在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外 转录的信使RNA。
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本文内容
摘要
摘要
基于信使RNA（mRNA）的治疗药物因其具有的多种优良特性，在治疗各类疾病方面正变得愈发重要 体外 体外转录（IVT）mRNA。借助IVT mRNA， 从头合成 目标蛋白的合成可在不改变靶细胞生理状态的情况下被诱导。此外，由于体外转录mRNA（IVT mRNA）具有瞬时效应，蛋白质的生物合成可实现精确调控。
为了实现细胞的高效转染，纳米脂质体（NLps）可作为治疗性mRNA安全且高效的递送载体。本研究描述了一种制备安全高效阳离子纳米脂质体的方案，该脂质体由DC-胆固醇和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）组成，可用于体外转录mRNA（IVT mRNA）的递送。通过干膜法制备的NLps具有明确的粒径、均一的分布以及高复合能力。此外，我们介绍了多种检测体系，用于分析NLps与合成增强型绿色荧光蛋白（eGFP）mRNA的复合效率和转染效率，以及其对细胞活力的影响。总体而言，本方案提供了一种高效且安全的mRNA复合方法，有望推动并改善治疗性mRNA的递送应用。
引言
近年来，修饰mRNA在治疗领域的应用展现出巨大潜力。在心血管疾病、炎症性疾病、单基因遗传病以及疫苗开发中，mRNA均是一种具有前景的治疗剂1。
基于mRNA的蛋白质替代疗法相较于传统的基因治疗具有多项优势，后者依赖于将DNA转染至靶细胞2mRNA 的功能直接在细胞质中启动。尽管质粒 DNA（pDNA）是一种包含启动子区域和编码治疗蛋白基因序列的双链环状 DNA 构建体3，也可在细胞质中发挥作用，但只能被整合到转染时正处于有丝分裂阶段的细胞中。这会减少组织中被转染的细胞数量1,4特别是，对于有丝分裂活性较弱的组织（如心肌细胞）进行转染较为困难5与质粒DNA相比，mRNA的转染和翻译可在组织的有丝分裂和非有丝分裂细胞中进行1,6病毒DNA整合到宿主基因组中可能带来致突变效应或引发免疫反应7,8，但在用编码蛋白质的 mRNA 转染细胞后 ....
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方案
1. 阳离子纳米脂质体的制备（图1）
- 将粉末状的DC-胆固醇（3β-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇盐酸盐）和DOPE（二油酰基磷脂酰乙醇胺）溶解于氯仿中，配制成终浓度为25 mg/mL的溶液。
注意：将溶解后的脂质溶液储存于-20 °C。 - 使用浓度为25 mg/mL的两种脂质储备液。取40 µL溶解的DC-胆固醇与80 µL溶解的DOPE混合于玻璃烧瓶中。
注意：总脂质量为3 mg。为避免氯仿快速挥发，在移液过程中应将脂质置于冰上操作。 - 在氩气气流下蒸发氯仿15分钟。随后，将装有硅胶的干燥器抽真空，将敞口的玻璃烧瓶放入其中，并持续抽真空过夜，以确保残留的氯仿完全蒸发，并在烧瓶内壁形成脂质膜。
注意：操作应迅速，并避免不必要的O2接触。 - 用1 mL无核酸酶水重新水合所形成的脂质膜，并涡旋振荡悬浮液15分钟（图2A）。随后，将悬浮液置于超声水浴中处理1小时（图2B）。
注意：悬浮液将呈现轻微浑浊。 - 按照制造商说明组装小型挤出器，用脂质悬浮液填充一支注射器，并将该注射器与另一支空注射器分别安装于挤出器两侧。将脂质悬浮液在两支注射器之间通过膜重复挤出20–25....
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结果
按照所述方案，采用干膜法制备由DC-胆固醇和DOPE脂质组成的纳米脂质体（NLps）（图1）。在制备过程中，纳米脂质体溶液表现出不同的浊度变化阶段（图2）。
随后可通过RNA定量试剂盒分析未被包封的游离mRNA含量，来评估NLps对1 µg编码eGFP的mRNA的包封效率（图3）。
在将 eGFP mRNA 以不同量封装于 NLps 后，所形成的纳米脂质复合物可与细胞共孵育 体外 转染后24小时，可通过流式细胞术分析表达eGFP的细胞百分比（图 4A）。即使 1 µL 纳米脂质体.......
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讨论
本方案描述了高效包封经合成修饰的mRNA的NLps的制备方法，以及细胞的可靠转染。 体外此外，NLps 能确保 mRNA 的释放，随后在细胞内翻译成功能性蛋白质。同时，使用 NLps 进行转染可在常规细胞培养基中进行，转染过程中细胞存活率高，且转染效果可持续至转染后三天。
为了将mRNA用作治疗剂，首选采用可自组装的递送系统。最常见的转染试剂包括阳离子脂质，如脂质体。由于脂质体带正电荷，可将带负电荷的核酸包裹其中，从而克服细胞膜之间的静电排斥作用35。阳离子脂质DC-胆固醇在早期研究中已被描述为一种稳定且生物相容性良好的载体36。添加中性脂质DOPE可提高转染效率37。鉴于上述提到的优点，选择这两种脂质用于NLps的制备。此外，先前的研究表明，与其他脂质相比，使用这两种脂质更具优势，因其可提高带负电荷核酸的细胞转染率38。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基氯化四氮唑 (MTT) | AppliChem，德国达姆施塔特 | A2231 | |
| (3β-[N-(N′,N′-二甲基乙二胺)-氨甲酰基]胆固醇盐酸盐 (DC-Cholesterol) | Avanti，美国阿拉巴马州 | 700001 | |
| 4 ′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | D1306 | |
| BD FACScan 系统 | BD Biosciences，德国海德堡 | ||
| Cell Fix (10x) | BD Biosciences，德国海德堡 | 340181 | |
| 氯仿 | 默克，德国达姆施塔特 | 102445 | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Serva Electrophoresis GmbH，德国海德堡 | 20385.02 | |
| 二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE) | Avanti，美国阿拉巴马州 | 850725 | |
| 荧光显微镜 | 蔡司 Axio，德国奥伯科亨 | ||
| Lipofectamine 2000 | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | 11668019 | |
| 小型挤出器 | Avanti，美国阿拉巴马州 | ||
| 无核酸酶水 | Qiagen，德国希尔登 | 129114 | |
| Opti-Mem | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | 11058021 | |
| PBS 缓冲液 (不含 Ca2+/Mg2+) | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | 70011044 | |
| Quant-iT Ribo Green RNA 定量试剂盒 | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | Q33140 | |
| RPMI (不含酚红) | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | 11835030 | |
| 硅胶 | Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄 | P077 | |
| 胰蛋白酶/EDTA (0.05%) | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | 25300054 | |
| HotStar HiFidelity 聚合酶试剂盒 | Qiagen，德国希尔登 | 202602 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen，德国希尔登 | 28104 | |
假尿苷-5'-三磷酸 (Ψ-UTP) | TriLink Biotechnologies，美国圣地亚哥 | N-1019 | |
| 5-甲基胞苷-5'-三磷酸 (Methyl-CTP) | TriLink Biotechnologies，美国圣地亚哥 | N-1014 | |
| 花青素 3-CTP | PerkinElmer，德国拜斯韦勒 | NEL580001EA | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen，德国希尔登 | 74104 | |
| MEGAscript T7 转录试剂盒 | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | AM1333 | |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA 帽结构类似物 | New England Biolabs，美国伊普斯威奇 | S1411L | |
| 南极磷酸酶 | New England Biolabs，美国伊普斯威奇 | M0289S | |
| 琼脂糖 | 赛默飞世尔科技，德国达姆施塔特 | 16500-500 | |
| GelRed | Biotium，美国弗里蒙特 | 41003 | |
| peqGOLD DNA 标准分子量标记混合物 | VWR，美国宾夕法尼亚州 | 25-2040 | |
| Invitrogen 0.5-10 kb RNA 标准分子量标记 | 费舍尔科学，瑞典哥德堡ö | 11528766 |
参考文献
- Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Yamamoto, A., Kormann, M., Rosenecker, J., Rudolph, C. Current prospoects for mRNA gene delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71 (3), 484-489 (2009).
- Williams, P. D., King....
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重印与许可
