基于类病毒系统的Escherichia coli中环形支架上大规模生产重组RNA

摘要

本文介绍一种通过在大肠杆菌（Escherichia coli）中共表达嵌合RNA和植物tRNA连接酶来大量生产重组RNA的实验方案。该嵌合RNA包含目标RNA序列和类病毒骨架。主要产物为环状分子，有利于实现均一纯化。

摘要

随着人们对RNA生物学及其在复杂生物技术应用中使用RNA分子的兴趣日益增加，生产大量重组RNA的方法却十分有限。本文介绍了一种在体外生产大量重组RNA的实验方案 大肠杆菌 基于嵌合分子的共表达，该嵌合分子包含目标RNA与类病毒骨架融合的序列以及植物tRNA连接酶。类病毒是相对较小、非编码、高度碱基配对的环状RNA，可感染高等植物。宿主植物tRNA连接酶是一种被属于类病毒科的类病毒所招募的酶。 Avsunviroidae，例如 茄子潜隐病原体 （ELVd）以介导RNA在类病毒复制过程中的环化。尽管ELVd不在 E. coli一种ELVd前体可被高效转录 E. coli RNA聚合酶在细菌细胞内转录并由嵌入的锤头状核酶加工，产生的单体通过共表达的茄子tRNA连接酶环化，达到显著浓度。将目标RNA插入ELVd支架中，可在常规实验室条件下每升细菌培养物中生产数十毫克的重组RNA。RNA产物的主要组分为环状，这一特性有利于将重组RNA纯化至近乎均一。在本方案中，将对应于目标RNA的互补DNA（cDNA）插入表达质粒中ELVd cDNA的特定位置，并与共表达茄子tRNA连接酶的质粒共同用于转化 E. coli在强组成型启动子的调控下共表达这两种分子，可产生大量重组RNA。该重组RNA可从细菌细胞中提取，并利用其环状特性与大部分细菌RNA分离。

引言

与DNA和蛋白质相比，能够简便、高效且低成本地大量制备RNA的实验方案并不丰富。然而，科研与工业领域对这些生物大分子的需求日益增长，以深入研究其独特的生物学特性¹，或用于复杂的生物技术应用，包括作为高特异性的适配体²，治疗剂³，或选择性杀虫剂⁴体外转录和化学合成是研究中常用的RNA制备方法。然而，当需要大量产物时，这些方法存在重要局限性。合理的替代策略是利用活细胞内源性的转录机制，再通过纯化步骤将目标RNA与其共存的细胞组分分离。基于这一策略，已发展出在细菌细胞中生产重组RNA的方法，例如实验室常用的大肠杆菌 大肠杆菌⁵ 或海洋紫色光合α-变形菌 Rhodovolum sulfidophilum⁶大多数在细菌中生产重组RNA的方法依赖于表达一种天然的高稳定性RNA骨架（如tRNA或rRNA），并将目标RNA插入其中⁷这要求必须将目标RNA从嵌合分子中释放出来，如果额外的RNA对后续应用造成干扰的话。⁸重组RNA生物技术的另一个概念是生产可作为目标产物的重组核糖核蛋白复合物 本身 或用作一种保护策略，以....

方案

1. 质粒构建

1. 使用带有5’端延伸的引物，通过PCR（若起始模板为RNA，则采用逆转录PCR）扩增与目标RNA对应的cDNA，以便将其组装至表达质粒中。 为避免产生非预期的突变，应使用高保真DNA聚合酶。
   1. 通过Gibson组装将cDNA插入表达质粒²⁰，向PCR引物添加以下5’延伸序列：上游引物为5’-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’；下游引物为5’-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’；其中X代表与目标RNA末端同源的核苷酸。
   2. 98 °C孵育30秒，随后进行30个循环：98 °C变性10秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，最后在72 °C延伸10分钟。
2. 用10 U的I型IIS限制性内切酶消化100 ng质粒pLELVd-BZB Bpi 在0.5 mL离心管中，于37 °C下在20 µL反应体系中孵育1 h，缓冲液G（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，10 mM MgCl₂）₂，50 mM NaCl，0.1 mg/mL BSA。
   注意： 所有质粒均可向通讯作者申请获取。 Bpi....

结果

为了利用源自ELVd的系统在E. coli中生产重组RNA¹²，需将目标RNA插入ELVd RNA支架中。该嵌合RNA在E. coli中与茄子tRNA连接酶共表达。经过加工、切割并环化后，形成环状嵌合RNA，目标RNA由此突出，可能与共表达的茄子酶形成核糖核蛋白复合物，该酶在细菌细胞中可达到极高的浓度（图1）。因此，利用该系统生产重组RNA的第一步是将对应于目标RNA的cDNA插入ELVd cDNA的特定位置，即ELVd序列变体AJ536613中的T245-T246位点。质粒pLELVd-BZB在该位置含有一个带有两个Bpi I识别位点的多克隆位点以及LacZ蓝/白斑筛选标记基因，可通过高效的Gibson组装方法²⁰实现插入。通过LacZ标记的蓝/白斑筛选，可方便地选择含有目标重组质粒的转化E. coli克隆。若双Bpi I酶切不.......

讨论

在研究茄子tRNA连接酶识别ELVd序列和结构要求的过程中，我们注意到，在非宿主E. coli中同时表达这两种分子会导致细菌细胞内意外大量积累类病毒环状形式¹⁹。我们认为，类病毒RNA在E. coli中的大量积累，很可能是由于共表达了某种高度稳定的RNA分子（例如相对较小（333 nt）、碱基配对程度高、呈环状的类病毒）以及一种对该特定类病毒具有高亲和力的蛋白质。ELVd RNA在感染植物体内复制时，必须招募宿主tRNA连接酶以介导其环化过程¹⁷。尽管我们尚无实验验证，但我们推测这两种分子在E. coli中形成了核糖核蛋白复合物，进一步稳定了类病毒RNA，使其浓度达到每升细菌培养物150 mg的显著水平，远超rRNA等内源性RNA的浓度¹²。由于ELVd在E. coli中不进行复制，我们推断插入外源RNA不会显著影响类病毒来源RNA的积累，事实也确实如此。这一观察结果构成了本文所描述的在E. coli中大量.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	赛默飞世尔科技	F530S
Bpi 我	赛默飞世尔科技	ER1011
琼脂糖	Conda	8010	D1 低电渗流
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
乙酸	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
溴化乙锭	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒	Zymo Research	D4001
NanoDrop	赛默飞世尔科技	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA组装预混液	New England BioLabs	E2621S
DNA 纯化 &和浓缩器	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
大肠杆菌 DH5α	Invitrogen	18265-017
胰蛋白胨	Intron Biotechnology	Ba2014
酵母提取物	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
琼脂	Intron Biotechnology	25999
氨苄青霉素	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-二甲基甲酰胺	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin 质粒抽提试剂盒	Macherey-Nagel	22740588.250
大肠杆菌 BL21(DE3)	Novagen	69387-3
大肠杆菌 HT115(DE3)			参考文献：Timmons 等，2001
氯霉素	Duchefa	C 0113.0025
甘油	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
苯酚	Scharlau	FE04791000	90%
氯仿	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF 柱	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
ÄKTAprime plus 液相色谱系统	GE Healthcare Life Sciences	11001313
丙烯酰胺	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N’-甲叉双丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	M7279-100G
尿素	PanReac AppliChem	146392.1211
硼酸	PanReac AppliChem	A2940,1000
甲酰胺	PanReac AppliChem	A0937,2500
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B8026-5G
二甲苯青	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′双丙烯酰基胱胺	Sigma-Aldrich	A4929-5G