本文介绍了利用转录因子驱动的直接谱系重编程（DLR）技术，从小鼠成体成纤维细胞诱导生成诱导性红系祖细胞（iEPs）的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
红系细胞的命运决定与分化过程通过激活一组由特定谱系限制性转录网络所调控的细胞命运决定因子和成熟因子来实现。我们先前致力于确定通过直接谱系重编程将成纤维细胞转化为诱导性红系祖细胞/前体细胞（iEPs）时，指导红细胞发育所需的最小因子组合。我们已证明，过表达 Gata1, Tal1, Lmo2，以及 c-Myc (GTLM) 能够快速将小鼠和人类成纤维细胞直接转化为类似于内胚层前体细胞（iEPs）的细胞 真正有效的 在形态、表型和基因表达方面与红系细胞相似。我们预期诱导性红系前体细胞（iEPs）将成为研究红细胞生成及细胞命运调控的宝贵工具。本文中，我们描述了将小鼠尾尖成纤维细胞逐步转化为iEPs的过程。 通过 转录因子驱动的直接谱系重编程（DLR）。在此示例中，我们使用表达黄色荧光蛋白（YFP）的红系谱系示踪小鼠的成纤维细胞进行重编程，其中YFP在促红细胞生成素受体基因（EpoR）启动子的调控下表达，从而可在重编程过程中可视化红系细胞命运的诱导。按照本方案，成纤维细胞可在5至8天内被重编程为诱导性红系前体细胞（iEPs）。
尽管该过程仍有改进空间，但我们证明了GTLM介导的重编程是一种快速且直接的方法，可获得具有以下特性的细胞： 真正 红系祖细胞和前体细胞
引言
红细胞（RBCs）在所有脊椎动物中均至关重要，占人体全部细胞的84%1从胚胎期到成年期，人类健康高度依赖于红细胞稳态的精确调控。在整个发育至成年过程中持续生成成熟红细胞的过程被称为红细胞生成。红细胞生成研究中的一个主要挑战是明确调控红细胞发育以及原始与定型红细胞生成之间转换的关键主控因子。对红系祖细胞进行直接谱系重编程，为深入理解红系发育提供了新的机遇。 体内.
直接谱系重编程（DLR），亦称为转分化，是指将一种细胞类型直接重编程为另一种细胞类型，从而绕过多能性及多潜能祖细胞阶段的过程。迄今为止，DLR 已被用于生成多种细胞类型，包括神经细胞2，造血的3,4,5肝的6 和肾病性7，祖细胞。对于发育生物学家而言，DLR 已成为研究谱系承诺和终末分化过程的重要工具8,9DLR 可以补充并部分替代 体内 用于研究发育过程中细胞命运决定因子机制的研究。本文所述....
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方案
1. 小鼠尾尖原代成纤维细胞培养物的建立与维持
- 通过在培养皿表面覆盖0.1%明胶，并在37 °C下孵育约20分钟，制备明胶包被的培养皿（建议每条尾使用一个10 cm培养皿）。吸除培养皿中的明胶溶液，并使其干燥至少2小时。
- 通过颈椎脱位法处死小鼠。用剪刀从尾根部剪下尾部。将尾部置于含2%胎牛血清（FBS）的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，待用。
注意：为获得最佳结果，应使用约6至8周龄的小鼠尾部。虽然也可使用超过8周龄的小鼠尾部，但随着小鼠年龄增长，成纤维细胞的增殖能力及重编程效率会下降11。 - 本方案后续所有步骤均需在无菌条件下于组织培养超净台中进行。配制0.02%胰蛋白酶-EDTA的DPBS稀释液，并向未包被的10 cm培养皿中加入5 mL。
- 先用70%乙醇洗涤尾部，再用DPBS洗涤。将尾部平放在培养皿中，用镊子固定。沿尾部纵轴从根部至尖端做一切口。
- 用一对镊子夹住尾部并垂直固定。用另一对镊子夹住切口旁尾根部的皮肤，将其向后剥离。在切口两侧均进行此操作，直至可通过向尾尖方向下拉将皮肤完全剥离。
- 用镊子夹住去皮的尾部，置于含胰蛋白酶溶液的培养皿上方，将尾部切成约1 cm长的小段。将尾段放入胰蛋白酶溶液中，用剪刀进一步剪碎成更小的组织块。在37 °C下将尾段于胰蛋白酶溶液中孵育10分钟。
注意：组织块越小越好，以提供更高的表面积与体积比。....
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结果
本文介绍了一种利用转录因子驱动的直接谱系重编程（DLR）技术，从成体成纤维细胞中可重复地生成诱导性红系祖细胞（iEPs）的实验方案。我们通过流式细胞术、集落形成实验以及基因表达分析对细胞重编程效果进行了评估。为了便于观察向红系细胞命运的转变过程，我们在具有红系谱系示踪系统的转基因小鼠（Epor-Cre R26-eYFP）来源的成纤维细胞上进行重编程。该小鼠模型中，所有在发育任何阶段表达促红细胞生成素受体（Epor，其中一个等位基因的内源性Epor位点插入了Cre）转录本的细胞，均会在Rosa26位点表达黄色荧光蛋白（eYFP）12,13（图1A）。在成功诱导生成红系祖细胞后，转导后第5天即可观察到YFP阳性（EpoR+）细胞。重编程第5天时，细胞变为圆形，从培养板表面脱离并开.......
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讨论
过表达四种因子的混合物， GATA1, TAL1, LMO2, 和 c-MYC（GTLM）足以将小鼠和人类成纤维细胞直接重编程为诱导性表皮细胞（iEPs）10重编程的红系细胞在形态和功能上与 真正 在形态学、表型、基因表达和集落形成能力方面，红系祖细胞均表现出相应特征。该发现印证了利用直接重编程作为解析造血发育因子工具的合理性。为验证该方法的普适性，iEPs亦可通过GTLM诱导小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞生成，表明该技术适用于不同来源及跨物种的成纤维细胞。10在本报告中，我们利用红系谱系示踪小鼠的成纤维细胞诱导重编程，作为一种可视化其向红系细胞转化的工具。该小鼠模型的使用对本实验方案具有辅助作用，但并非关键。我们常规使用来自不同小鼠品系的多种成纤维细胞进行重编程，并通过细胞表面标志物.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢伊芙琳·王（Evelyn Wang）和格雷戈里·海德（Gregory Hyde）（美国马萨诸塞州剑桥市怀特黑德研究所）在克隆工作中的贡献，以及哈维·洛迪什（Harvey Lodish）（怀特黑德研究所）提供了用于构建逆转录病毒文库的多种质粒。我们感谢卡维塔·西瓦（Kavitha Siva）和索菲·辛布兰特（Sofie Singbrant）（隆德大学分子医学与基因治疗系）、戈兰·卡尔松（Göran Karlsson）和沙米特·索内吉（Shamit Soneji）（隆德大学分子血液学系）在iEP制备方法描述中的贡献。我们还要感谢并感谢胡利安·普莱西奥（Julian Pulecio）（巴塞罗那生物医学研究园再生医学中心）、维奥莱塔·雷昂-斯特拉达（Violeta Rayon-Estrada）（纽约洛克菲勒大学）、卡尔·沃克利（Carl Walkley）（墨尔本大学圣文森特医院医学系及圣文森特医学研究所）、安赫尔·拉亚（Ángel Raya）（巴塞罗那高等科研研究院）以及维贾伊·G·桑卡拉南（Vijay G. Sankaran）（麻省理工学院与哈佛大学布罗德研究所，剑桥市）在本研究早期工作中所做出的贡献。本研究得到了拉格纳·瑟德贝里基金会（资助J.F.）；瑞典研究理事会（资助J.F.）；奥勒·恩奎斯特建筑大师基金会（Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare，资助J.F.）；瑞典战略研究基金会（资助J.F.）；厄克·维伯格基金会（Åke Wiberg's Foundation，资助J.F.）；以及玛丽....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含丙酮酸钠的DMEM | GE Life Sciences | SH30022.01 | PhGP细胞培养基 |
| 含丙酮酸钠的DMEM | GE Life Sciences | SH30243.01 | 尾尖成纤维细胞培养基 |
| StemSpan无血清扩增培养基（SFEM） | Stem Cell Technologies | 9650 | 重编程培养基 |
| 胎牛血清 HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | 生长因子 |
| 青霉素/链霉素 HyClone（100倍浓度） | Ge Life Sciences | SV30010 | 抗生素 |
| 非必需氨基酸（100倍浓度） | Thermo Fisher | 11140050 | SNL培养基中添加此成分 |
| 胰蛋白酶 HyClone（1倍浓度） | GE Life Sciences | SH30042.01 | 细胞解离试剂 |
| 小鼠干细胞因子（mSCF） | Peprotech | 250-03 | 添加至重编程培养基 |
| 重组小鼠白细胞介素-3（Murine Il-3） | Peprotech | 213-13 | 添加至重编程培养基 |
| 人重组促红细胞生成素（hrEPO） | Peprotech | 100-64 | 添加至重编程培养基 |
| 地塞米松 | Sigma | 50-02-2 | 添加至重编程培养基 |
| 猪皮来源明胶 | Sigma | 9000-70-8 | 溶于dH₂O中，用于包被培养板。使用前确保无菌。 |
| 杀稻瘟菌素S盐酸盐 | Sigma | 3/9/3513 | 筛选抗生素，对原核和真核细胞均有作用 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Ge Life Sciences | SH30850.03 | 用于洗涤步骤 |
| 聚凝胺（Polybrene） | Merck | TR-1003-G | 感染/转染 试剂 |
| FuGENE HD 转染试剂 | Promega | E2311 | PhGP细胞系的转染试剂 |
| Millex-GP 针筒式滤器，0.22 µm | Merck | SLGP033RS | 用于过滤病毒上清液 |
| BD Emerald 皮下注射针筒 | Becton Dickinson | SKU: 307736 | 用于过滤病毒上清液 |
| 100 mm 培养皿 | Corning | 430167 | 细胞培养 |
| 6孔板 | Falcon | 10799541 | 细胞培养 |
| 珠宝商镊子 #5 | Sklar | 66-7642 | 用于处理小段尾组织 |
| Sklarlite 睫状体剪刀 | Sklar | 23-1149 | 用于将尾部剪成小片段 |
| 小鼠谱系细胞耗竭试剂盒（Lineage Cell Depletion Kit, mouse） | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | 用于耗竭成纤维细胞培养中的造血细胞 |
| CD117 MicroBeads，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | 用于耗竭成纤维细胞培养中的造血细胞 |
| PheonixGP细胞 | ATCC | CRL-3215 | 逆转录病毒包装细胞系 |
| EcoPAC 载体（pCL-Eco） | Novus Biologicals | NBP2-29540 | 含有gag和pol基因的逆转录病毒辅助载体 |
| pMX-Gata1 | 实验室克隆 | ||
| pMX-Tal1 | 实验室克隆 | ||
| pMX-Lmo2 | 实验室克隆 | ||
| pMX-cMyc | 实验室克隆 | ||
| CellSens Standard 1.6 软件 | 细胞离心涂片分析软件 |
参考文献
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M.
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