方法文章

在室温和77 K条件下对生物样品进行电子顺磁共振研究的应用

DOI：

10.3791/58461

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2019年1月11日

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1Cardiovascular Pulmonary Research Laboratories and Pediatric Critical Care Medicine, Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Bruker BioSpin Corp, 3Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

电子顺磁共振（EPR）波谱法是检测自由基的明确方法。利用特异性自旋探针，可实现对细胞不同区室中自由基的检测。本文介绍一种实用且高效的生物样本采集方法，便于样本的处理、保存和转移，以进行EPR测量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在不同的细胞和组织区室中准确且特异性地检测活性氧（ROS）对于研究生物体系中氧化还原调控的信号通路至关重要。电子顺磁共振波谱法（EPR）是明确评估自由基的唯一直接方法。该方法的优势在于能够以高特异性检测特定物种的生理水平，但需要专用技术、严谨的样品制备以及适当的对照，以确保数据的准确解读。环状羟胺类自旋探针可选择性地与超氧阴离子或其他自由基反应，生成可通过EPR波谱法定量的硝酰基信号。具有细胞膜通透性的自旋探针以及专为快速富集于线粒体而设计的自旋探针，可用于测定不同细胞区室中的超氧阴离子浓度。

在培养细胞中，使用细胞膜通透性的1-羟基-3-甲氧羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯啶（CMH），并结合或不结合细胞膜不通透性超氧化物歧化酶（SOD）预处理，或使用细胞膜通透性的PEG-SOD ，可区分细胞外与胞质内的超氧化物。线粒体靶向探针1-羟基-4-[2-(三苯基鏻)乙酰胺基]-2,2,6,6-四甲基哌啶二氯化物（mito-TEMPO-H）可用于检测线粒体活性氧（主要为超氧化物）。

自旋探针与电子顺磁共振（EPR）光谱技术也可应用于体内模型。超氧阴离子可在血液和肺泡液等细胞外液以及肺组织等组织中被检测到。本文介绍了多种处理和保存组织以进行EPR检测的方法，以及在体内静脉给予1-羟基-3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉（CPH）自旋探针的技术。尽管测量可在室温下进行，但来自体外和体内模型的样品也可在-80 °C下保存，并在77 K条件下进行EPR分析。样品可保存在适用于-80 °C的专用管路中，并在77 K下检测，从而实现一种实用、高效且可重复的方法，便于样品的保存与转运。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管氧化应激和活性氧的检测在研究全身各器官系统多种疾病中具有重要意义，但由于活性氧（ROS）半衰期短且反应性高，其检测具有较大挑战性。电子顺磁共振（EPR）技术是检测自由基最明确的方法。与更常用的荧光探针相比，自旋探针具有优势。尽管荧光探针相对便宜、使用简便，并能快速、灵敏地检测ROS，但由于存在伪信号、无法计算ROS浓度以及普遍缺乏特异性等严重局限性，其应用受到限制1。

为了促进电子顺磁共振（EPR）在生物学研究中的应用，已合成多种自旋探针，可用于检测多种生物学相关的自由基种类以及 pO2、pH 和氧化还原状态2,3,4,5,6,7。此外，还开发了自旋捕获剂，用于捕获短寿命自由基并形成长寿命的加合物，从而有利于通过 EPR 进行检测8。这两类物质（自旋探针和自旋捕获剂）各有优缺点。其中一类常用的自旋探针是环状羟胺类化合物，它们本身在 EPR 中无信号，但可与短寿命自由基反应生成稳定的氮氧自由基。环状羟胺与超氧阴离子的反应速度比自旋捕获剂快 100 倍，使其能够与细胞内的抗氧化物质竞争反应；然而，这类探针缺乏特异性，需借助适当的对照和抑制剂来确定产生氮氧自由基信号的自由基种类或来源。尽管自旋捕获剂具有特异性，其捕获不同自由基后会产生特征性的谱图，但其对超氧阴离子的捕获动力学较慢，且所形成的自由基加合物易发生生物降解。自旋捕获技术在生物医学研究中的应用已有大量文献报道9,10,11,12,13。

本项目旨在演示利用自旋探针在不同细胞区室中检测超氧阴离子的实用电子顺磁共振（EPR）方法，包括实验设计与样品制备。 体外 以及在不同的组织区室中 体内已有若干论文发表了与这些目标相关的实验方案，采用可穿透细胞膜、不可穿透细胞膜以及线粒体靶向的自旋探针，以针对不同的细胞区室。 体外 并在小鼠模型中对组织进行处理以用于分析14,15我们在此文献基础上，通过验证使用1-羟基-3-甲氧羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉（CMH）自旋探针在不同细胞区室中检测超氧阴离子的方法，进一步拓展了相关研究。 体外 为确保测量的准确性，强调可能影响结果的潜在技术问题。我们还提供了使用CMH自旋探针在血液、支气管肺泡灌洗液和肺组织中进行电子顺磁共振（EPR）测量的方法。这些研究比较了不同组织处理方法，并介绍了一种在采集组织前向小鼠体内注射另一种自旋探针CPH的方法。最后，我们建立了一种实用的样本保存方法，即将样本储存于聚四氟乙烯（PTFE）管中，以便在77 K条件下进行EPR测量前的样本保存与转运。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验均经科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会批准。

1. 试剂的准备

  1. 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）储备液（150 mM）
    1. 将 2.95 g DTPA（393.35 g/mol）加入 10 mL 去离子水中。
    2. 为溶解 DTPA，逐滴加入 1 M NaOH，并调节 pH 至 7.0。
    3. 加水定容至 50 mL，得到终浓度为 150 mM 的 DTPA 溶液，于 4 °C 保存。
  2. 磷酸盐缓冲液（PBS）（50 mM，pH 7.4）
    1. 配制 5 M 氯化钠（NaCl）溶液（58.44 g/mol；29.22 g/100 mL）。
    2. 配制 1 M 磷酸氢二钾（K2HPO4）溶液（174.18 g/mol；17.42 g/100 mL）。
    3. 配制 1 M 磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液（136.1 g/mol；13.61 g/100 mL）。取 3 mL 5 M NaCl 溶液，加入 4.24 mL 1 M 磷酸氢二钾溶液和 0.760 mL 1 M 磷酸二氢钾溶液，混匀后检测 pH。
    4. 用去离子水定容至 100 mL。
    5. 短期（数天）储存于室温（RT），长期（数周）储存于 4 °C。
  3. 含 100 µM DTPA 的克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（KHB）
    1. 在 50 mL 锥形离心管中，加入 33.3 µL 150 mM DTPA 储备液。
    2. 用克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（KHB）定容至 50 mL。
    3. 每天新鲜配制含 DTPA 的缓冲液，并于室温保存。
  4. 含蔗糖的 Tris-EDTA 缓冲液
    1. 配制 0.5 M Tris 储备液：将 15.14 g Tris 碱（121.14 g/mol）溶于 150 mL 去离子水中，用 HCl 调节 pH 至 7.8，再定容至 250 mL。
    2. 将 21.4 g 蔗糖（342.29 g/mol；终浓度 = 0.25 mM）溶于 150 mL 去离子水中。
    3. 向蔗糖溶液中加入 5 mL Tris 储备液，使 Tris 的终浓度为 10 mM。
    4. 向 Tris-蔗糖溶液中加入 0.5 mL 0.5 M EDTA 储备液，使 EDTA 的终浓度为 1 mM。
    5. 检测 pH 并调节至 7.4。
    6. 用去离子水定容至 250 mL，于 4 °C 保存。
  5. 牛红细胞 Cu/Zn 超氧化物歧化酶（SOD）储备液（30,000 U/mL）
    1. 将 30,000 U SOD 溶于 1 mL PBS 中（约 5.7 mg，具体质量取决于 SOD 批次的活性）。
    2. 充分混匀，分装后短期（6–12 个月）储存于 -20 °C，长期储存于 -80 °C。
  6. SOD 工作液（1000 U/mL）
    1. 取 30 µL 30,000 U/mL SOD 储备液，加入  870 µL 无菌 PBS 中。
    2. 将溶液置于冰上，现配现用。
  7. 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）储备液（5 mM）
    1. 将 1 mg PMA（616.83 g/mol）溶于 325 µL DMSO 中（终浓度 = 5 mM）。
    2. 分装 5 mM PMA 溶液，于 -20 °C 保存。
  8. PMA 工作液（125 µM）
    1. 取 10 µL 5 mM PMA 储备液，加入 390 µL 无菌 PBS 中稀释。
    2. 将溶液置于冰上，现配现用。
    3. 作为 PMA 的溶剂对照，使用 10 µL DMSO 加入 390 µL PBS 中。
  9. 二苯基碘化氯（DIP）（2.5 mM）
    1. 将 3.2 mg DIP（316.57 g/mol）溶于 4 mL 溶剂中，配制成 2.5 mM 储备液。
    2. 现配现用。
  10. 去铁胺甲磺酸盐（DFO）（20 mM）
    1. 将 4.5 mg DFO（656.79 g/mol）溶于 340 µL 溶剂中，配制成 20 mM 储备液。
    2. 现配现用。
  11. 抗霉素 A（AA）储备液（5 mM）的配制
    1. 将 5.4 mg AA（532 g/mol）溶于 2 mL 乙醇中（终浓度 = 5 mM）。
    2. 将储备液分装至玻璃小瓶中，于 -20 °C 保存。
  12. 自旋探针的配制
    1. 向含 100 µM DTPA 的 50 mM 磷酸盐缓冲液中通入氮气 30 分钟，以去除溶解氧。
    2. 从 -20 °C 冰箱中取出自旋探针，待容器恢复至室温（10–15 分钟）。
    3. 称取 2.4 mg 1-羟基-3-甲氧羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷·盐酸盐（CMH）（237.8 g/mol）。
    4. 将 CMH 溶于 1 mL 脱氧磷酸盐缓冲液中，终浓度为 10 mM。
    5. 称取 5 mg 1-羟基-4-[2-(三苯基鏻)乙酰胺基]-2,2,6,6-四甲基哌啶单盐酸盐（mito-TEMPO-H）（529.1 g/mol）。
    6. 将 mito-TEMPO-H 溶于 1 mL 脱氧磷酸盐缓冲液中，终浓度为 9.5 mM。
    7. 称取 4.9 mg 1-羟基-3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷·盐酸盐（CPH）（223.7 g/mol）。
    8. 将 CPH 溶于 1 mL 脱氧磷酸盐缓冲液中，终浓度为 22 mM。
    9. 分装后于 -80 °C 保存（不建议反复冻融）。

2. 超氧阴离子的检测 体外

  1. 在室温下检测PMA刺激的RAW 264.7细胞中的总超氧阴离子、胞外和胞内超氧阴离子
    1. 按照无菌操作技术，解冻RAW 264.7细胞，并将其传代培养于含10%胎牛血清（低内毒素、无支原体）和1%抗真菌素/氨苄青霉素的DMEM培养基中，在37 °C、CO2培养箱中培养。
    2. 在处理前一天，将RAW 264.7细胞以每孔1 × 106个细胞的密度接种至6孔板中。
    3. 轻柔吸去培养基，用1 mL KHB缓冲液洗涤细胞一次。
    4. 向每孔加入含100 µM DTPA的KHB缓冲液，总体积为500 µL，并进行如下处理：
    5. 对于预处理SOD的孔，每孔加入15 µL SOD工作液（1000 U/mL；SOD终浓度 = 30 U/mL），在加入CMH和PMA前于37 °C孵育10分钟。
    6. 每孔加入12.5 µL 10 mM CMH储备液（终浓度 = 0.25 mM）。
    7. 每孔加入40 µL 125 µM PMA工作液（终浓度 = 10 µM），或加入40 µL溶剂对照（将10 µL DMSO溶于390 µL PBS中）。
    8. 在CO2培养箱中于37 °C孵育50分钟。
    9. 从培养箱中取出培养板，立即置于冰上。
    10. 将各孔中的缓冲液分别收集至预先标记的1.5 mL离心管中，全程保持在冰上。
    11. 向每孔加入100 µL新鲜的含100 µM DTPA的KHB缓冲液，轻柔刮下细胞，并通过反复吹打重悬细胞。在整个细胞重悬过程中保持样本处于冰上。
    12. 取步骤2.1.10和2.1.11中收集的样本各50 µL，分别加入毛细管中。密封两端后进行电子顺磁共振（EPR）检测。
      注意：始终需设置对照，即使用不含细胞但含有探针（相同浓度 = 0.25 mM）的缓冲液管或孔，在与细胞相同的条件下（相同孵育时间和温度）处理，以检测背景信号强度，因为探针的背景信号具有时间和温度依赖性。
    13. 设置EPR采集参数如下：微波频率 = 9.65 GHz；中心磁场 = 3432 G；调制幅度 = 2.0 G；扫描宽度 = 80 G；微波功率 = 19.9 mW；总扫描次数 = 10；扫描时间 = 12.11 s；时间常数 = 20.48 ms。
  2. 检测RAW 264.7细胞中的线粒体超氧阴离子
    1. 参照步骤2.1.1和2.1.2，在实验前一天接种RAW 264.7细胞。
    2. 吸去培养基，用1 mL KHB缓冲液洗涤细胞一次。
    3. 向每孔加入200 µL含100 µM DTPA的KHB缓冲液。
    4. 每孔加入5.3 µL 9.5 mM mito-TEMPO-H储备液（终浓度 = 0.25 mM）。
    5. 在室温下孵育10分钟。
    6. 每孔加入1 µL抗霉素A（AA）乙醇储备液（5 mM，终浓度 = 25 µM）。
    7. 在CO2培养箱中于37 °C孵育50分钟。
    8. 从培养箱中取出培养板，立即置于冰上。
    9. 轻柔刮下细胞，并通过吹打重悬细胞，全程保持在冰上。
    10. 将样本加入毛细管中，密封两端。
    11. 参见前一部分的EPR参数设置。
  3. 在77 K条件下检测RAW 264.7细胞中的超氧阴离子
    1. 将步骤1.1.10中收集的缓冲液加入预先准备好的PTFE管中，管长1–2英寸（外径3/16"，内径1/8"）。确保PTFE管保持平直，以便顺利插入和取出指形杜瓦瓶。用橡胶塞封闭PTFE管一端，用移液器将缓冲液或细胞悬液（100至150 µL）加入管中，再用第二个橡胶塞密封。
    2. 将样本在液氮中快速冷冻。样本可转移至标记好的冻存管中，在-80 °C保存，或立即进行检测。
    3. 向指形杜瓦瓶中加入液氮，并将含有样本的PTFE管插入其中。确保样本位于谐振腔的有效检测区域中心，然后在77 K条件下进行EPR检测。
      注意：在开始测量前15–30分钟启动光谱仪的氮气流，并在整个测量过程中持续通气，以防止谐振腔内产生水分冷凝。
    4. 设置EPR采集参数如下：微波频率 = 9.65 GHz；中心磁场 = 3438 G；调制幅度 = 4.0 G；扫描宽度 = 150 G；微波功率 = 0.316 mW；总扫描次数 = 10；扫描时间 = 60 s；时间常数 = 1.28 ms。

3. 液体中的电子顺磁共振测量

  1. 全血
    1. 对小鼠（8-12周龄）进行单次气管内给药博来霉素（Bleo；100 µL，1 U/mL，溶于PBS）或单独给予PBS，操作方法参照先前描述16,17.
    2. 通过吸入异氟烷（1.5–4%）对小鼠实施安乐死，随后进行放血和颈椎脱位。使用涂有肝素（1000 USP/mL）并含有100 µM DTPA的注射器从右心室抽吸血液，转移至1.5 mL离心管中。
    3. 在另一个1.5 mL离心管中，向132 µL血液中加入含100 µM DTPA的15 µL PBS和3 µL CMH（10 mM），总体积为150 µL，CMH终浓度为0.2 mM。
    4. 将血液在37 °C水浴中孵育10分钟。
    5. 从水浴中取出试管。
    6. 取适量血液样品加入毛细管中，在室温下进行电子顺磁共振（EPR）检测，EPR采集参数如下：微波频率 = 9.65 GHz；中心磁场 = 3432 G；调制幅度 = 1.0 G；扫描宽度 = 80 G；微波功率 = 19.9 mW；总扫描次数 = 3；扫描时间 = 12.11 s；时间常数 = 20.48 ms。或者，样品可按照步骤2.3所述进行快速冷冻，用于77 K条件下的检测。EPR采集参数如下：微波频率 = 9.65 GHz；中心磁场 = 3438 G；调制幅度 = 4.0 G；扫描宽度 = 150 G；微波功率 = 0.316 mW；总扫描次数 = 2；扫描时间 = 60 s；时间常数 = 1.28 ms。
  2. 支气管肺泡灌洗液（BALF）
    1. 安乐死后（见步骤 3.1.2），用注射器将含有 100 µM DTPA 的 1 mL PBS 缓慢注入并抽出三次，收集支气管肺泡灌洗液（BALF） 通过 气管内放置的套管。
    2. 在1.5 mL离心管中，将200 µL支气管肺泡灌洗液与4 µL CMH（10 mM）混合，使终浓度为0.2 mM。
    3. 在37 °C水浴中孵育BALF 50分钟。
    4. 从水浴中取出试管，置于冰上。
    5. 将BALF加入毛细管中，并在室温下使用与步骤1.1.13相同的EPR参数运行EPR检测，或按照步骤2.3所述用液氮速冻。
  3. 77 K 下血液和支气管肺泡灌洗液中的电子顺磁共振测量
    1. 按照上述方案采集血液（步骤 3.1.1 至 3.1.4）和支气管肺泡灌洗液（步骤 3.2.1 至 3.2.4）。
    2. 将150 µL经处理的血液或支气管肺泡灌洗液（BALF）置于聚四氟乙烯（PTFE）管（1-2英寸）中。在加入样本前，用橡胶塞封闭PTFE管的一端，样本加入后再用另一橡胶塞密封管子。
    3. 将样品在液氮中快速冷冻。
    4. 有关使用指形杜瓦瓶在 77 K 下对聚四氟乙烯（PTFE）管中的冷冻样品进行电子顺磁共振（EPR）检测的详细信息，请参见第 2.3 节。冷冻的 CMH 处理血液样品需在一周内完成检测。

4. 肺组织上的电子顺磁共振（EPR）测量

  1. 闪冻肺组织
    1. 在3.2.1步骤收集支气管肺泡灌洗液（BALF）后，打开胸腔并用10 mL冷磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗肺部 通过 用右心室冲洗以去除血液。将肺组织在液氮中速冻。冷冻的肺组织可于-80 °C保存长达6个月，直至用于EPR检测。
    2. 用镊子将肺组织固定在干冰上，使用单刃刀片切割成多个小块（5-15 mg）。
    3. 将组织放入1.5 mL离心管中，将离心管置于天平上归零，然后加入组织块并记录重量。
    4. 向1.5 mL离心管中的组织加入196 µL含DTPA的KHB缓冲液和4 µL CMH（0.2 mM），使总体积达到200 µL。
    5. 37 °C 水浴孵育 1 小时。
    6. 在微量离心机中以3,884 × g离心数秒。
    7. 置于冰上，用移液器将150 µL上清液转移至PTFE管中，并按照2.3节所述方法冷冻，用于77 K测量。
      注意：采用该方法时需考虑损伤的异质性。对于博来霉素诱导的肺损伤，由于其损伤具有高度异质性，建议从每只小鼠肺组织的不同部位切取多个组织样本。或者，也可将较大一块组织在含有100 µM DTPA的KHB缓冲液中按1:6的重量体积比（mg/µL）进行匀浆，具体操作如下所述。
  2. 蔗糖缓冲液保存的新鲜肺组织
    1. 用预冷的PBS冲洗灌洗过的肺组织，以去除血液，操作同3.1.2步骤。
    2. 使用Dounce组织研磨器（配玻璃或PTFE研杵），将新鲜肺组织在含有0.25 M蔗糖的Tris-EDTA缓冲液中按1:6（mg/µL）的肺组织/缓冲液体积比进行匀浆。
    3. 将50 µL肺匀浆加入含100 µM DTPA的450 µL KHB中。
    4. 在1.5 mL离心管中（总体积为100 µL），向98 µL KHB中的肺匀浆液加入2 µL 10 mM储备浓度的CMH，使终浓度为0.2 mM。
    5. 37 °C 水浴孵育 20 分钟。
    6. 将样品置于冰上，并装入毛细管中。在室温下进行电子顺磁共振（EPR）检测（采用步骤2.1.13中的设置）。
    7. 为利用不同抑制剂检测特定物种和来源的贡献，将88 µL肺匀浆液加入或不加抑制剂进行预处理，并用KHB调节至终体积为98 µL。本实验所用抑制剂包括10 µL超氧化物歧化酶（SOD，100 U/mL）、4 µL去铁胺（DFO；终浓度 = 800 µM）或4 µL二苯基碘化氯（DIP；终浓度 = 100 µM）。在37 °C水浴中孵育20分钟。
    8. 加入2 µL的CMH，在37 °C下再孵育20分钟，随后按上述方法进行EPR检测。设置一份含蔗糖缓冲液的CMH KHB一次性匹配空白样品。或者，将剩余的肺匀浆样品（步骤3.1.2）分装后于-80 °C保存，以备后续检测使用。
      注意：总体积可根据需要进行调整。
  3. 对注射了自旋探针的小鼠肺组织进行电子顺磁共振（EPR）测量 体内 （在室温下使用组织细胞）
    1. 通过将4.9 mg CPH溶解于1 mL过滤除氧的50 mM磷酸盐缓冲液中，配制CPH储备液。
    2. 用吸入式异氟烷（1.5–4%）麻醉小鼠，持续20–30秒，直至对脚趾夹捏无反应。注射小鼠 通过 通过眶后途径为体重25 g的小鼠注射100 µL CPH自旋探针（终剂量 = 20 mg/kg），并让探针循环1 h。眶后注射后立即在眼部区域滴加一滴0.5%盐酸丙帕他卡因，以防止眼部疼痛和干燥。监测小鼠1 h后，进行组织采集。
    3. 按照上述方法收获肺组织，并将肺组织进行速冻。
    4. 在干冰上切取20–30 mg的冷冻组织，并记录准确重量。
    5. 用清洁湿巾轻轻擦拭组织，以吸去表面水分。
    6. 将组织置于组织细胞窗内（该附件可用于组织样本的电子顺磁共振测量），运行电子顺磁共振（EPR）以测定总自旋数。数据可表示为每毫克组织的总自旋数。

5. 数据分析

  1. 使用台式EMXnano电子顺磁共振（EPR）波谱仪Xenon软件中的SpinFit模块模拟EPR谱图。通过SpinCount模块确定硝酰基的浓度。或者，可使用稳定的硝酰基化合物（如4-羟基-TEMPO或TEMPOL）制作标准曲线，并通过比较样品与标准品信号强度来获得浓度。
  2. 对于在77 K下采集的数据，先进行双重积分，再使用SpinCount模块分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用CMH检测超氧阴离子时，通过X/XO超氧生成系统验证了该方法的可靠性，结果表明，超氧化物歧化酶（SOD）可完全抑制硝基氧化物（CM.）信号，而过氧化氢酶无此效应（图1A）。随后，在RAW 264.7细胞中评估总胞外超氧阴离子水平，方法是将细胞与可穿透细胞膜的CMH自旋探针共同孵育，并设置是否预先加入SOD的实验组。在细胞悬液和缓冲液中均测定了硝基氧化物浓度，结果显示两种样本中的数值相近，这归因于自旋探针具有良好的膜通透性和快速平衡特性（图1B）。与对照细胞相比，经PMA刺激的RAW 264.7细胞中硝基自由基信号显著增强，而在预先用不可穿透细胞膜的SOD处理的细胞中，该信号明显减弱（图1C）。图中每种颜色代表不同日期检测的孔，展示了特定日期数据的一致性以及随时间推移结果的可重复性。胞外超氧阴离子浓度通过从未经SOD处理的PMA刺激组信号中减去经SOD预处理的PMA组信号...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在生理与病理状态下，自由基生成的评估对于理解氧化还原调控信号通路至关重要。然而，由于自由基物种半衰期极短，且常用检测方法存在技术局限性，其定量检测极具挑战性。电子顺磁共振（EPR）是氧化还原生物学中一种重要且强大的工具，因其是唯一能够明确检测自由基的方法。在本研究中，我们展示了利用自旋探针在不同细胞区室中检测活性氧（ROS）的实用EPR实验设计与样品制备方法。 关键词：自由基生成，氧化还原信号，电子顺磁共振（EPR），活性氧（ROS），自旋探针，细胞区室，实验设计，样品制备 体外 以及不同的组织区室 体内 我们还提供了处理生物样本和储存样本以提高效率的实用方法。

自旋探针可高效地与活性氧（ROS）反应，生成稳定的亚硝基自由基，可通过电子顺磁共振（EPR）进行检测。已合成多种具有不同通透性特征的自旋探针（环状羟胺）衍生物，使其适用于检测不同细胞区室中的自由基生成10。本实验方案采用细胞可通透性自旋探针CMH；然而，不可通透性自旋探针1-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基-三甲基铵氯化物盐酸盐（...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作得到了科罗拉多大学医学院院长战略研究基础设施奖、R01 HL086680-09 和 1R35HL139726-01（授予 E.N.G.）以及科罗拉多大学丹佛分校 CFReT 奖学金（HE）的支持。作者感谢丹佛大学 Sandra Eaton 博士和 Gareth Eaton 博士、马里兰大学 Gerald Rosen 博士和 Joseph P. Kao 博士，以及科罗拉多大学丹佛分校 Sujatha Venkataraman 博士提供的有益讨论，同时感谢科罗拉多大学丹佛分校 Joanne Maltzahn 、Ashley Trumpie 和 Ivy McDermott 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMLifeTech10566-016细胞培养基
二乙烯三胺五乙酸（DTPA）Sigma AldrichD6518-5G
氯化钠（NaCl） Fisher Scientific  BP358-212用于根据 Sigma Aldrich 的说明配制 50 mM 磷酸盐缓冲液   
磷酸氢二钾（HK2PO4）Fisher Scientific  BP363-500用于根据 Sigma Aldrich 的说明配制 50 mM 磷酸盐缓冲液   
磷酸二氢钾（KH2PO4）Sigma AldrichP-5379用于根据 Sigma Aldrich 的说明配制 50 mM 磷酸盐缓冲液   
Krebs-Henseleit 缓冲液（KHB） （Alfa Aesar, Hill）J67820
牛红细胞超氧化物歧化酶（SOD）Sigma Aldrich S7571-30KU
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA） Sigma AldrichP1585-1MG溶于 DMSO
抗霉素 A（AA）Sigma AldrichA8674-25MG溶于乙醇并储存于玻璃小瓶中（所用分子量为四批样品的平均分子量）
1-羟基-3-甲氧羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉盐酸盐（CMH）Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-羟基-3-羧基-2,2,5,5-四甲基吡咯啉盐酸盐（CPH）Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-羟基-4-[2-(三苯基磷鎓)乙酰胺基]-2,2,6,6-四甲基哌啶，1-羟基-2,2,6,6-四甲基-4-[2-(三苯基磷鎓)乙酰胺基]哌啶二氯化物（mito-TEMPO-H）Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-4-基-三甲基铵氯化物盐酸盐（CAT1H）Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
肝素 Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
二苯基碘鎓氯化物 Sigma Aldrich43088
去铁胺甲磺酸盐Sigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND 一次性 BLAUBRAND 微量移液器，intraMarkSigma Aldrich708733毛细管
PTFE 分流氟聚合物管
3/16” 外径 × 1/8” 内径		NORELL1598774A特氟龙管 
用于核磁共振样品管的硅橡胶塞 ，适用于外径为 4 mm–5 mm（内径为 3.2 mm–4.2 mm）的薄壁管，型号 TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano 台式电子顺磁共振（EPR）波谱仪 Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO 组织细胞检测器Bruker BioSpin GmbHE7004542

参考文献

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  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).

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