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方法文章

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

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DOI：

10.3791/58444

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2019年2月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Clinical Research Laboratory, University Medical Center, 2Atherothrombosis and Vascular Biology, Baker Heart & Diabetes Institute, 3Department of Medicine, Monash University

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外 转录的信使RNA。

摘要

基于信使RNA（mRNA）的治疗药物因其具有的多种优良特性，在治疗各类疾病方面正变得愈发重要 体外 体外转录（IVT）mRNA。借助IVT mRNA， 从头合成 目标蛋白的合成可在不改变靶细胞生理状态的情况下被诱导。此外，由于体外转录mRNA（IVT mRNA）具有瞬时效应，蛋白质的生物合成可实现精确调控。

为了实现细胞的高效转染，纳米脂质体（NLps）可作为治疗性mRNA安全且高效的递送载体。本研究描述了一种制备安全高效阳离子纳米脂质体的方案，该脂质体由DC-胆固醇和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）组成，可用于体外转录mRNA（IVT mRNA）的递送。通过干膜法制备的NLps具有明确的粒径、均一的分布以及高复合能力。此外，我们介绍了多种检测体系，用于分析NLps与合成增强型绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA的复合效率和转染效率，以及其对细胞活力的影响。总体而言，本方案提供了一种高效且安全的mRNA复合方法，有望推动并改善治疗性mRNA的递送应用。

引言

近年来，修饰mRNA在治疗领域的应用展现出巨大潜力。在心血管疾病、炎症性疾病、单基因遗传病以及疫苗开发中，mRNA均是一种具有前景的治疗剂1。

基于mRNA的蛋白质替代疗法相较于传统的基因治疗具有多项优势，后者依赖于将DNA转染至靶细胞2mRNA 的功能直接在细胞质中启动。尽管质粒 DNA（pDNA）是一种包含启动子区域和编码治疗蛋白基因序列的双链环状 DNA 构建体3，也可在细胞质中发挥作用，但只能被整合到转染时正处于有丝分裂阶段的细胞中。这会减少组织中被转染的细胞数量1,4特别是，对于有丝分裂活性较弱的组织（如心肌细胞）进行转染较为困难5与质粒DNA相比，mRNA的转染和翻译可在组织的有丝分裂和非有丝分裂细胞中进行1,6病毒DNA整合到宿主基因组中可能带来致突变效应或引发免疫反应7,8，但在用编码蛋白质的 mRNA 转染细胞后 从头合成 目标蛋白的合成自主启动9,10此外，通过个体化剂量，蛋白质合成可被精确调节以满足患者需求，且不会干扰基因组或带来致突变风险。11使用假尿苷和5'-甲基胞苷替代尿苷和胞苷，可显著降低合成mRNA的免疫激活潜能。12假尿苷修饰的mRNA也被证明具有更高的生物稳定性和显著增强的翻译能力13.

为了在临床应用中充分利用基于mRNA的治疗所具有的前景性特性，必须构建一种合适的载体，以将mRNA有效递送至细胞内。该载体应具备体外（in vitro）和体内（in vivo）无毒的特性，能够保护mRNA免受核酸酶降解，并促进足够的细胞摄取，从而实现mRNA的长期存留及其有效翻译14。

在所有可能的载体类型中 体内 药物递送，如碳纳米管、量子点和脂质体，其中脂质体的研究最为广泛15,16脂质体是由脂质双层构成的囊泡10它们具有两亲性，包含疏水部分和亲水部分，通过这些分子的自组装，形成球形双层结构。17在脂质体内部，治疗剂或药物可被包封，从而免受酶降解的破坏18含N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTMA）的脂质体19，[1,2-二(油酰氧基)-3-(三甲基铵)丙烷] (DOTAP)20和二十八烷基氨基甘氨酰精胺（DOGS）21，或DC-胆固醇22，其特性明确，常用于DNA或RNA的细胞转染。

阳离子脂质体由一种带正电荷的脂质和一种不带电荷的磷脂组成23转染 通过 阳离子脂质体是将核酸转运入细胞的最常用方法之一24,25阳离子脂质颗粒与核酸分子骨架中带负电荷的磷酸基团形成复合物26这些所谓的脂质复合物会附着在细胞膜表面，并通过内吞作用或类似内吞的机制进入细胞。27.

1989年，Malone et al. 成功描述了阳离子脂质介导的 mRNA 转染技术28。然而，该研究组使用DOTMA与1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）的混合物时发现，DOTMA表现出细胞毒性作用28。此外，Zohra et al. 表明，DOTAP（1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷氯化物）可作为mRNA转染试剂使用29。然而，为了实现高效的细胞转染，DOTAP需与其他试剂联合使用，例如纤连蛋白29或DOPE30。迄今为止，DOTMA是首个上市用于基因递送的阳离子脂质31。其他脂质则被用作治疗性载体，或正处于不同阶段的临床试验中；例如含DOTAP作为脂质载体的EndoTAG-I，目前正处于II期临床试验的研究阶段32。

本研究描述了一种制备含有DC-胆固醇和DOPE的纳米脂质颗粒（NLp）的实验方案。该方法操作简便，可制备不同粒径的NLp。采用薄膜干燥法制备NLp的总体目标是生成可用于mRNA复合的脂质体，从而实现高效且生物相容的体外细胞转染in vitro14,33。

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方案

1. 阳离子纳米脂质体的制备（图1）

  1. 将粉末状的DC-胆固醇（3β-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇盐酸盐）和DOPE（二油酰基磷脂酰乙醇胺）溶解于氯仿中，配制成终浓度为25 mg/mL的溶液。
    注意：将溶解后的脂质溶液储存于-20 °C。
  2. 使用浓度为25 mg/mL的两种脂质储备液。取40 µL溶解的DC-胆固醇与80 µL溶解的DOPE混合于玻璃烧瓶中。
    注意：总脂质量为3 mg。为避免氯仿快速挥发，在移液过程中应将脂质置于冰上操作。
  3. 在氩气气流下蒸发氯仿15分钟。随后，将装有硅胶的干燥器抽真空，将敞口的玻璃烧瓶放入其中，并持续抽真空过夜，以确保残留的氯仿完全蒸发，并在烧瓶内壁形成脂质膜。
    注意：操作应迅速，并避免不必要的O2接触。
  4. 用1 mL无核酸酶水重新水合所形成的脂质膜，并涡旋振荡悬浮液15分钟（图2A）。随后，将悬浮液置于超声水浴中处理1小时（图2B）。
    注意：悬浮液将呈现轻微浑浊。
  5. 按照制造商说明组装小型挤出器，用脂质悬浮液填充一支注射器，并将该注射器与另一支空注射器分别安装于挤出器两侧。将脂质悬浮液在两支注射器之间通过膜重复挤出20–25次，以完成悬浮液的挤出处理（图2C）。
    注意：NLps的尺寸由所用膜的孔径大小决定。
  6. 将制备好的NLps储存于玻璃烧瓶中，置于4 °C保存备用。
    注意：长期储存后，应将NLps在35 kHz超声水浴中再次处理15分钟，以防止复合物形成。

2. 体外 合成mRNA的转录

  1. 按照先前发表的方案制备编码eGFP的mRNA34.
  2. 从质粒中扩增 eGFP 序列，使用 0.7 µM 正向引物（5’-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3’）和反向引物（5’-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA-3’）引物和聚合酶试剂盒进行PCR。
    1. 混合20 µL的商用缓冲溶液，该溶液可改变DNA的熔解行为（材料表），以及20 µL聚合酶试剂盒中的5x混合液。加入7 µL的正向引物和7 µL的反向引物。
    2. 加入25 ng的eGFP质粒和2 µL聚合酶试剂盒中的聚合酶。
      注意：在将聚合酶移液至溶液前，应将其保持在冰上。
    3. 加入无核酸酶的 H2加入 O 至混合物中，定容至 100 µL。
    4. 在热循环仪中按照方案运行PCR循环 表1.
  3. 使用PCR纯化试剂盒纯化编码eGFP的DNA序列。
    1. 因此，将PCR溶液与试剂盒中的500 µL结合缓冲液混合，并用其填充纯化柱。
    2. 以最大速度离心柱子1分钟，弃去滤液。
    3. 向柱中加入750 µL洗涤缓冲液I，以最大速度离心1分钟，弃去滤液。
    4. 重复离心步骤1次，以去除柱式滤器中的缓冲液。
    5. 将柱子转移至一个新的1.5 mL离心管中。
    6. 加入 20 µL 无核酸酶的 H2加入O至柱中，孵育1分钟，然后以最大速度离心1分钟。重复此步骤一次。
    7. 使用分光光度计测定DNA浓度，并于-20 °C保存。
    8. 使用凝胶电泳进行DNA质量分析。将0.5 g琼脂糖加入Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液中，放入微波炉高温加热，直至琼脂糖完全溶解。
    9. 向液态琼脂糖中加入 5 µL 凝胶染色液，将溶液倒入凝胶模具中，等待凝胶完全聚合。
    10. 将200 ng DNA与2 µL 6x上样缓冲液混合，并加水至终体积为12 µL。用移液器将DNA Marker以及DNA样品加入凝胶孔中，在100 V电压下电泳运行1小时。
    11. 使用凝胶成像系统在紫外光下分析凝胶。
  4. 运行 体外 转录以从DNA序列生成mRNA 体外 含有T7聚合酶的转录试剂盒，并将UTP和CTP修饰核苷酸替换为Ψ-UTP和甲基-CTP。
    1. 对于 体外 转录，按以下顺序混合组分 表 2.
      注意：用1:10稀释于无核酸酶水中的Cy3-CTP替换1.5 µL的甲基-CTP2O期间 体外 转录 eGFP mRNA 以实现 mRNA 的 Cy3 标记。
    2. 将体外转录反应体系在 37 °C 下孵育 4 小时。
    3. 加入1 µL T7聚合酶试剂盒中的DNase I，在37 °C孵育15分钟，以消化DNA模板。
  5. 为了纯化mRNA，使用RNA纯化试剂盒。
    1. 用无核酸酶水将体外转录（IVT）混合物补足至100 µL体积2O.
    2. 加入350 µL裂解缓冲液，用移液器吹打混匀。
    3. 加入250 µL 100%乙醇，再次混匀。将混合液用移液器转移至纯化柱中。
    4. 以 8,000 x g 离心 15 秒 g 弃去滤液。
    5. 向柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液，再次在 8,000 x 转速下离心 15 秒 g，并弃去滤液。
    6. 用500 µL洗涤缓冲液洗涤柱子1次，然后在8,000 x g下离心2分钟 g.
    7. 将柱子转移至一个新的1.5 mL反应管中。用20 µL无核酸酶的H2O孵育1分钟，洗脱mRNA，重复洗脱2次。2O 在柱膜上，随后在最大速度下离心1分钟。
  6. 使用去磷酸化试剂盒去除mRNA的磷酸基团。向mRNA中加入4.5 µL 10x磷酸酶缓冲液和1 µL磷酸酶，于37 °C孵育1小时。
  7. 再次按照步骤 2.5.1 - 2.5.7 纯化 mRNA。
  8. 使用分光光度计测量 mRNA 浓度。
  9. 使用凝胶电泳分析 mRNA 的纯度和大小。按照步骤 2.3.9 - 2.3.10 中所述方法制备琼脂糖凝胶。
    1. 将 3.3 µL 甲酰胺、1 µL 37% 甲醛、1 µL 10x MEN、1.7 µL 6x 上样缓冲液与 200 ng mRNA 混合，用无核酸酶的 H₂O 定容至 10 µL2每个样本和RNA标记的O值。
    2. 在65 °C下孵育混合物10分钟以使mRNA变性。将mRNA和RNA标记物加入凝胶孔中，在100 V电压下电泳运行1小时。
    3. 使用紫外光凝胶成像系统分析凝胶。

3. 合成 mRNA 的复合物形成

  1. 将合成mRNA置于冰上解冻，涡旋混匀，并在打开管子前短暂离心。
  2. 取10 µL合成mRNA（mRNA浓度为100 ng/µL）与1 µL、2.5 µL、5 µL、10 µL或20 µL的NLp悬浮液（NLp浓度为3 mg/mL）混合。短暂离心后，在室温（RT）孵育20分钟，以形成纳米脂质复合物。
    注意：不要通过移液混合，以免造成体积损失。应短暂涡旋以充分混匀。
  3. 向纳米脂质复合物中加入1 mL常规细胞培养基，通过上下吹打混匀。

4. 纳米脂质体包封效率的分析

  1. 进行包封实验时，使用RNA定量试剂盒。
  2. 将荧光染料稀释1:200用于高浓度范围检测，或稀释1:2,000用于低浓度范围检测，以制备工作液。
    注意：在冰上解冻荧光染料。工作液需在使用前现配。
  3. 使用1 mL浓度为2 µg/mL的eGFP mRNA无核酸酶H2O储备液制备高浓度和低浓度标准曲线。
    注意：标准曲线应使用即将用于包封实验的mRNA。
  4. 参照表3配制高浓度标准品（20 ng/mL - 1 µg/mL）。
  5. 对于低浓度标准品，将2 µg/mL的eGFP mRNA储备液按1:20稀释，得到终浓度为100 ng/mL的溶液。按照表4所述方法配制低浓度标准品（1 ng/mL - 50 ng/mL）。
  6. 取1 µg eGFP mRNA（10 µL）与7.5 µg NLps（2.5 µL）混合，在室温下孵育20分钟。
    注意：mRNA应始终置于冰上，以防降解。
  7. 加入1 mL无核酸酶H2O以形成纳米脂质复合物，并通过移液器反复吹打混匀。
  8. 向包封样品和标准品中各加入1 mL 1:200或1:2,000的RNA荧光染料工作液，在室温避光条件下孵育5分钟。
  9. 将标准品和样品以复孔形式移取至黑色96孔板中，使用酶标仪在530 nm处测定荧光值（图3）。

5. 转染前细胞的准备

  1. 转染前1天，将1.5 × 105个A549细胞接种至12孔板的每孔中。
  2. 转染前，将细胞在37 °C、5% CO2条件下，用常规细胞培养基（高糖DMEM，含10%胎牛血清[FBS]、2 mM L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素）培养24小时。

6. 细胞转染

  1. 用 1 mL/孔 PBS（不含 Ca2+/Mg2+）将制备好的细胞洗涤 1 次。
  2. 向含 A549 细胞的制备好培养板的某一孔中加入 1 mL 预先配制的纳米脂质复合物混合液，其中包含封装于 1-µL、2.5-µL、5-µL、10-µL 或 20-µL NLps 中的 1 µg eGFP mRNA。
  3. 将纳米脂质复合物悬液加入细胞中，在常规条件下孵育 24 小时以分析转染效率，或孵育 24 小时和 72 小时以分析转染后的细胞活力。
    注意：使用 NLps 进行转染无需更换培养基。

7. 使用流式细胞术和荧光显微镜分析细胞转染效率

  1. 吸去上清液，用 1 mL/孔 PBS（不含 Ca2+/Mg2+）洗涤细胞，以去除残留的 NLps。
  2. 准备细胞用于流式细胞术。
    1. 每孔加入 500 µL 胰蛋白酶/EDTA（0.05%），在 37 °C 下消化 3 分钟。加入等体积（500 µL/孔）含常规 FBS 的培养基以终止反应并灭活胰蛋白酶。
    2. 以 400 × g 离心 5 分钟，小心吸去上清液，避免触碰细胞沉淀。
    3. 用 1 mL PBS（不含 Ca2+/Mg2+）洗涤细胞。
    4. 将细胞重悬于 300 µL 1× 固定液中，并转移至流式细胞仪检测管中。
    5. 在流式细胞仪中于 488 nm 波长下分析细胞（图 4A）。
      注意：检测前将细胞涡旋混匀 1 次。
  3. 准备细胞用于荧光显微镜观察。
    1. 每孔加入 1 mL 预先储存在 -20 °C 的 100% 甲醇固定细胞。
    2. 每孔加入 500 µL 溶于 PBS（不含 Ca2+/Mg2+）的 300 nM DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚），避光孵育 5 分钟。
    3. 吸去 DAPI 溶液，再次用 -20 °C 储存的 100% 甲醇洗涤细胞。
    4. 使用荧光显微镜分析细胞（图 4B）。
      注意：使用以下激发/发射波长：eGFP 为 488/509 nm，DAPI 为 358/461 nm，Cy3 为 550/570 nm。

8. 细胞活力检测

  1. 将5 mg MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）溶解于1 mL RPMI培养基中（不含酚红）。
    注意：使用前需用RPMI将溶解的MTT溶液进一步稀释1:10（终浓度：0.5 mg/mL）。
  2. 用1 mL/孔PBS（不含Ca2+/Mg2+）洗涤转染后的细胞3次。
    注意：应完全去除常规细胞培养基的残留。
  3. 每孔加入500 µL 1:10稀释的MTT溶液，于37 °C孵育4小时。
  4. 孵育结束后移除MTT溶液，每孔加入500 µL DMSO（二甲基亚砜），再次于37 °C孵育10分钟。
  5. 将DMSO溶液以每组三个复孔的方式转移至透明底96孔板中，使用酶标仪在540 nm处测定吸光度。
  6. 将未处理细胞的存活率设为100%，并据此计算其他组相对于未处理对照组细胞的存活率（图5）。

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结果

按照所述方案，采用干膜法制备由DC-胆固醇和DOPE脂质组成的纳米脂质体（NLps）（图1）。在制备过程中，纳米脂质体溶液表现出不同的浊度变化阶段（图2）。

随后可通过RNA定量试剂盒分析未被包封的游离mRNA含量，来评估NLps对1 µg编码eGFP的mRNA的包封效率（图3）。

在将 eGFP mRNA 以不同量封装于 NLps 后，所形成的纳米脂质复合物可与细胞共孵育 体外 转染后24小时，可通过流式细胞术分析表达eGFP的细胞百分比（图 4A）。即使 1 µL 纳米脂质体...

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讨论

本方案描述了高效包封经合成修饰的mRNA的NLps的制备方法，以及细胞的可靠转染。 体外此外，NLps 能确保 mRNA 的释放，随后在细胞内翻译成功能性蛋白质。同时，使用 NLps 进行转染可在常规细胞培养基中进行，转染过程中细胞存活率高，且转染效果可持续至转染后三天。

为了将mRNA用作治疗剂，首选采用可自组装的递送系统。最常见的转染试剂包括阳离子脂质，如脂质体。由于脂质体带正电荷，可将带负电荷的核酸包裹其中，从而克服细胞膜之间的静电排斥作用35。阳离子脂质DC-胆固醇在早期研究中已被描述为一种稳定且生物相容性良好的载体36。添加中性脂质DOPE可提高转染效率37。鉴于上述提到的优点，选择这两种脂质用于NLps的制备。此外，先前的研究表明，与其他脂质相比，使用这两种脂质更具优势，因其可提高带负电荷核酸的细胞转染率38。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基氯化四氮唑 (MTT)AppliChem，德国达姆施塔特A2231
(3β-[N-(N′,N′-二甲基乙二胺)-氨甲酰基]胆固醇盐酸盐 (DC-Cholesterol)Avanti，美国阿拉巴马州700001
4 ′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特D1306
BD FACScan 系统BD Biosciences，德国海德堡
Cell Fix (10x)BD Biosciences，德国海德堡340181
氯仿默克，德国达姆施塔特102445
二甲基亚砜 (DMSO)Serva Electrophoresis GmbH，德国海德堡20385.02
二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE)Avanti，美国阿拉巴马州850725
荧光显微镜蔡司 Axio，德国奥伯科亨
Lipofectamine 2000赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特11668019
小型挤出器Avanti，美国阿拉巴马州
无核酸酶水Qiagen，德国希尔登129114
Opti-Mem赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特11058021
PBS 缓冲液 (不含 Ca2+/Mg2+)赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特70011044
Quant-iT Ribo Green RNA 定量试剂盒赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特Q33140
RPMI (不含酚红)赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特11835030
硅胶Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄P077
胰蛋白酶/EDTA (0.05%)赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特25300054
HotStar HiFidelity 聚合酶试剂盒Qiagen，德国希尔登202602
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen，德国希尔登28104

假尿苷-5'-三磷酸 (Ψ-UTP)		TriLink Biotechnologies，美国圣地亚哥N-1019
5-甲基胞苷-5'-三磷酸 (Methyl-CTP)TriLink Biotechnologies，美国圣地亚哥N-1014
花青素 3-CTPPerkinElmer，德国拜斯韦勒NEL580001EA
RNeasy Mini 试剂盒Qiagen，德国希尔登74104
MEGAscript T7 转录试剂盒赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特AM1333
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 帽结构类似物New England Biolabs，美国伊普斯威奇S1411L
南极磷酸酶New England Biolabs，美国伊普斯威奇M0289S
琼脂糖赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特16500-500
GelRedBiotium，美国弗里蒙特41003
peqGOLD DNA 标准分子量标记混合物VWR，美国宾夕法尼亚州25-2040
Invitrogen 0.5-10 kb RNA 标准分子量标记费舍尔科学，瑞典哥德堡ö
11528766

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