从外周血中分离CD4+ T细胞并利用六色流式细胞术分析循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）亚群

摘要

本文描述了一种从人外周血中分离和鉴定CD4⁺ T细胞亚群的实验方案。通过流式细胞术分析纯化的CD4⁺ T细胞，以确定滤泡辅助性T细胞亚群的比例。

摘要

在自身免疫性疾病中可检测到滤泡辅助性T细胞（Tfh）的异常活性，当分析B细胞非霍奇金淋巴瘤的淋巴结微环境时，其存在与临床结局相关。循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）是存在于血液中的Tfh细胞记忆池亚群，在疾病状态下也出现紊乱，因此可能作为潜在的新型预测性生物标志物。基于外周血的检测具有优势，因其相对无创，且便于进行简单的连续监测。本文介绍了一种从人外周血中分离CD4⁺ T细胞的方法，并通过流式细胞术进一步分析以定量cTfh细胞及其不同亚群（cTfhPD-1^-/+/hi、cTfh1,2,17 和 cTfh1/17）的比例。随后在健康受试者与淋巴瘤患者之间比较了这些亚群的水平。我们发现，该方法足够稳健，能够从常规采集的患者样本中获得可靠结果。本文所述分析技术可轻松扩展应用于细胞分选及后续实验，如RT-PCR。

引言

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是一类CD4⁺ T细胞亚群，最初在淋巴组织中被发现¹。这类细胞表达PD-1和CXCR5表面受体，分泌IL-21和IL-4，并在细胞核内表达转录因子BCL-6^2,3。顾名思义，它们主要存在于生发中心，对于高亲和力抗体的产生至关重要¹。

Tfh 反应失调已被证实与多种疾病的发病机制相关，尤其是在自身免疫性疾病中，Tfh 细胞可促进自身反应性 B 细胞的扩增⁴。此外，Tfh 细胞还在实体瘤^5,6和淋巴系统肿瘤⁷的肿瘤微环境中发挥重要作用。相反，Tfh 功能所必需的表面蛋白（如诱导性 T 细胞共刺激分子，ICOS）发生遗传缺陷时，会导致人类免疫缺陷综合征⁸。外周血中的 CD4⁺ CXCR5⁺ 细胞被称为循环滤泡辅助性 T 细胞（cTfh），被认为是组织中 Tfh 细胞的记忆组分⁹。本文所述方法的目的是在外周血样本中分离 CD4⁺ 细胞后，对 cTfh 亚群进行分析。

已定义多种cTfh亚群，它们在辅助B细胞方面的效率因亚群而异^9,10,11,12。这些亚群的相对比例在多种疾病中发生改变，其中最显著的是自身免疫性疾病，与功能较弱的PD-1^-和/或cTfh1亚群相比，功能更强的PD-1^+/hi和/或cTfh2或cTfh17亚群几乎总是出现相对增加¹²。这些变化的程度常与临床参数相关，包括疾病活动度和自身抗体滴度，提示cTfh亚群分布可能作为疾病预后的生物标志物，反映淋巴组织中Tfh细胞的活性^9,12,13,14。此外，采集受试者血液样本快速、安全且易于接受，因此可用于连续监测，以分析疾病进展或对治疗的反应。

使用分离的 CD4⁺ T 细胞替代传统的外周血单个核细胞（PBMNC）悬液，可通过减少获取大量用于分析的循环滤泡辅助性 T 细胞（cTfh）所需的时间，实现更高通量的流式细胞术实验。当利用流式细胞分选（FACS）从稀有的 cTfh 亚群中分选细胞时，这一点尤为有利。为了提高效率，这些细胞悬液可进行冷冻保存，以便在流式细胞术实验中将样本进行"批次处理"。经检测，冷冻保存并未降低 CD4⁺ 细胞的纯度。

尽管在初始发现阶段不同实验室使用不同的标志物来分类cTfh细胞，但本文所采用的方法依据Schmidt等人提出的统一方案，利用两组细胞表面标志物^12,15，可在一次流式细胞术实验中同时鉴定cTfh细胞及其九个已被确认的亚群。

由于仅使用细胞表面标志物，细胞无需固定或透化处理，因此可保持存活状态以进行后续功能研究。可通过使用相同抗体组合的流式细胞术（FACS）进行细胞分选来实现这一过程。该抗体组合还可进一步扩展以包含其他标志物，从而适应所用流式细胞仪的限制条件。

由于在二维散点图上设门具有内在的主观性，多色流式细胞术实验的分析可能具有挑战性，特别是当细胞群体在标记物荧光信号上不呈现明显的双峰分布时（例如循环滤泡辅助性T细胞及其亚群即属此情况）。因此，必须设置有效的对照，以减少人为假象，提高细胞群体的分辨能力，并更有把握地确定设门策略。为此，抗体组合设计以及流式细胞术实验的基本对照设置（即使用补偿对照和荧光减一对照）分别在步骤3.4.2和3.4.3中进行了说明。

所有cTfh细胞均定义为CD4⁺ CXCR5⁺ CD45RA^-。随后可通过检测特征性Tfh活化标志物PD-1的表达水平，鉴定PD-1^-、PD-1⁺或PD-1^hi的cTfh细胞亚群。接着，利用在传统Th1、Th2或Th17细胞中差异表达的趋化因子受体CXCR3和CCR6的组合，可根据CXCR3⁺ CCR6^-、CXCR3^- CCR6^-和CXCR3^- CCR6⁺的表达模式，将cTfh细胞分别表征为类似cTfh1、cTfh2或cTfh17的亚型。

本实验室使用的抗体组合见表1。使用者可能需要根据本地流式细胞仪所配备的激光器和光学滤光片配置，调整其荧光染料的选择。

以下因素会影响荧光染料的选择。应尽可能使用高亮度的荧光染料，特别是对较弱（表达水平较低）的标记物，应使用现有最亮的荧光染料。较弱的标记物包括 PD-1、CXCR3 和 CCR6，以及在一定程度上较弱的 CXCR5。我们特别使用了较新的 BB、BV 和 BUV 荧光染料，这些染料具有优异的亮度，因而有助于更清晰地区分不同的细胞群体。

尽可能将荧光染料的选择分布在发射光谱的各个区域，以最大限度地减少光谱重叠，从而降低所需的补偿水平。可使用以下免费在线工具辅助设计流式细胞术检测面板：http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer。为了节省发射光谱上的通道空间，我们采用了一个"废弃通道"，即使用一种发射波长与 APC-H7（偶联至 CD45RA）重叠的活性染料，从而通过单个检测器同时检测（并排除）死细胞和/或 CD45RA⁺ 细胞。

本文介绍了一种分离外周血CD4⁺ T细胞的方案，并通过流式细胞术对其进行后续分析，以确定不同且近期所描述的循环亚群的比例。

方案

从正常受试者（NS）（n = 12）以及边缘区淋巴瘤（MZL）患者（n = 7）和其他类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤（BNHL）患者（6例滤泡性淋巴瘤患者、2例淋巴浆细胞样淋巴瘤患者和1例未另作说明的低级别B细胞非霍奇金淋巴瘤患者）中采集血液样本。所有患者均来自莱斯特皇家医院血液科门诊，在签署知情书面同意书后入组，且所有研究均已获得伦理批准。患者样本的伦理批准由莱斯特郡、北安普敦郡和拉特兰研究伦理委员会1号（参考编号：06/Q2501/122）授予，正常受试者的伦理批准由健康研究局（HRA）NRES伦理委员会东米德兰兹-德比（参考编号：14/EM/1176）授予。

1. 从全外周血中分离CD4⁺ T细胞

1. 通过标准静脉穿刺法采集新鲜外周血（2 至 15 mL）至含 K₂EDTA 的采血管中，并尽快处理以保持细胞最大活性。
   注意：使用标准实验室个人防护装备（实验服、手套、护目镜），并在 II 级生物安全柜中进行操作。
2. 将血液及所有必需试剂（CD4⁺ 富集试剂盒、2% 胎牛血清/磷酸盐缓冲液（FBS/PBS）、密度梯度介质以及如需冻存细胞时的冻存液）恢复至室温。
3. 将血液与市售的人 CD4⁺ T 细胞富集抗体混合物混合。每 1 mL 血液使用 50 µL 试剂。对于 5 至 15 mL 血液，使用 50 mL 圆锥形聚丙烯管。
   ​注意：若使用 2 至 4 mL 血液，应在 14 mL 圆锥形聚丙烯管中进行此步骤。
4. 将混合物在室温下孵育 20 分钟。
5. 用等体积的 2% FBS/PBS 稀释该混合物。
6. 将此稀释后的混合物缓慢铺加在密度梯度介质上方，避免扰动界面，并立即进行离心，以防血液扩散进入密度梯度介质中。
   1. 对于 2 至 3 mL 血液，使用 14 mL 圆锥形聚丙烯管并加入 3 mL 密度梯度介质；对于 4 mL 血液，使用 14 mL 圆锥形聚丙烯管并加入 4 mL 密度梯度介质；对于 5 至 15 mL 血液，使用 50 mL 圆锥形聚丙烯管并加入 15 mL 密度梯度介质。
7. 将分层后的混合物在 20 °C 下以 1,200 x g 离心 20 分钟，关闭刹车。
   注意：温度低于室温可能导致红细胞和粒细胞污染。较低的离心速度会导致 CD4⁺ 细胞分离失败。保持刹车启用会降低细胞得率。使用带有可封闭转子的台式离心机以避免气溶胶产生。
8. 使用巴斯德吸管从界面处收集富集的 CD4⁺ 细胞层。
   注意：富集后的细胞层外观类似于标准的"白膜层"，即呈云雾状的白色细胞层，但由于仅含有 CD4⁺ 细胞，因此自然更小且更难观察。
9. 向 CD4⁺ 细胞中加入 2% FBS/PBS 至总体积达 10 mL，然后每次用 2% FBS/PBS 洗涤一次，每次以 400 x g 离心 10 分钟，共洗涤两次。
10. 将细胞沉淀重悬于 2% FBS/PBS 中，用活体染料（台盼蓝）染色后计数，以确定细胞数量和活力。
11. 可选步骤：将 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞重悬于冻存液（含 10% 二甲基亚砜的 FBS）中，每 1 mL 分装一份。
    注意：某些表面标志物的表达水平可能因冻存和复苏而改变。因此，所有样本必须以一致的方式处理。为最大限度减少分析变量间的差异，本研究中样本均经过冻存并集中批次进行分析。

2. 流式细胞术

1. 解冻冻存的 CD4⁺ 在37 °C水浴中快速解冻细胞，用预热的培养基（RPMI 1640 + L-谷氨酰胺，添加10%胎牛血清和1×青霉素-链霉素）洗涤一次。
2. 将细胞加入 9 mL 培养基中，400 x g 离心 5 分钟 g 并移除上清液。
3. 将细胞重悬于含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液（50 µL）中，使每个待测条件所用细胞数量介于5 × 10⁵至1 × 10⁶之间。⁵ 和 1 × 10⁶ 细胞
4. 将细胞与染色缓冲液（50 µL）混合。
   注意：由于BV或BUV染料本身具有某些化学特性，当同时使用两种或多种BV或BUV染料时，可能会产生多种染色伪影，干扰数据分析。使用Brilliant Stain Buffer可避免此类问题。在单染或未染色条件下，可用50 µL的1% BSA/PBS替代50 µL的Brilliant Stain Buffer。
5. 将抗体加入细胞（按照以下步骤） "使用体积" 柱 见表1）置于冰上避光孵育30分钟。
6. 用含 1% BSA 的 PBS 洗涤细胞两次，每次以 600 × g 离心 3 分钟 g 每次洗涤过程中。
7. 用 400 µL 1% BSA/PBS 重悬，转移至流式细胞术上机管中。
8. 在使用流式细胞仪获取数据前，轻轻涡旋混匀细胞：

3. 流式细胞术对照与设置

1. 使用未染色样本，调节光电二极管电压，使淋巴细胞能够与明显的碎片和死亡细胞（侧向散射（SSC）面积较高而前向散射（FSC）面积较低的事件）区分开来¹⁶。使用单染样本，调节光电倍增管（PMT）电压，使阳性荧光信号能够与背景荧光信号区分开，同时确保所有事件均落在可检测范围内。
   注意：进一步优化的方法是使用弱荧光微球，针对每个PMT绘制变异系数（CV）与PMT电压的关系曲线，以确定获得最佳分辨率所需的最低电压（即"Peak 2"方法¹⁹）。
2. 利用单染的捕获微球生成补偿矩阵，以校正光谱重叠。向1% BSA/PBS（100 µL）中加入市售的补偿微球（60 µL）和阴性对照微球（60 µL），涡旋混匀。
   注意：所用捕获微球必须与所用抗体的宿主物种和IgG同型相匹配。若任何串联染料的批号发生改变，应重新计算补偿矩阵，因为不同批次的串联染料其发射光谱可能存在显著差异。
3. 加入单一抗体（20 µL），涡旋混匀。
4. 室温避光孵育30分钟。
5. 以200 × g 离心10分钟，弃去上清液。
6. 用1% BSA/PBS（500 µL）重悬，涡旋混匀。
7. 根据仪器制造商的操作说明，在采集软件中使用指定的补偿矩阵生成工具，用流式细胞仪采集样本数据。
8. 使用荧光减一（FMO）对照来指导阳性标志物荧光设门，以校正染料溢出效应，后者是使用≥4种荧光染料实验中背景荧光的主要来源¹⁶。按照第3步所述的一般细胞表面染色流程操作，但针对每种条件，在染色步骤中省略一种荧光染料（当省略CD45RA时，也需同时省略活/死细胞染料）。每种条件采集100,000个淋巴细胞。
9. 将设门的阳性阈值设定为≤0.5%的细胞比例。FMO对照的图示示例见图2。

4. 数据分析

1. 使用流式细胞仪的采集软件，在FSC参数上设置5,000单位的阈值，以排除非常小的碎片。
2. 使用停止门采集10,000个cTfh细胞（CD4⁺ CD45RA^- CXCR5⁺）。
   注意： 用户可根据需要采集超过10,000个细胞。此数量是在确保获得足够细胞以产生有意义结果与采集耗时之间的一种折中。
3. 利用FSC-Area / SSC-Area散点图，绘制椭圆或任意多边形门，选择淋巴细胞群体，同时排除碎片和明显死亡的细胞（具有高SSC-Area和低FSC-Area的事件）。
4. 利用FSC-Area / FSC-Width散点图，绘制多边形门，选择单细胞，同时排除双联体（双联体的面积增加，但宽度与单细胞相似）。
5. 利用FSC-Area / CD45RA和活性标记物散点图，绘制矩形门，选择活的、CD45RA^-细胞（该标记物荧光信号较低的细胞）。
6. 利用FSC-Area / CD4散点图，绘制矩形门，选择CD4⁺细胞（该标记物荧光信号较高的细胞）。
7. 利用CD4 / CXCR5散点图，绘制矩形门，选择CXCR5⁺（即cTfh）细胞（该标记物荧光信号较高的细胞）。
8. 利用CXCR3 / CCR6散点图，设置四分门，将cTfh细胞细分为cTfh1,2和cTfh17细胞（各标记物表达高或低的细胞）。
   注意： 表型为CD4⁺ CXCR5⁺ CXCR3⁺ CCR6⁺的细胞目前特征尚不明确。我们将这些细胞称为cTfh1/17¹⁸，因为传统辅助性T细胞（CD4⁺ CXCR5^-）在Th17与Th1之间转换时会同时表达CXCR3和CCR6，已被描述为cTfh1/17¹⁹。
9. 利用PD-1直方图，使用范围工具将cTfh细胞（或根据需要选择cTfh1,2,17或cTfh1/17亚群）进一步划分为PD-1^-/+或^hi群体。
   注意： 文献中对PD-1⁺与PD-1^hi之间的界定尚不明确。本实验设定的阈值与使用相同抗体组合通过流式细胞术检测人扁桃体淋巴细胞悬液中真正Tfh细胞所需的PD-1强度一致。或者，也可在抗体组合中加入ICOS标记，因为只有PD-1^hi细胞表达ICOS⁺。

结果

采用CD4⁺分离方案可获得高纯度的CD4⁺细胞，该方案在我们检测的所有血液样本中均表现可靠（平均纯度：96.6%，标准差：2.38，n=31）（图3）。

在一个代表性正常受试者中鉴定出cTfh（CD4⁺ CXCR5⁺细胞）（图4A）。在12名正常受试者中，cTfh细胞占CD4⁺细胞的比例中位数为29.4%（四分位距（IQR）= 10.8）。多项针对不同疾病（包括肝细胞癌^17,20、系统性红斑狼疮^11,

讨论

本方案提供了一种简单且高效的方法来分析外周血中的循环滤泡辅助性T细胞（cTfh），可检测迄今为止文献中已鉴定的所有相关亚群。血液样本易于获取，可作为常规门诊检查的一部分，并可与临床数据同步采集系列样本。这使得能够开展前瞻性研究，评估cTfh亚群作为疾病进展或治疗反应的生物标志物的潜力。此类研究在滤泡辅助性T细胞功能失调被认为参与疾病发病机制的疾病中尤为重要，例如自身免疫性疾病以及某些类型的实体瘤和血液系统肿瘤。此外，由于本方案仅使用细胞表面标记物，可通过流式细胞术分选cTfh细胞，进一步研究疾病状态下cTfh细胞功能的变化。在边缘区淋巴瘤（MZL）患者中分选cTfh细胞使我们能够发现其与健康对照者相比在基因表达谱上的差异²¹。

我们发现，高效的CD4⁺ T细胞分离可改善数据分析结果。我们详细描述了相关操作步骤，因为离心机的刹车设置和转速等细微因素对分离过程至关重要。与所有流式细胞术分析一样，另一个重要步骤是设置补偿和FMO对照。

cTfh细胞上PD-1的表达...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
罗塞特分离人 CD4+ T 细胞富集混合液	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
菲可-帕克 PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 小鼠抗人 CD183 克隆 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 小鼠抗人 CD196 (CCR6) 克隆 11A9	BD Horizon	563923
BV421 大鼠抗人 CXCR5 (CD185) 克隆 RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 小鼠抗人 CD4 克隆  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE 小鼠抗人 CD279 克隆 MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 小鼠抗人 CD45RA 克隆  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD 可固定远红死细胞染色试剂盒，适用于 633 或 635 nm 激发	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant 染色缓冲液	BD Horizon	563794
抗小鼠 Ig，κ/阴性对照补偿微粒套装	BD CompBead	552843
FACS Aria II 流式细胞仪	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	流式细胞仪数据采集软件
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		流式细胞术数据分析软件
抗 CXCR3 抗体	BD Horizon	565223
抗 CCR6 抗体	BD Horizon	563923
抗 CXCR5 抗体	BD Horizon	562747
抗 CD4 抗体	BD Horizon	564419
抗 PD-1 抗体	BD Pharmingen	557946
抗 CD45RA 抗体	BD Pharmingen	560674
活力标记物	ThermoFisher Scientific	L34973