腺病毒基因转移载体的遗传与化学衣壳联合修饰用于屏蔽与靶向

摘要

本文所述方案使研究人员能够通过简单的化学方法在特定位置特异性修饰腺病毒衣壳。可由此生成被屏蔽的腺病毒载体颗粒和重定向基因转移载体，并可用于研究载体与宿主之间的相互作用。

摘要

腺病毒载体是基因疫苗接种和溶瘤病毒治疗的有力工具。然而，它们在多次使用后尤其容易引发多种非预期的载体-宿主相互作用，特别是 体内 递送。目前普遍认为，只有对载体表面进行明确的修饰，才能克服由非预期的载体-宿主相互作用所带来的限制。这些修饰包括通过引入新的配体来屏蔽颗粒以避免非特异性相互作用，并实现靶向递送。本方案的目标是使读者能够制备出具有屏蔽功能、并可根据需要实现重靶向的人源腺病毒基因转移载体或溶瘤病毒。该方案将使研究人员能够通过特异性化学连接合成聚合物、碳水化合物、脂类或其他生物或化学分子，对腺病毒载体衣壳表面进行修饰。本方案描述了前沿的遗传与化学衣壳修饰联合技术，该技术已被证明有助于深入理解并克服腺病毒在应用中所面临的递送屏障 体内 腺病毒载体的递送。本文提供了对执行涉及生物活性病毒或病毒衍生载体的特定化学反应的关键步骤进行详细且附有评注的描述。该方案所描述的技术基于将（天然缺失的）半胱氨酸残基通过遗传手段引入腺病毒衍生载体的溶剂暴露环区。这些半胱氨酸残基在载体以高滴度生产后，可提供特异性的化学反应活性，从而实现多种不同物质类别分子与载体颗粒之间高效且高度特异的共价化学偶联。重要的是，该方案可轻松调整，用于对腺病毒载体衣壳进行多种不同的（非巯基依赖型）化学修饰。最后，基于本方案，有望对除腺病毒外的其他非包膜病毒载体系统进行类似的改造。

引言

腺病毒（Ad）属于腺病毒科（Adenoviridae），是一类无包膜的DNA病毒，迄今已鉴定出70多种类型（http://hadvwg.gmu.edu）。根据其血凝特性、基因组结构及测序结果，这70种腺病毒可分为七个种（人类腺病毒A至G）^1,2。人类腺病毒基因组大小为38 kb，由二十面体核衣壳包裹³。由于含量丰富，衣壳蛋白六邻体（hexon）、五邻体基底（penton base）和纤维蛋白（fiber）均被称为主要衣壳蛋白。其中含量最丰富且分子量最大的六邻体蛋白构成20个衣壳面，每个面由12个六邻体同源三聚体组成^4,5。位于每个二十面体顶点的五邻体由五邻体基底的五聚体构成，是顶点突起的基部结构，该突起由糖基化的纤维蛋白三聚体构成^5,6。腺病毒进入宿主细胞的过程主要包括两个关键步骤。第一步，纤维蛋白的 knob 结构域与细胞表面的初级受体结合；在A、C、E和F种腺病毒中，该受体为柯萨奇病毒与腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor, CAR）。这一相互作用使病毒颗粒靠近细胞膜表面，从而促进细胞表面整....

方案

注意：以下详细描述了一种用于腺病毒载体的基因-化学法聚乙二醇化（PEGylation）的实验方案。为了实现PEG基团的特异性偶联，此前已通过在Ad5载体的六邻体蛋白高变区环5（hypervariable loop 5）中引入半胱氨酸残基的方式对其进行遗传修饰（如先前发表的研究³⁶所述），并采用马来酰亚胺活化的PEG化合物作为偶联试剂。

1. 通过CsCl阶梯梯度纯化载体的缓冲液制备

1. 将 4.76 g HEPES 和 3.504 g NaCl 溶于双蒸水（ddH₂O）中，定容至 400 mL，配制 400 mL 腺病毒缓冲液（Ad-buffer，含 50 mM HEPES 和 150 mM NaCl）。₂O)。制备以下三种Ad缓冲液变体需要350 mL该缓冲液。
   1. 方案A：用NaOH将150 mL腺病毒缓冲液（Ad-buffer）调节至pH 7.6。
   2. 变体B：向50 mL溶液中加入终浓度为10 mM的TCEP［三(2-羧乙基)膦，0.143 g］，并用HCl调节pH至7.2。
   3. 变体 C：向 150 mL 体系中加入终浓度为 0.5 mM 的 TCEP（0.022 g），并用 HCl 调节 pH 至 7.2。
   4. 用ddH₂O配制缓冲液₂O级和分析纯化学试剂。分别取100 mL的A型....

结果

图2展示了在293（HEK 293）细胞上出现的细胞病变效应（CPE）示例，表明载体已成功产生。在用病毒载体接种后40-48小时，细胞应显示出相应的形态学变化（图2C）。收获时间点的选择至关重要，过早会导致病毒颗粒因细胞裂解而丢失，同时也会防止基因引入的巯基发生氧化。若病毒颗粒因细胞裂解而释放到培养基中，基因引入的巯基将几乎立即被氧化，从而难以进行纯化和化学修饰。

图3展示了典型的CsCl条带。在化学修饰前进行不连续CsCl梯度离心的目的是去除病毒颗粒中的细胞碎片。化学修饰本身可在CsCl中进行。化学修饰后的第二次梯度离心则用于去除过量的（未反应的）偶联基团。需要注意的是，病毒是否成功修饰无法通过梯度结果直接观察，需进一步进行分子分析，理想方法为SDS-PAGE。

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讨论

通过基因引入的半胱氨酸进行化学修饰的效率通常为80-99%，且某些变量会影响该效率。首先，必须确保基因引入的半胱氨酸不会发生过早氧化。尽管在生产细胞的还原性环境中能得到良好保护，但在从生产细胞释放病毒载体颗粒后以及化学修饰过程中，必须提供非氧化性环境。为此，可使用浓度为0.1-10 mM的还原剂，且必须选用不含巯基的还原剂，以避免其与马来酰亚胺活化的化合物发生快速反应。其次，当使用马来酰亚胺活化化合物时，偶联反应的pH不应超过7.35，因为pH高于7.4会降低反应的特异性。第三，在任何情况下，反应均应使用无胺缓冲液（例如 HEPES、PBS）。值得注意的是，含半胱氨酸的病毒载体颗粒可按前述方法通过两次CsCl梯度离心进行纯化，随后储存于含10%甘油的HEPES缓冲液中，以待化学修饰。在此情况下，应使用0.1-1 mM TCEP作为还原剂，或更优地，将载体储存在氩气环境中。可使用带盖的充氩塑料容器实现此目的。此外，偶联至衣壳的化合物的流体动力学直径及其偶联位点也会影响修饰效率。衣壳中许多衣壳蛋白亚基（如纤维蛋白、六邻体）以三聚体形式存在，或（如五邻体基底）以五聚体形式存在。因此，根据基因引入半胱氨酸的位置，连接在一个单体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
载体纯化与化学修饰
氩气	Air liquide	本地气体供应商
液氮	Air liquide	本地气体供应商
500 mL 离心管	Corning	431123
Stericup Express Plus 0.22 µm	Millipore	SCGPU02RE
三(2-羧乙基)膦（TCEP）	Sigma-Aldrich	C4706-10g
2 mL（3 mL）Norm Ject（注射器）	Henke Sass Wolf	4020.000V0
一次性细针头（黄色 0.9 × 40 mm）	Henke Sass Wolf	4710009040
氯化铯 99.999% 超纯级	Roth	8627.1
硅胶珠	Applichem	A4569.2500
甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺-750（PEG mal-750）	Iris Biotech		置于硅胶珠中于 -80 °C 保存
13.2 mL 超透明超速离心管	Beckman Coulter	344059	仅可在通风橱中开启
PD-10 尺寸排阻层析柱	GE Healthcare	17-0851-01	4 °C 保存
Hepes	AppliChem	A1069.1000
SDS 超纯级	AppliChem	A1112,0500
甘油	AppliChem	A1123.1000
名称	公司	货号	备注
细胞培养材料
DPBS	PAN Biotech	P04-36500
DMEM	PAN Biotech	P04-03590
胰蛋白酶/EDTA	PAN Biotech	P10-0231SP
优质胎牛血清（FBS Good）	PAN Biotech	P40-37500
青霉素/链霉素	PAN Biotech	P06-07100
Biosphere 滤芯吸头（多种规格）	Sarstedt
血清移液管（多种规格）	Sarstedt
反应管（多种规格）	Sarstedt
TC 培养皿 15 cm	Sarstedt	83.3903
名称	公司	货号	备注
银染实验材料
甲醇	J.T.Baker	8045
无水乙醇	AppliChem	1613,2500PE
乙酸	AppliChem	A0820,2500PE
甲醛 37%	AppliChem	A0877,0250
无水乙醇	AppliChem	A1613,2500PE
硫代硫酸钠	AppliChem	1,418,791,210
硝酸银	AppliChem	A3944.0025
碳酸钠	AppliChem	A3900,0500
名称	公司	货号	备注
特殊实验设备
干燥器	Nalgene	5311-0250
Megafuge 40	Heraeus
Megafuge TX750 转子及适配器与 500 mL 管盖	Heraeus
水浴锅	常规
超速离心机 例如 Optima XPN-80	Beckman Coulter
适配的超速离心转子 例如 SW41	Beckman Coulter
pH 计	常规
带夹子的支架	常规
鹅颈灯	常规
顶置式搅拌器	常规
恒温金属浴	常规
分光光度计（OD 260）	常规