Her beskriver vi en protokoll for immunisering av voksen sebrafisk (Danio rerio) med en DNA-baserte vaksine og demonstrere validering av en vellykket vaksinasjon hendelse. Denne metoden er egnet for prekliniske screening av vaksine kandidater i ulike infeksjon modeller.
Interessen for DNA-baserte vaksinasjon har økt i løpet av de siste to tiårene. DNA vaksinasjon er basert på kloning av et valgt antigen eller en kombinasjon av antigener i en plasmider, som gjør en skreddersydd og trygt design. Administrasjon av DNA vaksiner i verten cellene fører til uttrykk for antigener som stimulerer både humoral og celle-mediert immunreaksjoner. Denne rapporten beskriver en protokoll for kloning av antigen sekvenser i pCMV-EGFP plasmider, immunisering av voksen sebrafisk med vaksine kandidater av intramuscular microinjection og den påfølgende electroporation å forbedre inntak. Vaksine antigener uttrykkes som grønne fluorescerende protein (GFP)-fusion proteiner, hvilke innrømmer bekreftelse av antigen uttrykket under UV-lys fra levende fisk og måling av uttrykk blanding protein med ELISA, så vel som gjenkjenningen med en western blot analyse. Beskyttende effekten av vaksine kandidatene er testet av infisere fisken med Mycobacterium marinum fem uker postvaccination, etterfulgt av kvantifisering av bakterier med qPCR fire uker senere. Sammenlignet med pattedyr prekliniske screening modeller, gir denne metoden en kostnadseffektiv metode for foreløpige screening av ny DNA-baserte vaksine kandidater mot en mycobacterial infeksjon. Metoden kan videre brukes til sortering DNA-baserte vaksiner mot ulike bakterielle og virale sykdommer.
Den første DNA vaksine studier ble utført i 1990-tallet1, og siden da DNA vaksiner er testet mot ulike smittsomme sykdommer, kreft, autoimmunitet og allergi2. I pattedyr, en DNA vaksine mot West Nile virus hos hester og en terapeutisk kreft vaksine for hjørnetann muntlig melanom er lisensiert, men dette er ikke tiden i klinisk bruk2. I tillegg til interessen fremkalt av pattedyr studier, har DNA vaksinasjon vist seg for å være en praktisk måte å vaksinere oppdrettsfisk mot sykdommer. En vaksine mot fisk smittsomme blodkreft nekrose virus (IHNV) har vært i kommersiell bruk siden 2005, og en vaksine mot smittsomme bukspyttkjertelen nekrose virus (IPNV) ble nylig lisensiert3. I tillegg utvikles flere DNA vaksiner mot fisk patogener.
Som tradisjonelle vaksiner ofte inneholder deaktivert eller live dempes patogener, utgjør de en potensiell risiko for overføring av sykdom2. DNA vaksiner, avverge igjen denne risikoen, fordi de er basert på administrasjon av plasmider koding bakterielle eller virale antigener, i stedet for hele patogen selv2,4. DNA vaksiner er produsert med DNA rekombinasjon teknikker, som tillater presis utformingen av vaksine antigener og fleksible utformingen av antigen kombinasjoner og adjuvans i en enkelt vaksine konstruere5. Videre er produksjon av DNA vaksiner raskere, enklere og mer kostnadseffektivt enn protein-basert rekombinant vaksiner, som er en stor fordel for vaksine kandidat screening formål, men også, for eksempel ved pandemi utbrudd 2.
I fisk, den vanligste administrasjon ruter for DNA vaksiner er intraperitoneal, intramuskulær og muntlig3,6,7, mens i pattedyr, subkutan og intradermal ruter er tilleggsalternativer2. Etter en intramuskulær injeksjon, administrated DNA plasmider inn cellene på administrasjonsområdet (f.eks., hovedsakelig myocytter, men også bosatt antigen presentere celler [APCs]). Andelen av transfekterte celler kan økes betraktelig av electroporation2,8. Etter inn cellen, inn noen plasmider DNA kjernen, hvor genene kodet av plasmider er transkribert2. I denne protokollen benytter vi den pCMV-EGFP plasmider som har en sterk allestedsnærværende promoter optimalisert for eukaryote uttrykk9. I denne konstruksjonen er av antigener oversatt som et fusion protein med et GFP. GFP muliggjør bekreftelse av en vellykket vaksinasjon og riktig antigen produktet ved enkel visualisering av antigen uttrykk med fluorescens mikroskop i levende fisk.
I pattedyr, har DNA vaksiner vist å stimulere typer immunreaksjoner avhengig av den transfekterte celle typer2,5. Transfekterte myocytter skiller antigener i ekstracellulære plass eller slipp dem på celledød og antigener omsluttet av APCs, presenteres deretter på store histocompatibility kompleks II molekyler2. Dette utløser CD4 og CD8 T celle svar, spesielt, i tillegg til B-cellen svar2,5,10. I fisk, har T- og B-lymfocytter, samt dendrittiske celler (DCer), blitt identifisert, men deres arbeidsdeling i antigen presentasjon er mindre godt forstått11. Sebrafisk DCs, har imidlertid vist å dele bevarte fenotypiske og funksjonelle egenskaper med deres pattedyr kolleger12. Videre har DNA vaksinasjon vist seg å framprovosere lignende immunreaksjoner i fisk og pattedyr, inkludert T- og B-celle svar6,13,14,15,16 .
Både larvene og voksen sebrafisk er mye brukt til modell ulike infeksjonssykdommer, som fisk M. marinum infeksjon modell av tuberkulose i denne protokollen17,18,19,20 ,21,22. Med pattedyr modell organismer, fordelene ved sebrafisk inkluderer liten størrelse, rask reproduserbarhet og lav boliger utgifter23. Disse aspektene gjør sebrafisk en ideell dyr modell for store prekliniske screening undersøkelser for romanen vaksiner og farmasøytiske forbindelser23,24,25.
I denne protokollen beskriver vi hvordan romanen vaksine antigen kandidater mot mycobacteriosis kan evalueres av DNA-baserte vaksinasjon av voksen sebrafisk. Først beskrive vi hvordan antigener er klonet i pCMV-EGFP uttrykk plasmider, etterfulgt av en detaljert protokoll for intramuskulær injeksjon av vaksine plasmider og den påfølgende electroporation til muskel. Uttrykk for hver antigen er bekreftet av fluorescens mikroskopi ukes postimmunization. Effekten av antigen kandidatene er testet av eksperimentelt infisere vaksinert fisk med M. marinum.
Prosedyren for immunisere voksen sebrafisk med DNA-baserte vaksiner krever noen teknisk ekspertise. Selv for en erfaren forsker tar vaccinating en enkelt fisk ca 3 min, unntatt forberedelser. Dermed kan maksimalt omtrent 100 fisk immunized innen en dag. Hvis mer enn 100 fisk er nødvendig for eksperimentet, kan immunizations deles mellom opp til 3 dager. Kvaliteten på eksperimentet er tilstrekkelig opplæring av researcher(s) for håndtering av fisken og utføre immunisering avgjørende for trivsel for fisken. Sørg for å følge lokale juridiske og dyr velferd regler og retningslinjer når det gjelder boliger fisken, eksperimenter, og kvalifikasjoner som kreves av personellet gjennomføre eksperimenter.
I sammendraget finnes det flere viktige tiltak for å unngå komplikasjoner i immunisering protokollen. For vellykket immunisering, sikre at 1) fisken immunized er friske og tilstrekkelig alder og størrelse (immunisering mer juvenile fisk kan kreve ned skalering vaksine volumet og electroporation innstillingene); 2) fisken er riktig anesthetized uten sterkere enn 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester, og de forblir bedøvet gjennom hele prosedyren (anestesi bør holdes så kort som mulig slik utvinning av fisken); 3) svamp puten er skikkelig gjennomvåt; 4) væske injiseres i hver puls fra pneumatiske pumpen, og hvis ikke, puls lengden justeres (trekke nålen litt bakover langs y-aksen kan hjelpe); 5) det er ingen luftbobler med vaksine løsningen; 6) electroporation innstillingene og faktiske puls spenning og lengden er riktig. 7) elektrodene ikke forårsaker skade huden på webområdet electroporation (under electroporation, holde elektrodene i mild kontakt med fisken, og slippe fisken umiddelbart i utvinning tanken etter electroporation).
Det er viktig å overvåke fisken etter electroporation i utvinning tanken og å avlive noen fisk viser tegn på ubehag. Videre er det nødvendig å praktisere fremgangsmåten før du starter en storskala forsøk, for å sikre en flytende arbeidsflyt. Hvis mulig, spør en tilstrekkelig opplært kollega for hjelp med å fylle nålene og electroporation.
DNA vaksinasjon metoden gjør det mulig for skreddersydd design av vaksine antigener. Det er mulig å klone hele antigen eller, helst, velge deler av antigen basert på mobilnettet lokalisering og immunogenisitet24. I tillegg kan metoden kombinere flere antigener eller adjuvans i én vaksine konstruksjon eller sprøytebruk flere separate plasmider på samme tid2. Inkludert en stopp codon etter antigen rekkefølgen eller excising EGFP genet fra plasmider, er det mulig å benytte samme plasmider vektoren også for å uttrykke antigen uten etterfølgende N-terminal GFP koden. Dette kan være rimelig i bekrefter positive screening resultatene, den relativt store størrelsen på GFP kan påvirke folding av antigen, og dermed begrense humoral svar potensielt fremkalt av vaksinasjon.
Et høyere antigen uttrykk har vært knyttet til DNA vaksine immunogenisitet2. Electroporation etter injeksjon har dermed blitt inkludert i denne protokollen, som det har vist seg å øke uttrykk for antigener eller reporter gener fra firedelte til tidoblet i sebrafisk32. Videre forårsaker electroporation som en teknikk moderat vev skade, dermed indusere lokal betennelse som ytterligere fremmer vaksine-indusert immunreaksjoner2. På den annen side, er electroporation generelt godt tolerert. Med utstyret som brukes her, vil nesten 100% av voksen sebrafisk gjenopprette godt fra på seks pulser av 40 V brukes i denne protokollen35.
I tillegg til electroporation for å styrke oppføringen av vaksine plasmider inn i celler, bruker vi en sterk allestedsnærværende promoter vaksine plasmider og en polyA hale på 3 slutten av antigen for å forbedre antigen uttrykk i transfekterte fisk cellene. I noen tilfeller hvis codon bruken av målet patogen betydelig forskjellig fra vaksinert arter, har codon optimalisering funnet nyttig i økende ytterligere mål gene expression2. I denne sebrafisk –M. marinum modellen, men codon optimalisering hadde ingen signifikant effekt på uttrykk nivåene av to mycobacterial modell gener ESAT-6 og CFP-10, og har dermed blitt ansett unødvendig i denne modellen35 .
Målet genet uttrykket profiler har noen timelige variasjon mellom antigener, avhengig av, for eksempel størrelsen og strukturen i antigener i spørsmålet. Antigen uttrykk er imidlertid vanligvis lignende i en gruppe av fisken vaksineres med samme vaksine. Vanligvis lyse EGFP uttrykket er observert fire dager til ukes postvaccination, men en skala fra 2-10 dager er mulig. Det anbefales å validere uttrykket hver antigen-EGFP fusion protein i en liten gruppe av fisk (2-3) før du inkluderer antigen i en storskala forsøk. Hvis ingen GFP uttrykk er observert på noe punkt 2-10 dager etter immunisering, kontrollerer du at 1) immunisering protokollen ble nøye fulgt. Alltid har en gruppe av fisken vaksineres med Tom pCMV-EGFP-plasmider som en positiv og kontroller at 2) antigen design og molekylære kloning ble utført riktig (tilstrekkelig primer design, antigen og EGFP koden er begge i samme lese ramme og ingen mellomliggende stopp kodon er inkludert). I noen tilfeller tross riktig antigen design, kan GFP ikke oppdages. Dette kan skyldes feil folding eller rask sammenbrudd av fusion protein. Under disse omstendigheter kan det være nødvendig å omstrukturere antigen.
I vaksiner som brukes Immunize oppdrettsfisk, er plasmider dosen brukes vanligvis 1 µg eller mindre7,33,34. I sebrafisk, kan reporter genuttrykk også gjenkjennes etter minst 0,5 µg plasmider injeksjon etter electroporation; genuttrykk relative mål øker imidlertid betydelig med et høyere beløp av plasmider per fisk (supplerende figur 1). I fisk injisert med pCMV-EGFP reporter plasmider, resulterte en injeksjon med 5-20 µg av plasmider i fire til åtte ganger høyere EGFP nivåer med fisk injisert med 0,5 µg. Derfor, for å sikre en høy nok mål genuttrykk, men har injeksjon volumer som er små nok (≤7 µL) å forhindre overflødig vevsskade eller vaksine lekkasje, valgte vi å bruke 5 til 12 µg per fisk for å foreløpig screening. I tillegg til vaksine immunogenisitet, en høy nok mål genuttrykk er nødvendig for å oppdage reporter genuttrykk fluorescens mikroskop og western blot, som er nødvendig for screening formål å bekrefte riktig i vivo oversettelse av målet antigen. Imidlertid lavere plasmider doser (0,5-1 µg) kan være nyttig for andre typer eksperimentelle bruker.
Avslutningsvis kan denne protokollen for immunisering av voksen sebrafisk med en DNA plasmider brukes i preklinisk testing av romanen vaksine kandidater mot ulike bakterielle eller virale infeksjoner. Uttrykket av vaksine antigen som en GFP-fusion protein kan effekten av et vellykket immunisering hendelse og antigen uttrykk. Vi bruker denne metoden for prekliniske screening av romanen vaksine antigen kandidater mot tuberkulose. For dette vi infisere sebrafisk fem uker postvaccination og bestemme bakterielle teller i hver fisk med qPCR20,24.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlig til medlemmer av eksperimentelle immunologi research group, og spesielt til Leena Mäkinen og Hannaleena Piippo, for alt arbeidet de har gjort i å utvikle og optimalisere vaksinasjon protokoll, og deres hjelp i faktiske eksperimenter ved hjelp av protokollen.
Dette arbeidet ble støttet av Jane ja Wen Erkon Säätiö (Jane og Wen Erkko Foundation; til Mr), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Foundation; Mr), konkurransedyktig staten forskning finansiering av ekspert ansvar Tampere University Hospital (til Mr), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tuberkulose Foundation; Mr, HM, og M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (finsk Kulturstiftelse; H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finsk Anti-tuberkulose Foundation; til H.M.), kom ja Laina Kiven säätiö (kom og Laina Kivi Foundation; til M.N.) og Tampere City Science Foundation (til M.N.).
pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
Tweezertrodes Electrodes (7mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
2.8 mmCeramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
2ml Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Microloader 20 µl | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
Parafilm | Bemis | laboratory film | |
Pins | |||
Plastic spoon | |||
Spatula | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench | |||
Tweezers |