
[≤ 740 MBq/mL @ 结束合成时]
pH65.86
[5.0 – 8.0]
半衰期115 分钟108 分钟112 分钟
[105 – 115 分钟]
放射化学纯度99%99%99%
[> 95%]
通过相对保留时间（RRT）测定的放射化学鉴定1.011.011.01
[1.00 < RRT < 1.10]
摩尔活度314 GBq/µmol>370 GBq/µmol>370 GBq/µmol
[≥ 3.7 GBq/µmol]
终产品中的总载体质量3.1 µg<1 µg<1 µg
[≤ 50 µg/剂量]
终产品中的总杂质质量NDNDND
[≤ 1 µg / 剂量]
基于总载体质量 ≤ 50 µg/剂量且总杂质质量 ≤ 1 µg/剂量的最大允许注射体积整批整批整批
通过气相色谱法测定的残留乙醇含量8.90%9.50%9.60%
[≤ 10%]
通过气相色谱法测定的残留乙酸乙酯含量<1 ppm<1 ppm<1 ppm
[≤ 5000 ppm]
通过气相色谱法测定的残留乙腈含量<1 ppm<1 ppm<1 ppm
[≤ 410 ppm]
通过显色斑点试验测定的残留K222通过通过通过
[< 50 µg/mL]
滤膜完整性测试通过通过通过
[起泡点 ≥ 50 psi]
细菌内毒素通过通过通过
[符合 USP <71> 要求]
通过γ能谱法测定的放射性核素纯度通过通过通过
[>99.5%]
无菌性通过通过通过
[符合 USP <71> 要求]

表1：三个验证批次的质量控制（QC）测试数据汇总。 EOB = 轰击结束；EOS = 合成结束；ND = 未检出。

氟化反应路径；化学结构图；亲核取代；合成。
图1：[18F]CFA放射性合成路线图。 MMT = 单甲氧基三苯甲基。 请点击此处查看此图的放大版本。

氟化合成过程示意图；固相萃取，高效液相色谱纯化，同位素标记。
图 2：将手动合成转化为自动化的单元操作序列。（A）本图展示了手动合成 [18F]CFA 的高级步骤概览。（B）本图显示了执行每个高级步骤所需的基本操作流程。（C）用于执行基本操作的放射性合成仪专用单元操作以卡片形式展示。每个单元操作都有一组独立的参数值（以下划线标示），通过软件进行配置。“R1”和“R2”分别表示反应容器 #1 和 #2。试剂编号对应的试剂在 图 4 中标明。这一系列单元操作被保存为一个 序列，并由软件执行以完成自动化合成。请点击此处查看该图的放大版本。

合成化学自动化界面；可编程反应序列图；反应器设置。
图3：放射性合成仪（ELIXYS）软件界面的截图，用于创建合成程序。通过拖放式界面，可将单元操作按所需顺序放置在时间轴中。在此截图中，已选中一个反应单元操作，其可编辑的参数值显示在屏幕主区域。本示例中，氟化反应将在1号反应容器（密封）中于120 °C下进行10分钟，并伴随主动搅拌。反应时间结束后，容器将冷却至35 °C。其他单元操作可编程参数值的详细信息见补充材料，第3节。请点击此处查看此图的放大版本。

18F-Clofarabine 的合成示意图；反应盒配置；化学处理的试剂设置。
图 4：试剂配置界面的截图。 在 [18F]CFA 的合成流程中，所有试剂均加载至一次性反应盒 #1 中，该反应盒在组件选择区域中已高亮显示。本实验所描述的 [18F]CFA 合成过程中，洗脱液 为含有 1.0 mg K2CO3 和 5.0 mg K222 的 0.4 mL H2O/0.5 mL MeCN 溶液，前体 为 6 mg CFA 前体溶于 0.6 mL MeCN 中，HPLC 流动相 为体积比 85:15 的 25 mM 醋酸铵水溶液与乙醇混合液。 请点击此处查看该图的放大版本。

放射化学装置示意图与照片；用于同位素标记的自动化放射合成仪，配有两套卡带。
图5：[18F]CFA合成用放射合成仪装置示意图。（A）该图为卡带流体通路、与柱管连接方式，以及将放射合成模块中粗产物转移至纯化/配制模块的连接方式的示意图。（两个模块均由同一台计算机和软件界面控制。）（B）此为在热室内完成[18F]CFA合成准备后，放射合成仪的实际照片。请点击此处查看该图的高清版本。

高效液相色谱系统界面、蛋白质纯化色谱装置、流速和紫外检测控制显示。
图6：纯化/制剂模块控制界面的截图。 操作人员在合成准备过程中通过该界面手动控制高效液相色谱仪及制剂子系统。请点击此处查看此图的放大版本。

高效液相色谱系统设置：盒式插件、氮气供应、管路、冷阱、搅拌子、溶剂和色谱柱检查。
图 7：运行前检查清单界面。 操作人员需输入已安装在系统中的盒式插件序列号，并逐项核对，以确保系统已正确配置并做好合成准备。除这些部分外，操作人员还需填写合成运行的名称和描述（第1部分），所有所用试剂的批号（第2部分），并确认所有反应器视频信号均正常工作（第6部分）。请点击此处查看此图的放大版本。

放射性化学合成示意图；18F-Clofarabine 工艺中的单元操作与传感器数据。
图8：运行 [18F]CFA 合成序列时放射性合成仪软件的截图。 软件在胶片带区域显示单元操作的执行顺序。已完成的操作以灰色显示并用白色高亮，当前正在进行的操作以灰色高亮，即将执行的操作以深灰色显示。屏幕中央区域显示当前活动单元操作的状态，包括正在执行的子命令以及系统的当前状态（反应器视频画面和传感器数据）。此特定的 React 单元操作为氟化反应。在 Temp 区域，显示反应器的当前温度及其目标（程序设定）温度。其下方的 Activity 区域显示与该反应步骤相关的三个传感器的辐射检测值。最后，左侧的视频画面实时显示反应小瓶的情况。请点击此处查看该图的放大版本。

色谱结果；纯化曲线；紫外/放射性检测；流速/压力显示；合成装置。
图9：合成 [18F]CFA 过程中执行纯化单元操作时，放射性合成仪用户界面的截图。 纯化/制剂模块的紫外检测器和放射性检测器输出信号实时显示在中央图表中。检测器和高效液相色谱泵的其他反馈信息显示在屏幕右侧。操作人员在产物峰开始出现时，临时选择产物以收集目标峰，待完整峰形通过后，再切换回废液。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案定义了将手动合成方案自动化时应遵循的基本步骤，以实现临床级示踪剂制剂的制备。整个开发流程（包括质量控制方法的建立）以放射性示踪剂 [18F]CFA（用于成像dCK活性）为例进行说明。特别关注了对自动化合成过程的优化，以确保所制备示踪剂适用于临床应用。该合成过程包含若干基本操作步骤，如 [18F]氟离子的活化、前体分子的放射性氟标记、中间产物的固相萃取柱纯化、保护基团的脱除、半制备型高效液相色谱（HPLC）纯化以及注射用制剂的配制。这些基本操作构成了标准操作流程，足以满足绝大多数18F标记的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂的合成需求。

在设计合成方案时，试剂的选择及其质量保证对于临床应用尤为重要。通过进行模拟合成（仅使用溶剂）来确认程序设置正确以及连接无误，是排除在放射性条件下合成时出现意外错误的关键步骤。后续的合成优化（包括溶剂、体积、用量、温度、反应时间及纯化条件）取决于正在开发的特定PET示踪剂。在这些实验过程中，应特别关注最终产物所能达到的化学纯度和放射化学纯度，因为这些指标必须满足临床应用的严格要求。通常情况下，相较于产率较高但存在偶发失败风险的工艺，人们更倾向于选择能够稳定地以较低但足够活度产率生成高纯度产物的合成方法。一旦合成工艺得到充分优化，最终流程必须经过验证测试（法规要求），以确保其适用于临床。经验证的合成方法随后可用于制备临床用PET示踪剂。按照已验证的方法合成PET示踪剂时，应严格遵循标准操作规程。为确保合规性，软件被设定为：在点击Run启动合成后，操作人员需通过预运行检查清单确认关键步骤的完成情况。via尽管系统将自动执行合成过程，但纯化步骤需要人工干预。因此，操作人员必须在HPLC纯化阶段密切观察色谱屏幕，并实时手动输入何时开始和停止收集产物馏分。

在我们对[18F]CFA 的合成中，我们通过使用由乙酸铵溶液和乙醇组成的可注射溶剂体系，简化了产物混合物的半制备型高效液相色谱纯化方法；此前的方法在纯化后需要额外的步骤进行溶剂置换。16因此，后续的制剂过程只需将收集到的组分中的乙醇含量降低至允许水平，并确保其等渗性，这两点均可通过稀释实现。制剂步骤采用第二个程序完成，该程序包含单一的制剂单元操作，允许向纯化后的产品组分中加入不同体积的氯化钠溶液。 通过 考虑到HPLC纯化后所得体积的可变性，需将配制模块纳入程序。若收集产物组分的体积设定为恒定值，则配制单元操作可并入主合成程序中，从而无需单独编写程序。另一种避免手动干预的方法是充分利用配制模块的全部功能。例如将纯化的示踪剂用水稀释，上样至C18固相萃取小柱，洗涤后用固定体积的乙醇（EtOH）洗脱，最后用固定体积的生理盐水稀释。

本文介绍的用于自动化和验证临床用途合成方案的技术具有广泛的适用性。通过选择放射性合成仪（ELIXYS），可实现多种合成过程的自动化与验证，包括复杂的三反应釜合成，或涉及高挥发性溶剂高温反应的合成。通过调整软件程序的参数，可对合成过程进行优化。该合成仪具备监测参数变化影响的功能，例如可准确定位反应容器，以便取样进行放射性薄层色谱（radio-TLC）或放射性高效液相色谱（radio-HPLC）分析。然而，在不进行系统改造的情况下，当前系统尚无法处理极低试剂体积（约5–20 µL）、中间产物蒸馏，或 [18F]AlF、68Ga 及其他放射性金属的处理。若待自动化的手动合成步骤包含上述操作且无法规避，则宜考虑采用其他放射性合成仪平台进行自动化与验证。

尽管本研究主要致力于开发一种用于临床应用的[18F]CFA自动化生产方案，但许多其他PET示踪剂的合成也可采用相同的逻辑和方法实现自动化，并适用于临床生产。依据本文所述方法，我们还对9-(4-[18F]氟-3-[羟甲基]丁基)鸟嘌呤([18F]FHBG)的自动化合成进行了优化，并已完成其临床应用的验证。用户建立的实验方案可上传至或从SOFIE Probe Network下载，该网络是一个供不同放射性药房站点共享合成程序及相关文档的网络平台27。此举可避免科研界重复投入资源，并有助于推动涉及PET成像的多中心临床研究。

披露

加州大学董事会已将由 Jeffrey Collins 和 R. Michael van Dam 发明的技术授权给 SOFIE，并作为许可交易的一部分持有 SOFIE 的股权。此外，R. Michael van Dam 是 SOFIE 的创始人和顾问。该安排的条款已经加州大学洛杉矶分校根据其利益冲突政策进行审查并批准。Eric Schopf 和 Christopher Drake 是 SOFIE 的员工及股东。

致谢

本工作部分得到了美国国家癌症研究所（R44 CA216539）以及加州大学洛杉矶分校基金会的资助，该基金会接受了拉尔夫和玛乔里·克拉姆普为加州大学洛杉矶分校克拉姆普分子成像研究所的捐赠。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ELIXYS FLEX/CHEMSofie（美国加利福尼亚州卡尔弗城）1010001放射性合成仪
放射性合成仪卡盒Sofie（美国加利福尼亚州卡尔弗城）1861030400ELIXYS FLEX/CHEM 反应盒
ELIXYS PURE/FORMSofie（美国加利福尼亚州卡尔弗城）1510001放射性合成仪纯化模块
[O-18]H2OIBA RadioPharma Solutions（美国弗吉尼亚州雷斯顿）IBA.SP.065>90% 同位素纯度
[O-18]H2O 中的 [F-18]氟化物加州大学洛杉矶分校N/A在回旋加速器（RDS-112；Siemens；Knoxville，TN，USA）中通过[O-18]H2O的(p,n)核反应制备。使用容积为1 mL的钽靶和哈瓦尔箔，以11 MeV能量进行轰击。
去离子水加州大学洛杉矶分校N/A纯化至 18 MΩ 并通过0.1 µm 滤膜
乙腈（MeCN）Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）271004无水，99.8%
乙醇（EtOH）Decon Laboratories, Inc.（美国宾夕法尼亚州普鲁士王市）2701无水，200度
氢氧化钠（NaOH）溶液默克公司（美国马萨诸塞州伯灵顿）1.09137.10001 M 溶液
盐酸（HCl）溶液Fisher Chemical（美国新罕布什尔州汉普顿）SA48-5001 M 溶液
乙酸乙酯（EtAc）Fisher Chemical（美国新罕布什尔州汉普顿）E195SK-4HPLC 级
氯化钠（NaCl）Fisher Chemical（美国新罕布什尔州汉普顿）S-640-500USP 级
乙酸铵Fisher Chemical（美国新罕布什尔州汉普顿）A639-500HPLC 级
碳酸钾（K2CO3）Fisher Chemical（美国新罕布什尔州汉普顿）P-208-500认证级 ACS
CFA前体CalChem Synthesis（美国加利福尼亚州圣地亚哥）N/A定制合成
穴醚 222（K222；Kryptofix 2.2.2）ABX Advanced Biochemical Compounds（德国拉德贝格）800.1000>99%
氯化钠（NaCl）溶液（生理盐水）Hospira（美国伊利诺伊州莱克福里斯特）0409-4888-020.9%，用于注射，USP 级别
硅胶柱沃特斯（美国马萨诸塞州米尔福德）WAT051900Sep-pak Classic
季铵甲基铵（QMA）小柱Waters（美国马萨诸塞州米尔福德）WAT023525Sep-pak Light Plus
无菌注射器滤器（0.22 µm)Millipore Sigma（美国马萨诸塞州伯灵顿）SLGSV255FMillex-GV
玻璃V型小瓶（5 mL）Wheaton（新泽西州米尔维尔）W986259NG用作反应容器
隔膜Wheaton（新泽西州米尔维尔）224100-072用于试剂瓶
压盖帽Wheaton（新泽西州米尔维尔）224177-01用于试剂瓶
琥珀色血清小瓶（2 mL）沃伊格特（美国堪萨斯州劳伦斯）62413P-2用于试剂瓶
磁力搅拌子Fisher Scientific（美国新罕布什尔州汉普顿）14-513-65用作反应容器

参考文献

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  27. SOFIE. Sofie Probe Network. , Available from: http://www.sofienetwork.com/ (2018).

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