Methodenartikel

Impfung von Erwachsenen Zebrafisch für die präklinische Screening von DNA-basierte Impfstoffe

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DOI:

10.3791/58453

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30. Oktober 2018

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1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2MedEngine Oy, 3Department of Pediatrics, Tampere University Hospital, 4Department of Children and Adolescents, Oulu University Hospital, 5PEDEGO Research Unit, Medical Research Center, University of Oulu

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Impfung von der Erwachsenen Zebrabärbling (Danio Rerio) mit einem DNA-basierten Impfstoff und die Validierung einer erfolgreichen Impfung Veranstaltung zu demonstrieren. Diese Methode eignet sich für die präklinische Screening Impfstoffkandidaten in verschiedenen Infektionsmodelle.

Zusammenfassung

Das Interesse an DNA-basierte Impfung hat in den vergangenen zwei Jahrzehnten zugenommen. DNA-Impfung basiert auf das Klonen einer Sequenz von einem ausgewählten Antigen oder eine Kombination von Antigenen in ein Plasmid, das eine maßgeschneiderte und sichere Konstruktion ermöglicht. Die Verabreichung von Impfstoffen DNA in Wirtszellen führt auf den Ausdruck von Antigenen, die humoralen und zellvermittelten Immunantwort stimulieren. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zum Klonen von Antigen-Sequenzen in der pCMV-EGFP-Plasmid, die Impfung von Erwachsenen Zebrafisch mit den Impfstoffkandidaten durch intramuskuläre Mikroinjektion und die anschließende Elektroporation zur Aufnahme zu verbessern. Die Impfstoff-Antigene werden als grün fluoreszierendes Protein (GFP) ausgedrückt-Fusionsproteine, wodurch die Bestätigung des Ausdrucks unter UV-Licht von lebenden Fischen und die Quantifizierung der Ausdruck Niveaus des Fusionsproteins mit ELISA, sowie als Antigen Ihre Erkennung mit einem western-Blot-Analyse. Die schützende Wirkung der Impfstoffkandidaten wird getestet durch infizieren den Fisch mit Mycobacterium Marinum fünf Wochen Postvaccination, gefolgt von der Quantifizierung der Bakterien mit qPCR vier Wochen später. Im Vergleich zu Säugetieren präklinischen Screening-Modelle, bietet diese Methode eine kosteneffektive Methode für die Vorauswahl der neuartigen DNA-basierte Impfstoffkandidaten gegen eine mykobakteriellen Infektion. Die Methode kann weitere screening-DNA-basierte Impfstoffe gegen verschiedene bakterielle und virale Krankheiten.

Einleitung

Die erste DNA-Impfstoff-Studien wurden in den 1990er Jahren1durchgeführt, und seitdem wurden DNA-Impfstoffe gegen verschiedene Infektionskrankheiten, Krebs, Autoimmunität und Allergie2getestet. Bei Säugetieren eine DNA-Impfstoff gegen West-Nil-Virus bei Pferden und einer therapeutischen Krebs-Impfstoff für Hunde oral Melanom zugelassen, aber diese sind derzeit nicht im klinischen Einsatz2. Neben dem Interesse hervorgerufen durch Säugetier-Studien hat DNA-Impfung erwies sich eine komfortable Möglichkeit, Zuchtfisch gegen Viruserkrankungen zu immunisieren. Ein Impfstoff gegen Fisch infektiösen hämatopoetischen Nekrose Virus (IHNV) ist bereits im kommerziellen Einsatz seit 2005, und ein Impfstoff gegen das Virus der infektiösen pankreatischen Nekrosen (IPNV) wurde vor kurzem lizenzierten3. Darüber hinaus werden mehrere DNA-Impfstoffen gegen Fisch Krankheitserreger entwickelt.

Als herkömmliche Impfstoffe oft inaktivierte oder live abgeschwächte Erregern enthalten, stellen sie ein potenzielles Risiko einer Übertragung der Krankheit2. DNA-Impfstoffe abzuwenden wiederum dieses Risiko, da sie auf die Verwaltung des Plasmids Codierung bakterielle oder virale Antigene, anstatt den ganzen Erreger selbst2,4. DNA-Impfstoffe werden mit DNA-Rekombination Techniken, wodurch die genaue Ausgestaltung der Impfstoff Antigene und die flexible Formulierung von Antigen-Kombinationen und Hilfsstoffe in einem einzigen Impfstoff Konstrukt5hergestellt. Darüber hinaus ist die Produktion von DNA-Impfstoffen schneller, einfacher und kostengünstiger als die von Protein-basierten rekombinanten Impfstoffen, das ist ein großer Vorteil für Impfstoffkandidat screening-Zwecken, sondern auch, um beispielsweise bei Pandemie Ausbruch 2.

Bei Fischen die am weitesten verbreiteten Verwaltung Routen für DNA-Impfstoffe sind intraperitoneal, intramuskuläre und mündliche3,6,7, während bei Säugetieren, subkutane und intrakutane Routen sind Zusatzoptionen2. Nach einer intramuskulären Injektion Aldenhoff DNA Plasmide geben Sie die Zellen am Standort Verwaltung (zB., meist Myozyten, sondern auch Wohnsitz Antigen-präsentierenden Zellen [APCs]). Der Anteil von transfizierten Zellen kann durch Elektroporation2,8deutlich erhöht werden. Nach der Eingabe der Zelle, tritt einige Plasmid DNA den Zellkern, wo sind die durch das Plasmid kodiert Gene transkribiert2. In diesem Protokoll nutzen wir die pCMV-EGFP-Plasmid, das einen starken allgegenwärtigen Promotor für eukaryotische Ausdruck9optimiert hat. In diesem Konstrukt werden die Antigene als ein Fusionsprotein mit einem GFP übersetzt. Die GFP ermöglicht die Bestätigung der erfolgreichen Impfung und das richtige Antigen Produkt von der einfachen Visualisierung des Antigen-Ausdruck mit einem Fluoreszenzmikroskop in lebendem Fisch.

Bei Säugetieren wurden DNA-Impfstoffe gezeigt, verschiedene Arten von Immunreaktionen abhängig von transfizierten Zellen Typen2,5zu stimulieren. Transfizierte Myozyten absondern Antigene in den Extrazellulärraum oder lassen Sie sie bei der Zelltod und die Antigene von APCs verschlungen werden, anschließend auf großen Histocompatibility complex II Moleküle2vorgestellt. Dies löst CD4 und CD8 T-Zell-Reaktionen, vor allem, neben der B-Zell-Antworten2,5,10. In Fisch T- und B-Lymphozyten sowie dendritischen Zellen (DCs), wurden noch ihre Arbeitsteilung in Antigenpräsentation weniger gut verstanden11 ist. Zebrafisch DCs haben jedoch gezeigt, konservierte phänotypische und funktionelle Merkmale mit ihrer Säugetier-Pendants12teilen. Darüber hinaus hat DNA-Impfung nachweislich ähnliche Immunantworten in Fischen und Säugetieren, einschließlich des T- und B-Zellen Antworten6,13,14,15,16 entlocken .

Larven und Erwachsene Zebrafisch sind verbreitet, Modell verschiedene Infektionskrankheiten, wie der Fisch M. Marinum Infektionsmodell an Tuberkulose, die in diesem Protokoll17,18,19,20 verwendet ,21,22. Im Vergleich zu Säugetieren Modellorganismen die Vorteile der Zebrafisch sind ihre geringe Größe, schnelle Reproduzierbarkeit und niedrige Kosten23Gehäuse. Diese Aspekte machen den Zebrafisch ideale Tiermodell für umfangreiche präklinische Screening-Studien für neuartige Impfstoffe und Arzneimittel zur Behandlung von23,24,25.

In diesem Protokoll beschreiben wir wie neuartige Impfstoff Antigen Kandidaten gegen Mycobacteriosis durch die DNA-basierte Impfung von Erwachsenen Zebrafisch ausgewertet werden können. Zunächst beschreiben wir, wie Antigene in der pCMV-EGFP Ausdruck Plasmid, gefolgt von ein detailliertes Protokoll für die intramuskuläre Injektion von Impfstoff Plasmide und die anschließende Electroporation in Muskel geklont werden. Der Ausdruck jedes Antigen wird durch Fluoreszenz-Mikroskopie einwöchigen Postimmunization bestätigt. Die Wirksamkeit der Antigen-Kandidaten wird dann von experimentell infizieren geimpften Fisch mit M. Marinumgetestet.

Protokoll

Experimente, darunter Erwachsene Zebrafisch erfordern eine Berechtigung für Tierversuche für die Impfung und die nachfolgenden Studien mit der Infektionsmodell. Alle Methoden und Experimente, die hier beschrieben werden vom Tier Experiment Board von Finnland (ESAVI) genehmigt und durchgeführten Studien sind gemäß EU-Richtlinie 2010/63/EU.

1. Klonen DNA-Impfstoff Antigene

  1. Wählen Sie eine Expressionsplasmid für eukaryotische Ausdruck der Antigene von Interesse unter eine starke, konstitutiven Promoter wie das Cytomegalovirus (CMV) sofortige frühe Promotor optimiert. Um die in Vivo -Überprüfung des Antigen-Ausdrucks zu aktivieren, wählen Sie ein Impfstoff-Plasmid, das einen fluoreszierenden Tag, wie z. B. die pCMV-EGFP Plasmid9 in diesem Protokoll verwendeten kodiert.
  2. Geeignete Web-basierte und bioinformatische Werkzeuge verwenden, um eine potenziell immun-Schutz Antigen-Sequenz (oder mehrere Sequenzen) von ca. 90 – 600 nt (30 – 200 aa)26 wählen aus der DNA-des-Interesse des Erregers, die in verwendet wird die nachfolgende Infektionsmodell.
  3. Verwenden Sie verfügbare Software oder manuell entwerfen Sie Primer, die Antigen-Gene aus dem Genom des Erregers zu verstärken und die Antigen-Sequenzen in die Multiple cloning Site des Plasmids Ausdruck Klonen. Stellen Sie sicher, den richtigen Leseraster zu bewahren, wenn das Antigen auswählen.
  4. Gehören Sie eine Kozak-Sequenz (CCACC)-27 und ein Start-Codon (ATG) in der 5'-Primer. Um das C-terminale EGFP-Tag zu erhalten, vermeiden Sie dazwischen liegenden Stopp-Codons (Anhänger, TAA, TGA) in der Antigen-Sequenz und der 3'-Primer. Stellen Sie außerdem sicher, dass das GFP-Tag im gleichen Leseraster mit dem Antigen des Interesses bleibt.
  5. Verwenden Sie RNA oder DNA extrahiert aus der Erreger als Vorlage, um eine ausreichende Menge des PCR-Produkt mit dem Klonen Primer zu generieren. Verwenden Sie vorzugsweise, eine Korrekturlesen DNA-Polymerase, um die richtige Antigen-Sequenz zu erhalten.
  6. Reinigen Sie das PCR-Produkt zu und überprüfen Sie die richtige Größe des Produkts durch Gelelektrophorese. Verdauen Sie und verbinden Sie das PCR-Produkt mit dem Plasmid verdaut Impfstoff.
  7. Verwandeln Sie die Ligatur-Mischung in kompetente Bakterienzellen nach einem geeigneten Protokoll. Verwenden Sie die Wahl ein geeigneten Antibiotika für positive Kolonien und Plasmid-Produktion in E. Coli; Das pCMV-EGFP-Plasmid enthält beispielsweise eine Ampicillin-Resistenz-Gen für diesen.
  8. Verwenden Sie Sanger Sequenzierung, die Einfügung der richtige Antigen-Sequenz zu bestätigen. Die folgenden Primer eignet sich für Sequenzierung Antigene in der pCMV-EGFP-Plasmid: CMV vorwärts 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 "und reverse EGFP-N 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3".
  9. Produzieren und eine ausreichende Menge des Impfstoff-Konstrukts zu reinigen. Auflösen oder das Plasmid in sterilem Wasser eluieren. Stellen Sie sicher, dass die produzierten Plasmid-DNA von hoher Qualität ist und die Konzentration mindestens 0,72 µM oder 2.000 ng/µL.

2. ziehen die Mikroinjektion Nadeln

  1. Mikroinjektion Nadeln im Voraus vorzubereiten. Verwenden Sie 10 cm Aluminosilikat Glaskapillaren. Beachten Sie, dass Borosilikatglas Kapillaren zum Einspritzen von ausgewachsenen Fischen zu spröde sind.
  2. Ziehen Sie die Nadeln mit einer Mikropipette-Nadel-Herstellung.
    Hinweis: Die Nadeln sollte ähnlich dem in Abbildung 1dargestellt aussehen. Mit dem Gerät in diesem Protokoll (Table of Materials) verwendet ergeben sich die folgenden Einstellungen in der gewünschten Art der Nadeln:
    1. Das Glas Kapillare in der V-Nut in der Puller-Bar und ziehen Sie klemmenden Knopf leicht an.
    2. Bewegen Sie den Halter neben dem Filament und schieben Sie vorsichtig die Kapillare durch das Filament in der Puller-Bar auf der anderen Seite des Fadens. Berühren Sie den Faden mit der Kapillare.
    3. Ziehen Sie die Klemmschraube Knöpfe, Sicherheitsglas festgelegt, und drücken Sie die Schaltfläche "ziehen".
      Vorsicht: Das Filament ist heiß.
  3. Legen Sie die Nadeln auf ein Stück wiederverwendbare Kleber in einer Petrischale 15 cm Platte, die Nadelspitzen zu schützen. Halten Sie die Schüssel abgedeckt, um die Nadeln sauber zu halten.

3. füllen die Mikropipette Nadeln

  1. Bereiten Sie den Impfstoff-Mix. 0,5 bis 12 µg Plasmids pro Dosis zu verwenden. Wenn mehrere unterschiedliche Plasmide in eine Impfung Mix kombinieren, verwenden Sie eine maximale DNA-Gesamtkonzentration von 12 µg pro Fisch.
  2. Berechnen Sie das Volumen des Impfstoffes "master-Mix" nach der Anzahl der Fische in den einzelnen Gruppen (siehe unten). 1 µl Phenol rot steril filtriert hinzu kommt jeder Injektion Dosis, sowohl die Füllung der Kapillaren Nadeln und die Beobachtung der Injektion zu erleichtern. Fügen Sie steril 1 x PBS bis zu einem maximalen Gesamtvolumen von 5 – 7 µl in eine Injektion Dosis8.
    Hinweis: Einspritzmengen höher als 7 µL können dazu führen, dass das gelegentliche Austreten von der Injektionslösung und sollte daher vermieden werden.
  3. Legen Sie ein Stück Klebeband, Kleber Seite nach oben, auf eine geeignete Halter, zum Beispiel die Seite eines leeren Tipp-Box. Legen Sie sanft die Kapillaren Nadeln auf das Band.
  4. Pipettieren maximal 7 µL des Impfstoff-Mix auf ein Stück Labor Film. Mit einer laden-Spitze, den Impfstoff aus dem Film in die Nadel übertragen. Pipettieren langsam und vorsichtig, Pipettieren Luftblasen in die Nadel vermeiden.
  5. Lassen Sie die Nadeln für 15-30 min möglich verbleibende kleine Luftblasen entfernen zu begleichen.

4. Einstellen von Microinjector und Electroporator für die Immunisierung

  1. Der Mikromanipulator und eine Lichtquelle in die richtige Position gesetzt. Wechseln Sie die Luft Druckmessstutzen in die offene Position.
  2. Passen Sie die Parameter für die pneumatische Pumpe wie folgt (siehe auch Abbildung 2).
    1. Rändelknopf Vent auf dem Eject Anschluss halten , Verfüllung der Pipette durch Kapillarwirkung zu verhindern. Die Mikropipette Schläuche vom Hafen auswerfen soll. Verwenden Sie den Vakuum-Anschluss in diesem Protokoll nicht.
    2. Stellen Sie die Pulslänge: Verwenden der zeitgesteuerten Modus, wo eine elektronische Zeitschaltuhr steuert die Dauer der Zeit der Druck-Magnet geöffnet bleibt. Kontrollieren Sie die grüne Lampe neben dem Eject-Manometer leuchtet auf, wenn der Druck-Magnet ist (erregt) öffnen.
    3. Legen Sie den Puls- Bereich bis 10 s; mit dieser Einstellung die Impulse können weitere eingestellt werden von 100 ms 10.1 S. Verwendung der 10-Turn Zeitraum wählen , für die Feinabstimmung der Pulslänge — jeder Ecke des Zifferblattes ist 1,0 s. Falls erforderlich, kann dies auch während einer Injektion eingestellt werden.
    4. Verwenden Sie die Puls-Initiator ("start-Taste") auf der Vorderseite die pneumatische Pumpe oder eine remote Fußschalter (empfohlen). Dieses ist an der Vorderseite der pneumatischen Pumpe angeschlossen.
  3. Legen Sie die Nadel auf den Mikropipette Halter von dem Mikromanipulator. Schneiden Sie die Spitze der Nadel mit einer Pinzette, so dass Flüssigkeit herausgedrückt werden kann, und das Mikroskop verwenden, um die richtige Position anzuzeigen. Drücken Sie den Fußschalter einmal um zu sehen, dass ein 1-s-Impuls ein kleines Tröpfchen aus der Nadel schiebt.
  4. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die Electroporator: Spannung = 40 V; Impuls Länge = 50 ms, Impulsanzahl = 6. Schließen Sie die Pinzette an der Electroporator. Sehen Sie, dass die tatsächliche Spannung und Impulslänge auf dem Monitor gezeigt nicht wesentlich von den Einstellungen unterscheiden.

5. Injektion von DNA-Impfstoff und Elektroporation

  1. Für Impfungen nach diesem Protokoll, Einsatz gesund, 6 bis 12 Monate alten Erwachsenen Zebrafisch. Halten Sie den Fisch in einem Durchfluss-System mit einem 14/10 h-hell/dunkel-Zyklus mit einem Maximum von sieben Fische pro 1 L Wasser.
  2. Bereiten Sie eine 0,02 % 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (Tricaine) Lösung (pH 7) im Wassertank für betäuben der Fische28. Verwenden einer 10 cm Petrischale oder etwas ähnliches.
  3. Bereiten Sie einen Schmutzwassertank 5 L Becher mit 3 L "sauberes" System Wasser füllen.
  4. Bereiten Sie eine Impfung Polsterung um die Fische in einer festen Position bei der Impfung zu halten. Nehmen Sie ein 5 x 7 cm2 Stück eines 2 bis 3 cm dicken Schwamm. Schneiden Sie eine Furche in den Schwamm mit einer Skalpellklinge oder einer scharfen Sie Schere.
    Hinweis: Die gleichen Impfung Polsterung kann in mehreren Experimenten verwendet werden. Desinfizieren Sie den Schwamm zwischen den Experimenten durch Einweichen in 70 % Weingeist und trocknen lassen.
  5. Weichen Sie den Schwamm in das System Wasser und legen Sie den Schwamm auf eine Petrischale gründlich.
  6. Schnell die Fische 24 h vor der Impfungen.
  7. Ein Zebrafisch zu betäuben, indem sie auf eine Petrischale mit 0,02 % Tricaine. Warten Sie, bis die Fische nicht reagiert, um die Stimulation zu berühren und es keine Bewegung der Kiemen gibt. Einen einzelnen Fisch zu einem Zeitpunkt zu betäuben.
  8. Mit einem Plastiklöffel, übertragen den narkotisierten Zebrafisch auf den nassen Schwamm und setzte den Fisch Bauchseite in die Nut. Sicherzustellen Sie in der richtigen Position, dass der Kopf und der Körper des Fisches in der Nut und der Rückenflosse und der Schweif sind aus der Nut herausragen.
  9. Unter dem Mikroskop legen Sie vorsichtig die Nadel in einem ca. 45° Winkel in der Nähe der Zebrabärbling Rückenmuskel, mithilfe der x- und y-Achse Feinabstimmung Räder auf dem Mikromanipulator.
  10. Finde die kleine Stelle ohne Schuppen vor der Rückenflosse, wo die Nadel schieben nicht Kraft verlangt. Wenn Widerstand spürbar ist, versuchen Sie einen angrenzenden Ort. Nicht zu verletzen, die Wirbelsäule, die Rückenflosse oder die Waage.
    Hinweis: Wenn die Nadel beim Druck gebeugt wird, verkürzen Sie die Nadel leicht durch Schneiden.
  11. Verwenden Sie den Fußschalter, um allmählich die Impfstoff-Lösung in den Muskel injizieren. Die Injektion durch das Mikroskop zu beobachten: Phenol rot ist sichtbar, wie es das Muskelgewebe betritt. Stellen Sie die Dauer des Pulses.
    Hinweis: Alternativ verwenden Sie die Pulse-Initiator-Taste auf der Frontplatte der pneumatischen Pumpe für die Injektion. Jedoch ermöglicht die Verwendung von remote Fußschalter mit der anderen Hand für die Impulsdauer durch das Rad 10-Drehknopf einstellen. Vermeiden Sie Injektion der Lösung zu schnell, da das übermäßige Gewebeschäden verursachen. Achten Sie darauf, dass keine Luft zu injizieren.
  12. Electroporate die Fische sofort nach der Injektion. Stellen Sie sicher, dass die Fische noch in Narkose. Halten Sie den Fisch auf den Schwamm und stellen Sie die Fische zwischen Pinzette-Art Elektroden, so ein, dass die Elektroden sich auf jeder Seite der Injektionsstelle befinden. Drücken Sie die Elektrode Pinzette nicht zu eng, aber halten Sie beide Elektroden in Kontakt mit dem Fisch.
    1. Drücken Sie die Schaltfläche "Start" auf der Electroporator, sechs 40 V, 50 ms Impulse zu geben.
    2. Übertragen Sie der Fisch sanft auf der Schmutzwassertank.
    3. Reinigen Sie die Elektroden nach jedem Elektroporation durch Wischen sie mit 70 % Ethanol.
      Hinweis: Überwachen Sie sorgfältig, das Wohlbefinden der Fische nach der Impfung. Keine Anzeichen von Unbehagen Fische einzuschläfern (eine langsame Erholung von Anästhesie, aberrante schwimmen, keuchend) in 0,04 % Tricaine. Nach seiner Genesung die Fische auf die Durchfluss-Einheit übertragen und normal zu ernähren.

(6) Visualisierung und Darstellung der Antigen-Expression

  1. Betäuben Sie Fische in 0.02 % Tricaine 2 – 7 Tage nach der Immunisierung zu, und verwenden Sie eine UV-Licht EGFP Ausdruck in der Nähe der Injektionsstelle zu sehen.
    Hinweis: Sichtprüfung unter UV-Licht ist eine einfache und nicht-invasive Operation, die für die routinemäßige Überprüfung der erfolgreichen Impfungen, auch in großen Experimente geeignet ist. Wenn keine Bilder der Fische erforderlich sind, kann dieser Schritt auch in normalen Aquarien ohne zu betäuben oder verschieben Sie die Fische müssen durchgeführt werden.
  2. Um Bilder zu erfassen, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop EGFP Ausdruck bei der Injektion Seite8zu visualisieren. Verwenden Sie einen 2 X Objektiv und wählen Sie den richtigen Filter, Fluoreszenz oder sichtbare Licht Ansichten zu visualisieren.
  3. Halten Sie die betäubten Fische noch durch Drücken der ventralen Flosse vorsichtig mit einer Pinzette unteren eine Petrischale. Nehmen Sie Licht-Mikroskop und Fluoreszenz-Bilder von der gleichen Gegend.
  4. Zusammenführen Sie die Licht-Mikroskop und Fluoreszenz Bilder mit der entsprechenden Software29. Eine Maßstabsleiste hinzufügen.

(7) Quantifizierung des Ausdrucks und Größe der Antigene

  1. Die Fische in 0,04 % Tricaine einschläfern. Die fluoreszierende Bestandteil der Rückenmuskel mit Skalpell und Pinzette unter UV-Licht zu sezieren. Extrahieren Sie Proteine von den Proben-8.
  2. Überprüfen Sie die korrekte Größe der in Vivo-produzierten Proteine mit einer western-Blot-Analyse, mit einer Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten GFP-Antikörper (oder ähnlich)8. Unter anderem eine Negativkontrolle (geimpfte Fisch) um alle Hintergrund-Signale und unspezifische Bindung, zusammen mit einer Steuerung mit dem Ausdruck EGFP auszuschließen ohne eine geschmolzene Antigen.
    Hinweis: Für die western-Blot-Analyse kann der erwarteten Größe des Antigen-Fusionsproteinen (in kDa), z. B. mit folgender Gleichung berechnet werden:
    Molekulargewicht (MW) der DsDNA = (Anzahl der Nukleotide x 607.4) + 157.9; oder mithilfe von Web-basierten Tools.
  3. Quantifizieren des Ausdrucks jedes Antigen mit einem GLP-ELISA-8 (optional).

(8) kombiniert die Impfung-Protokoll mit einem M. Marinum Infektionsmodell

  1. Bestimmen die Größe der Gruppe, die erforderlich für die zuverlässige Bestimmung der Wirksamkeit eines neuartigen Impfstoff Kandidaten in das Infektionsmodell und der Assay verwendet (siehe z. B. Myllymaki Et Al. 24 und Charan und Kantharia30). Die entsprechende Leistung Berechnungen bei der Planung der Experimente durchführen.
  2. Zur Bewertung der Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten infizieren Sie Fisch 5 Wochen Postimmunization. Verwenden Sie eine intraperitoneale Infektion mit ca. 30 Koloniebildenden Einheiten (KBE) von M. Marinum, das führt zu einer latenten Infektion in den meisten8,20,31 Fischen.
    Hinweis: Bei der Verwendung von M. MarinumFolgen einer BSL2-Safety-Protokoll. Die Vorbereitung des Bakterium oder Virus richtet sich nach dem Erreger.
  3. Die Anzahl von Krankheitserregern in jeder Fisch zu quantifizieren. Einschläfern Sie Fisch 4 Wochen Postinfection und bestimmen Sie die bakterielle Belastung in jeder Fisch aus der extrahierten DNA mit qPCR mit Primer speziell für M. Marinum20,24.
    Hinweis: Achten Sie darauf, gehören einer geeigneten Kontrollgruppe und verwenden Sie die richtige statistische Methoden zur Analyse der Resultate. Im Allgemeinen ist eine Gruppe von Fischen mit dem leeren pCMV-EGFP-Plasmid immunisiert geeignet Negativkontrolle.
  4. Bestätigen Sie positive Ergebnisse mit Antigenen ohne das GFP-Tag. Klonen Sie die Antigene zu, wie in Schritt 1 beschrieben und wiederholen Sie den Versuch der Impfung.

Ergebnisse

Die Schritte bei der DNA-Impfung Protokoll der Erwachsenen Zebrafisch sind in Abbildung 3dargestellt. Auf den ersten die ausgewählten Antigen-Sequenzen sind in ein pCMV-EGFP-Plasmid kloniert und Plasmid-DNA entsteht und gereinigt24 (Abbildung 3). Impfstoff-Kandidaten werden dann mit einem Microinjector intramuskulär injiziert und die Injektionsstelle ist elektroporiert, die Einnahme des Plasmids in Zellen (Abbildung 3) zu verbessern. Die verwendete Impfung-Dosis wurde optimiert, durch Injektion unterschiedliche Mengen an pCMV-EGFP-Plasmid und Messung des GFP-Ausdrucks mit ELISA (ergänzende Abbildung 1). Zwei bis sieben Tagen Postvaccination, der Ausdruck des Fusionsproteins unter UV-Licht erfasst und visualisiert mit Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 3 und Abbildung 4). Der Ausdruck Niveaus von verschiedenen Antigenen variieren von sehr intensiven (Antigen-1) zu einem schwachen Ausdruck (Abbildung 4). Darüber hinaus kann GFP Expression beobachtet werden, über die Rückenmuskel (Antigen-1) oder in einem begrenzteren Bereich (Antigen 2) (Abbildung 4). Jedoch innerhalb von 10 Tagen keine Fluoreszenz erkannt wird, sollten darauf achten, dass es keine Fehler in Antigen Klonen oder Primer Design gibt. Um zu bestätigen, dass die ausdrückliche Fusionsproteins der richtigen Größe, können für eine western-Blot-Analyse Proteine aus dem Muskelgewebe um die Injektionsstelle herum extrahiert und verwendet werden.

Die Wirkung der Impfstoffkandidaten wird bewertet durch die Herausforderung der Fisch mit einer niedrigen Dosis von M. Marinum durch eine intraperitoneale Injektion (Abbildung 5). Vier bis fünf Wochen Postinfection, bakterielle Grafen sind entschlossen mit qPCR und im Vergleich zu bakteriellen Lasten in der Kontrollgruppe (Abbildung 5). Darüber hinaus kann die Wirksamkeit der aussichtsreichsten Impfstoffkandidaten getestet werden, durch die Überwachung des Überlebens nach einer hohen Dosis M. Marinum Infektion()Abbildung 5). Jedoch zusätzlich zum geben eines quantitativen Ergebnis auf das Fortschreiten der Infektion, anstatt nur einen Status der lebend oder tot, qPCR-basierte KBE Quantifizierung erfordert weniger Zeit und kleineren Gruppe Größen und ist daher ein ethischer Ansatz für eine primäre Bildschirm. Insgesamt ermöglicht dieses Protokoll das Screening der Wirksamkeit der neuartigen Impfstoff Antigene innerhalb von 12 Wochen (Abbildung 5).

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Abbildung 1: Nahaufnahme (12 X) von Silikat-Nadeln in die Erwachsenen Zebrafisch Intra muskuläre Injektionen verwendet. Die Spitze unten wurde mit einer Pinzette geschnitten und ist bereit, für Mikroinjektionen verwendet werden. Diese Zahl wurde von Oksanen35angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 2: Microinjection Ausrüstung und Set-up. Die wichtigsten Komponenten der Ausrüstung für die DNA-Impfung von Erwachsenen Zebrafisch sind fett hervorgehoben. Die kritische Einstellungen werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3: Vorbereitung der DNA-Impfstoff Plasmide und Immunisierung Verfahren. (1) ausgewählte Antigene sind angrenzend an das GFP-Tag in das Plasmid pCMV-EGFP geklont. (2) der Impfstoff Konstrukt ist mikrobiologisch produzierte, konzentriert und gereinigt. (3) 12 µg des Plasmids in den dorsalen Muskel von einem narkotisierten Erwachsenen Zebrafisch mit einem Microinjector injiziert, und die Injektionsstelle ist anschließend elektroporiert mit sechs 40-V, 50-ms Impulsen. (4) zwei bis sieben Tagen Postvaccination, GFP Expression des Fusionsproteins Antigen-GFP wird mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. (5) die fluoreszierenden Bestandteil der Rückenmuskel kann seziert und für Protein-Extraktion verwendet werden. Die Größe des Fusionsproteins wird mit einem western-Blot-Analyse und die Expression mit GFP-ELISA bestätigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 4: Visualisierung des Ausdrucks des Antigen-EGFP Fusionsproteins. Narkotisierten Erwachsenen Zebrafisch sind mit 12 µg experimentellen Impfstoff Antigene (Antigen 1 – 3) geimpft und die Injektionsstelle ist elektroporiert, anschließend mit sechs 40 V, 50 ms Impulse. Zwei bis sieben Tagen Postvaccination, die Einstichstelle wird mit einem Mikroskop abgebildet. Erstens ist der Ausdruck der GFP unter dem Fluoreszenzmikroskop erkannt. Der Bereich wird geprüft, mit einer 2 X Größe Ziel und abgebildet und in Form von TIFF gespeichert. Das Lichtmikroskop Bild des gleichen Gebietes ist mit dem Fluoreszenzbild mit ImageJ-Software zusammengeführt. Die Menge und die Position des Ausdrucks Antigen variieren zwischen Antigenen und einzelne Fische. Zum Beispiel der Ausdruck des Antigens 1 wird über die Rückenmuskel beobachtet und der Ausdruck des Antigens 2 gilt als kleine Flecken, während Antigen 3 in einem begrenzteren Bereich stark zum Ausdruck kommt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 5: Prüfung der Wirksamkeit des Impfstoffkandidaten gegen eine mykobakteriellen Infektion. (1) Erwachsene Zebrafisch sind mit experimentellen DNA-Impfstoffen gegen Mycobacteriosis geimpft. (2) fünf Wochen Postvaccination, die Fische mit einer niedrigen Dosis von Mycobacterium Marinum (~ 30 KBE) infiziert sind. (3), vier Wochen später, die inneren Organe sind zerlegt und für die DNA-Extraktion verwendet. (4) die Keimzahl in jeder Fisch wird mit qPCR mit M. Marinumquantifiziert-spezifische Primer. Immunisierung mit Antigen 1 führte zu einem deutlichen Rückgang der bakteriellen zählt (p < 0,01, zwei-Wege-ANOVA), während Antigene 2 und 3 hatte keine Wirkung. (5) die schützende Wirkung der aussichtsreichsten Impfstoffkandidaten (Antigen-1) wird in einem Experiment überleben weiter ausgewertet, wo Fisch mit einer hohen Dosis (~ 10.000 KBE) von Bakterien infiziert sind, und ihr Überleben ist für 12 Wochen überwacht. In Übereinstimmung mit der Abnahme in die bakterielle Belastung im Panel 4, Impfung mit Antigen 1 verbessert auch das Überleben der Fische bei Infektionsverdacht M. Marinum beobachtet (p < 0,01), schlägt dieses Antigen könnte eine vielversprechende Kandidat für einen neuartigen Impfstoff gegen Tuberkulose. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Ergänzende Abbildung1: Plasmid DNA beeinflusst Plasmid abgeleitet EGFP Ausdruck im Erwachsenen Zebrafisch. Gruppen von Fischen (n = 5 in jeder Gruppe) wurden mit 0,5-20 μg des pCMV-EGFP injiziert und Elektroporation (sechs Impulse von 50 V) wurde verwendet, um die Transfektion zu verbessern. Kontrolle Fisch (CTRL) wurden mit 2 μg des leeren pCMV Plasmids, enthält nicht das Gen EGFP injiziert. GFP-ELISA war durchgeführten 3 Tage Kontrollbesuche den relativen EGFP Ausdruck im Fisch Homogenates definieren. P-Werte: *p < 0,03, **p < 0,004. Die Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen. NS = nicht signifikante. Diese Zahl wurde von Oksanen35angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Das Verfahren der Immunisierung von Erwachsenen Zebrafisch mit DNA-basierte Impfstoffe erfordert einige technische Expertise. Auch für ein erfahrener Forscher dauert Impfung einen einzigen Fisch ca. 3 min, ausgenommen Vorbereitungen. So kann ein Maximum von ungefähr 100 Fische innerhalb eines Tages geimpft werden. Wenn mehr als 100 Fische für das Experiment benötigt werden, können die Impfungen zwischen bis zu 3 Tage aufgeteilt werden. Neben der Qualität des Experiments ist ausreichendes Training des Researcher(s) für die Handhabung der Fische und Durchführung der Immunisierung wesentlich für das Wohlbefinden der Fische. Achten Sie darauf, lokale rechtliche und Tierschutz Regeln und Richtlinien folgen, wenn es kommt auf die Fische, Planung der Experimente und die Voraussetzungen, die für das Personal, die Durchführung der Experimente.

Zusammenfassend lässt sich sagen gibt es mehrere wichtige Schritte zu Komplikationen in der Immunisierung Protokoll zu vermeiden. Für die erfolgreiche Immunisierung zu gewährleisten, dass 1) die Fische geimpft werden sind gesunde und ausreichende in Alter und Größe (die Impfung mehr Jungfische kann erfordern Verkleinerung der Impfstoff-Volumen und die Elektroporation-Einstellungen); 2) die Fische werden ohne richtig betäubt stärker als 0,02 % 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester, und sie bleiben während des gesamten Verfahrens narkotisierten (Narkose sollte so kurz wie möglich für die Wiederherstellung des Fisches); 3) die Schwamm-Pad ist richtig durchnässt; 4) Flüssigkeit in jedem Impuls von der pneumatischen Pumpe injiziert wird, und wenn nicht, wird die Pulslänge angepasst (zieht die Nadel leicht nach hinten entlang der y-Achse kann helfen); 5) gibt es keine Luftblasen mit dem Impfstoff-Lösung; 6) die Elektroporation-Einstellungen und die tatsächliche Impulsspannung und Länge sind richtig; 7) der Elektroden verursachen keine Hautschäden auf dem Gelände der Elektroporation (während die Elektroporation, halten Sie die Elektroden in sanften Kontakt mit dem Fisch, und lassen Sie den Fisch sofort in den Schmutzwassertank nach Elektroporation).

Es ist wichtig, die Fische nach der Elektroporation in den Schmutzwassertank überwachen und keine Anzeichen von Unbehagen Fische einzuschläfern. Darüber hinaus ist es notwendig, das Verfahren zu üben, bevor Sie beginnen einen Großversuch, um einen fließenden Arbeitsablauf zu gewährleisten. Wenn möglich, bitten Sie einen ausreichend ausgebildeten Kollegen für die Unterstützung bei der Besetzung von den Nadeln und die Elektroporation.

Die DNA-Impfung-Methode ermöglicht die maßgeschneiderte Gestaltung der Impfstoff Antigene. Es ist möglich, das ganze Antigen zu klonen oder vorzugsweise wählen Teile des Antigens basierend auf zelluläre Lokalisation und Immunogenität24. Darüber hinaus ermöglicht die Methode kombinieren mehrere Antigene oder Hilfsstoffe in einem Impfstoff Konstrukt oder mehrere separate Plasmide in der gleichen Zeit2injiziert. Darunter ein Stopcodon nach der Antigen-Sequenz oder das EGFP-gen aus dem Plasmid besteuert ist es möglich, die gleichen Plasmid Vector auch auszudrücken, das Antigen ohne anschließende N-terminale GFP-Tag zu nutzen. Dies kann bei der Bestätigung der positiven Ergebnisse, wie die relativ große Größe der GLP kann beeinflussen die Faltung des Antigens und somit humorale Reaktionen möglicherweise hervorgerufen durch die Impfung beschränken sinnvoll sein.

Eine höhere Antigen-Expression wurde auf DNA-Impfstoff Immunogenität2verbunden. Elektroporation nach Injektion hat, so in diesem Protokoll aufgenommen worden, da sich gezeigt hat, um den Ausdruck von Antigenen oder Reporter-Gene aus um das Vierfache erhöhen im Zebrafisch32zu verzehnfachen. Darüber hinaus führt die Elektroporation als Technik moderate Gewebeverletzungen und veranlassten lokalen Entzündung, der den Impfstoff induzierte Immunantwort2weiter fördert. Auf der anderen Seite ist die Elektroporation allgemein gut verträglich. Mit der Ausrüstung, die hier verwendet wird praktisch 100 % der Erwachsenen Zebrafisch aus sechs Impulsen der 40 V verwendet in diesem Protokoll35gut erholen.

Neben Elektroporation, um den Eintrag des Impfstoff-Plasmids in die Zellen zu verbessern, verwenden wir einen starken allgegenwärtigen Promotor in der Impfstoff-Plasmid und eine PolyA Tail am 3'-Ende des Antigens, um Antigen-Expression in den transfizierten Fisch-Zellen zu verbessern. In einigen Fällen Codon Usage des Ziel-Erregers unterscheidet sich wesentlich von den geimpften Arten wurde Codon Optimierung nützlich bei der weiteren Erhöhung Target gen Ausdruck2gefunden. In diesem Zebrafisch -M. Marinum Modell jedoch Codon Optimierung hatte keinen signifikanten Einfluss auf den Ausdruck Ebenen zweier mykobakteriellen Modell Gene, ESAT-6 und GFP-10, und, so wurde als unnötig in diesem Modell35 .

Gen Ausdruck Zielprofilen haben einige zeitliche Variation zwischen der Antigene, abhängig, zum Beispiel die Größe und die Struktur der Antigene in Frage. Antigen-Ausdruck ist jedoch in der Regel ähnliche innerhalb einer Gruppe von Fischen mit dem gleichen Impfstoff immunisiert. In der Regel die hellsten EGFP Ausdruck wird vier Tage zu einer Woche Postvaccination beobachtet, aber eine Skala von 2 – 10 Tage ist möglich. Es wird empfohlen, den Ausdruck jedes Antigen-EGFP-Fusionsprotein in einer kleinen Gruppe von Fischen (2 – 3) vor Aufnahme des Antigens in einem Großversuch zu validieren. Wenn keine GFP Expression an jedem beliebigen Punkt 2 – 10 Tage nach der Impfung beobachtet wird, stellen Sie sicher, dass 1) die Immunisierung-Protokoll wurde sorgfältig befolgt. Immer eine Gruppe von Fischen mit dem leeren pCMV-EGFP-Plasmid als Positivkontrolle immunisiert und stellen sicher, dass 2) der Antigen-Design und molekularen Klonen wurde korrekt durchgeführt (angemessene besser gekleideteres Design; das Antigen und EGFP Tag sind beide in der gleichen Leseraster sind keine eingreifenden Stop-Codons im Preis inbegriffen). In einigen Fällen, trotz der richtigen Antigen-Design kann GFP erkannt werden. Dies ist möglicherweise aufgrund der fehlerhaften Faltung oder schnellen Zusammenbruch des Fusionsproteins. Unter diesen Umständen ist die Neugestaltung des Antigens erforderlich.

In Impfstoffen, die verwendet werden, um Zuchtfisch zu immunisieren, ist die verwendete Plasmid-Dosis in der Regel 1 µg oder weniger7,33,34. Im Zebrafisch kann auch Reporter-gen-Expression nach mindestens einer 0,5 µg Plasmid Injektion nach Electroporation nachgewiesen werden; Allerdings erhöht sich die relative Ziel Genexpression erheblich mit einer höheren Menge an Plasmid pro Fisch (ergänzende Abbildung1). Fisch mit dem pCMV-EGFP-Reporter-Plasmid injiziert führte zu eine Injektion mit 5 – 20 µg Plasmid in vier bis acht Mal höher EGFP Ebenen im Vergleich zu Fisch mit 0,5 µg gespritzt. Daher, um ein hoch genug Ziel Genexpression zu gewährleisten, dennoch haben Einspritzmengen, die klein genug (≤7 µL) überschüssiges Gewebe beschädigt werden kann oder Impfstoff Leckagen sind, entschieden wir uns, 5 bis 12 µg pro Fisch für die Vorauswahl zu verwenden. Neben der Impfstoff Immunogenität, hohem müssen genügend Ziel Genexpression Reporter-gen-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop und mit western-Blot, zu erkennen ist die erforderlich zu screening-Zwecken die richtige in Vivo bestätigen Übersetzung von das Ziel-Antigen. Jedoch niedrigere Plasmid Dosen (0,5 – 1 µg) kann nützlich sein für andere Arten von experimentellen verwendet.

Abschließend kann dieses Protokoll für die Impfung von Erwachsenen Zebrafisch mit einem Plasmid DNA in der präklinischen Erprobung neuartiger Impfstoffkandidaten gegen verschiedene bakterielle oder virale Infektionen verwendet werden. Der Ausdruck der Impfstoff-Antigen als GFP Fusionsprotein ermöglicht die Visualisierung eines erfolgreichen Immunisierung Event und Antigen Ausdrucks. Wir wenden diese Methode für die präklinische Screening von Roman Antigen Impfstoffkandidaten gegen Tuberkulose. Wir infizieren der Zebrafisch fünf Wochen Postvaccination und bestimmen, dass die Bakterien in jeder Fisch mit qPCR20,24zählt.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren sind dankbar für die Mitglieder der Arbeitsgruppe Experimentelle Immunologie, und vor allem an Leena Mäkinen und Hannaleena Piippo, für all die Arbeit sie haben getan in der Entwicklung und Optimierung der Impfung Protokoll und ihre Hilfe bei der eigentlichen Experimente unter Verwendung des Protokolls.

Diese Arbeit wurde unterstützt von Jane ja Aatos Erkon Säätiö (Jane und Aatos Erkko Stiftung; m.r.), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Stiftung; m.r.), wettbewerbsfähigen Zustand Forschung Finanzierung der Experte Verantwortungsbereich der Universität Tampere Krankenhaus (, m.r.), mit Tuberkuloosisäätiö (Tampere Tuberkulose Stiftung; m.r., H.M und M.N), Suomen Kulttuurirahasto (finnischen Kulturstiftung; zu HM), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finnische Anti-Tuberkulose Stiftung; zu H.M) Väinö ja Laina Kiven Säätiö (Väinö und Laina Kivi Stiftung; M.N) und der Tampere City Science Foundation (M.N).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pCMV-GFP PlasmidAddgene#11153
2-PropanolSigma-Aldrich278475-2LDNA-Extraktion
Ampicillin-NatriumsalzSigma-AldrichA0166-5G
ChloroformMerck1.02445.2500DNA-Extraktion
ECM Elektroquadratischer PoratorBTX Harvard-GerätBTX ECM 830
FastPrep-24 5GMP Biomedicals116005500Homogenisator
Flammender/brauner MikropipettenabzieherSutter Instrument Co.P-97Ziehen von Nadeln
GeneJet PCR AufreinigungskitThermoFischer ScientificK0701
GFP ELISA KitCell Biolabs, Inc.AKR-121
Guanidinthiocyanat (FW 118.2)Sigma-AldrichG9277-500GDNA-Extraktion
ImageJ2imagej.net/Downloadsfrei verfügbare Software
LB Agar SigmaL2897-1kg
LB Bouillon (Miller)SigmaL3522-1kg
MikromanipulatorNarishigeMA-153
MikroskopNikonAZ100Fluoreszenzmikroskop
MikroskopOlympusZS61
Nightsea Vollständiges Adaptersystem mit Royal Blue Color LichtkopfElektronenmikroskopie WissenschaftenSFA-RB
PBS TablettenVWR ChemicalsE404-200TABL.
Phenolrotes NatriumsalzSigma-Aldrich114537-5G
PV830 Pneumatische Pico-PumpeWPISYS-PV830
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagenID:12163Plasmidextraktion
Natriumcitrat (FW294.1)VWR Chemicals27833.294DNA-Extraktion
Tri ReagentMolecular Research Center, Inc.TR 118DNA-Extraktion
Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat, Salz)SigmaA5040-100gAnästhesie- und Euthanasielösung
Tris (freie Base) (FW121.14)VWR Life Science0497-500GDNA-Extraktion
Pinzetten Elektroden (7 mm) KitsBTX Harvard-GerätBTX 450165Pinzettenelektroden
2,8 mm KeramikkügelchenOmni International19-646-3DNA-Extraktion
2 mL Robuste Röhrchen mit VerschlüssenOmni International19-649DNA-Extraktion
Aluminiumsilikat-KapillarenHarvard-Gerät30-0108
Microloader 20 & Micro; Leppendorf5242956.003Ladespitzen
Petrischale, 16 mmSarsted82.1473
SkalpelleSwan Morton0501
ParafilmBemisLaborfolie
Pins
Plastiklöffel
Spatel
Schwamm
Styropor Werkbank
Pinzette

Referenzen

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