从外周血中分离CD4+ T细胞并利用六色流式细胞术分析循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）亚群

摘要

本文描述了一种从人外周血中分离和鉴定CD4⁺ T细胞亚群的实验方案。通过流式细胞术分析纯化的CD4⁺ T细胞，以确定滤泡辅助性T细胞亚群的比例。

摘要

在自身免疫性疾病中可检测到滤泡辅助性T细胞（Tfh）的异常活性，当分析B细胞非霍奇金淋巴瘤的淋巴结微环境时，其存在与临床结局相关。循环滤泡辅助性T细胞（cTfh）是存在于血液中的Tfh细胞记忆池亚群，在疾病状态下也出现紊乱，因此可能作为潜在的新型预测性生物标志物。基于外周血的检测具有优势，因其相对无创，且便于进行简单的连续监测。本文介绍了一种从人外周血中分离CD4⁺ T细胞的方法，并通过流式细胞术进一步分析以定量cTfh细胞及其不同亚群（cTfhPD-1^-/+/hi、cTfh1,2,17 和 cTfh1/17）的比例。随后在健康受试者与淋巴瘤患者之间比较了这些亚群的水平。我们发现，该方法足够稳健，能够从常规采集的患者样本中获得可靠结果。本文所述分析技术可轻松扩展应用于细胞分选及后续实验，如RT-PCR。

引言

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是一类CD4⁺ T细胞亚群，最初在淋巴组织中被发现¹。这类细胞表达PD-1和CXCR5表面受体，分泌IL-21和IL-4，并在细胞核内表达转录因子BCL-6^2,3。顾名思义，它们主要存在于生发中心，对于高亲和力抗体的产生至关重要¹。

Tfh 反应失调已被证实与多种疾病的发病机制相关，尤其是在自身免疫性疾病中，Tfh 细胞可促进自身反应性 B 细胞的扩增⁴。此外，Tfh 细胞还在实体瘤^5,6和淋巴系统肿瘤⁷的肿瘤微环境中发挥重要作用。相反，Tfh 功能所必需的表面蛋白（如诱导性 T 细胞共刺激分子，ICOS）发生遗传缺陷时，会导致人类免疫缺陷综合征⁸。外周血中的 CD4⁺ CXCR5⁺ 细胞被称为循环滤泡辅助性 T 细胞（cTfh），被认为是组织中 Tfh 细胞的记忆组分⁹....

方案

从正常受试者（NS）（n = 12）以及边缘区淋巴瘤（MZL）患者（n = 7）和其他类型的B细胞非霍奇金淋巴瘤（BNHL）患者（6例滤泡性淋巴瘤患者、2例淋巴浆细胞样淋巴瘤患者和1例未另作说明的低级别B细胞非霍奇金淋巴瘤患者）中采集血液样本。所有患者均来自莱斯特皇家医院血液科门诊，在签署知情书面同意书后入组，且所有研究均已获得伦理批准。患者样本的伦理批准由莱斯特郡、北安普敦郡和拉特兰研究伦理委员会1号（参考编号：06/Q2501/122）授予，正常受试者的伦理批准由健康研究局（HRA）NRES伦理委员会东米德兰兹-德比（参考编号：14/EM/1176）授予。

1. 从全外周血中分离CD4⁺ T细胞

1. 通过标准静脉穿刺法采集新鲜外周血（2 至 15 mL）至含 K₂EDTA 的采血管中，并尽快处理以保持细胞最大活性。
   注意：使用标准实验室个人防护装备（实验服、手套、护目镜），并在 II 级生物安全柜中进行操作。
2. 将血液及所有必需试剂（CD4⁺ 富集试剂盒、2% 胎牛血清/磷酸盐缓冲液（FBS/PBS）、密度梯度介质以及如需冻存细胞时的冻存液）恢复至室温。
3. 将血液与市售的人 CD4⁺ T 细胞富集抗体混合物混合。每 1 mL 血液使用 50 µL 试剂。对于 5 至 15 mL 血液....

结果

采用CD4⁺分离方案可获得高纯度的CD4⁺细胞，该方案在我们检测的所有血液样本中均表现可靠（平均纯度：96.6%，标准差：2.38，n=31）（图3）。

在一个代表性正常受试者中鉴定出cTfh（CD4⁺ CXCR5⁺细胞）（图4A）。在12名正常受试者中，cTfh细胞占CD4⁺细胞的比例中位数为29.4%（四分位距（IQR）= 10.8）。多项针对不同疾病（包括肝细胞癌^17,20、系统性红斑狼疮^11,

讨论

本方案提供了一种简单且高效的方法来分析外周血中的循环滤泡辅助性T细胞（cTfh），可检测迄今为止文献中已鉴定的所有相关亚群。血液样本易于获取，可作为常规门诊检查的一部分，并可与临床数据同步采集系列样本。这使得能够开展前瞻性研究，评估cTfh亚群作为疾病进展或治疗反应的生物标志物的潜力。此类研究在滤泡辅助性T细胞功能失调被认为参与疾病发病机制的疾病中尤为重要，例如自身免疫性疾病以及某些类型的实体瘤和血液系统肿瘤。此外，由于本方案仅使用细胞表面标记物，可通过流式细胞术分选cTfh细胞，进一步研究疾病状态下cTfh细胞功能的变化。在边缘区淋巴瘤（MZL）患者中分选cTfh细胞使我们能够发现其与健康对照者相比在基因表达谱上的差异²¹。

我们发现，高效的CD4⁺ T细胞分离可改善数据分析结果。我们详细描述了相关操作步骤，因为离心机的刹车设置和转速等细微因素对分离过程至关重要。与所有流式细胞术分析一样，另一个重要步骤是设置补偿和FMO对照。

cTfh细胞上PD-1的表达.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
罗塞特分离人 CD4+ T 细胞富集混合液	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
菲可-帕克 PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 小鼠抗人 CD183 克隆 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 小鼠抗人 CD196 (CCR6) 克隆 11A9	BD Horizon	563923
BV421 大鼠抗人 CXCR5 (CD185) 克隆 RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 小鼠抗人 CD4 克隆  RPA-T4	BD Horizon	564419
PE 小鼠抗人 CD279 克隆 MIH4	BD Pharmingen	557946
APC-H7 小鼠抗人 CD45RA 克隆  HI100	BD Pharmingen	560674
LIVE/DEAD 可固定远红死细胞染色试剂盒，适用于 633 或 635 nm 激发	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant 染色缓冲液	BD Horizon	563794
抗小鼠 Ig，κ/阴性对照补偿微粒套装	BD CompBead	552843
FACS Aria II 流式细胞仪	BD Biosciences	644832
FACSDiva 6.1.3	BD Biosciences	643629	流式细胞仪数据采集软件
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		流式细胞术数据分析软件
抗 CXCR3 抗体	BD Horizon	565223
抗 CCR6 抗体	BD Horizon	563923
抗 CXCR5 抗体	BD Horizon	562747
抗 CD4 抗体	BD Horizon	564419
抗 PD-1 抗体	BD Pharmingen	557946
抗 CD45RA 抗体	BD Pharmingen	560674
活力标记物	ThermoFisher Scientific	L34973