在此，我们描述了在 substantia gelatinosa (SG) 神经元中进行全细胞膜片钳记录的关键步骤 体外 脊髓切片。该方法可用于研究胶状质（SG）神经元的固有膜特性、突触传递及形态学特征。
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摘要
摘要
近年来，对胶状质（substantia gelatinosa, SG）神经元进行的全细胞膜片钳研究，为揭示感觉传递、伤害性调节以及慢性疼痛或瘙痒发生背后的脊髓机制提供了大量信息。结合急性脊髓切片技术开展的电生理记录与形态学研究，进一步加深了我们对SG神经元特性及其局部环路组成的理解。本文提供了一套制备脊髓切片的详细且实用的操作指南，并展示了典型的全细胞记录与形态学结果。该方案可实现理想的神经元保存，并在一定程度上模拟体内（in vivo）环境。总之，获得体外（in vitro）脊髓切片制备物的能力，使得稳定的电流钳和电压钳记录成为可能，从而有助于利用多种实验方法深入研究神经元的固有膜特性、局部环路及神经元结构。
引言
胶状质（SG，脊髓背角第II层）是传递和调节感觉信息的无可争议的重要中继中枢。它由兴奋性和抑制性中间神经元组成，这些神经元接收来自初级传入纤维、局部中间神经元以及内源性下行抑制系统的输入1近几十年来，急性脊髓切片制备技术的发展以及全细胞膜片钳记录技术的出现，使得研究人员能够对脊髓后角浅层神经元的固有电生理学和形态学特性开展多种研究。2,3,4 以及对SG局部环路的研究5,6此外，通过使用 体外 脊髓切片制备，研究人员可解读神经元兴奋性的变化7,8离子通道的功能9,10以及突触活动11,12 在多种病理条件下。这些研究加深了我们对脊髓节神经元在慢性疼痛和神经性瘙痒的发生与维持中所起作用的理解。
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方案
所有实验方案均经南昌大学动物伦理委员会（中国南昌，伦理编号：2017-010）批准。所有操作均尽可能减少实验动物的应激和疼痛。本研究中的电生理记录在室温（RT，22–25 °C）下进行。
1. 动物
- 使用任一性别的 Sprague-Dawley 大鼠（3–5 周龄）。将动物饲养在 12 小时光照-黑暗循环条件下，并提供 随意摄取 获得充足的食物和水。
2. 溶液与材料的准备
- 溶液
- 制备人工脑脊液（ACSF）（单位：mM）：117 NaCl、3.6 KCl、1.2 NaH2PO4·2H2O、2.5 CaCl2·2H2O、1.2 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3、11 D-葡萄糖、0.4 抗坏血酸和 2 丙酮酸钠。参见表 1。
- 制备蔗糖-ACSF（单位：mM）：240 蔗糖、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4·2H2O、0.5 CaCl2·2H2O、3.5 MgCl
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结果
根据图1所示示意图制备急性脊髓切片。切片完成后经过恢复期，将脊髓切片转移至记录室中。通过红外微分干涉相差（IR-DIC）显微镜观察细胞体的形态，以鉴定健康的神经元。随后，在将神经元钳制于静息膜电位（RMP）的条件下，施加一系列去极化电流脉冲（持续1秒），诱发胶状质（SG）神经元的动作电位。如图2所示，SG神经元中观察到的放电模式包括持续性放电、延迟性放电、间隙性放电、初始簇状放电、时相性簇状放电、单次放电以及难兴奋性放电，这些放电模式已被先前的研究描述并分类。
采用该制备方法，我们还在电压钳制模式下记录了亚阈值电流以及自发出现的电流。图3A展示了亚阈值电流的代表性记录，包括超极化激活电流（Ih）、T型钙电流（IT）和A型钾电流（I<.......
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讨论
本方案详细描述了制备脊髓切片的步骤，我们此前在对SG神经元进行全细胞膜片钳实验时已成功应用此方法18,19,20,21。通过采用该方法，我们近期报道了米诺环素（一种第二代四环素）可通过突触前机制显著增强SG神经元中的抑制性突触传递19。此外，该药物还可减小Ih电流的幅度，并进一步抑制SG神经元的兴奋性21。结合已发表的数据以及本文展示的代表性结果，表明本方案适用于多种电生理学研究。
正如我们之前指出的，经心灌注是获得健康样本的关键步骤。首先，我们使用冰冻的灌注液，以便迅速冷却脊髓并减缓神经元的代谢活动22其次，蔗糖替代的ACSF是一种“保护性切割”溶液，具有低Na<.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（编号：81560198，31660289）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | 用于制备ACSF和PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | 用于制备ACSF、蔗糖-ACSF以及基于K+的细胞内溶液 |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | 用于制备ACSF、蔗糖-ACSF和PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | 用于制备ACSF和蔗糖-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | 用于制备ACSF和蔗糖-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 用于制备ACSF和蔗糖-ACSF |
| D-葡萄糖 | Sigma | G7021 | 用于制备ACSF |
| 抗坏血酸 | Sigma | P5280 | 用于制备ACSF和蔗糖-ACSF |
| 丙酮酸钠 | Sigma | A7631 | 用于制备ACSF和蔗糖-ACSF |
| 蔗糖 | Sigma | S7903 | 用于制备蔗糖-ACSF |
| K-葡萄糖酸盐 | Wako | 169-11835 | 用于制备基于K+的细胞内溶液 |
| Na2-磷酸肌酸 | Sigma | P1937 | 用于制备细胞内溶液 |
| EGTA | Sigma | E3889 | 用于制备细胞内溶液 |
| HEPES | Sigma | H4034 | 用于制备细胞内溶液 |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | 用于制备细胞内溶液 |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | 用于制备细胞内溶液 |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | 用于制备基于Cs+的细胞内溶液 |
| CsCl | Sigma | C3011 | 用于制备基于Cs+的细胞内溶液 |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | 用于制备基于Cs+的细胞内溶液 |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% Neurobiotin 488可用于形态学研究 |
| 琼脂 | Sigma | A7002 | 本方案中使用了3%琼脂块 |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | 免疫组织化学处理中使用4%多聚甲醛 |
| Na2HPO4 | 恒兴化学试剂 | 用于制备PBS | |
| 封片介质 | Polyscience | 18606 | |
| 乌拉坦 | 中国食品药品检定研究院 | 30191228 | 1.5 g/kg，腹腔注射 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments | TW150F-4 | 外径1.5 mm，内径1.12 mm |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | 用于制备微电极 |
| 振动切片机 | Leica | VT1000S | |
| 防振台 | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| 红外CCD相机 | Dage-MIT | IR-1000 | |
| 膜片钳放大器 | HEKA | EPC-10 | |
| 显微操作器 | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y位移平台 | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| 正置显微镜 | Olympus | BX51WI | |
| 渗透压仪 | Advanced | FISKE 210 | |
| pH计 | Mettler Toledo | FE20 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 700 |
参考文献
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gela....
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