用于评估鼻腔至脑部药物递送的吸入麻醉下鼻内给药新方法

摘要

本文介绍了两种在吸入麻醉下对实验动物进行稳定经鼻给药的新方法，这些方法可最大限度地减少动物的生理应激。同时，我们还描述了一种利用放射性标记的[¹⁴C]-菊粉（一种水溶性大分子的模型底物）通过鼻-脑通路定量评估药物在脑内分布水平的方法。

摘要

已有研究报道，经鼻给药可能是一种绕过血脑屏障实现药物从鼻腔向脑部递送的有效途径。然而，关于鼻腔至脑部递送的研究，不仅缺乏定量分析的相关报告，也鲜见对最佳给药条件和给药方案的系统探讨。利用啮齿类动物开展鼻腔至脑部通路机制研究所取得的进展有限，这在候选药物的鼻脑递送系统设计方面构成了重要障碍。

为了在这一领域取得进展，我们开发并评估了两种用于实验动物在吸入麻醉下进行稳定经鼻给药的新方法。我们还描述了一种利用放射性标记的[¹⁴C]-菊粉（分子量：5,000）作为水溶性大分子模型物质，通过鼻-脑通路评估药物在脑内分布水平的方法。

最初，我们开发了一种基于移液器的经鼻给药方案，使用可临时打开的面罩，使我们能够在动物处于稳定麻醉状态下进行可靠的给药。利用该系统，可将[¹⁴C]-菊粉以较低的实验误差递送至脑部。

随后，我们开发了一种经鼻给药方案，该方案通过气道侧逆行插管穿过食管，旨在最大限度地减少黏膜纤毛清除（MC）的影响。与移液器法相比，该技术显著提高了在嗅球、大脑和延髓中定量检测到的[¹⁴C]-菊粉水平。这似乎是因为使用注射泵将药物溶液主动注入鼻腔，且注射方向与黏膜纤毛清除方向相反，从而显著增加了药物溶液在鼻腔内的滞留时间。

综上所述，本研究建立的两种鼻腔给药方法有望成为评估啮齿类动物药代动力学的极为有用的技术。特别是反向插管法，可能有助于全面评估药物候选物经鼻向脑递送的潜力。

引言

多肽、寡核苷酸和抗体等生物药物被认为在目前尚无治愈疗法的难治性中枢神经系统疾病中具有作为新型治疗剂的潜在应用价值。然而，由于大多数生物药物是水溶性大分子，通过静脉或口服给药时，很难从血液递送至脑内，这主要是受到血脑屏障（BBB）的阻碍。

近年来，已有研究报道经鼻给药可作为治疗剂通过鼻-脑通路递送至脑部的潜在途径，从而避开血脑屏障（BBB）^1,2,3,4,5。然而，关于鼻-脑通路递送的定量分析研究相对较少⁶。此外，目前几乎未见有关鼻-脑递送研究中建立最佳给药条件和给药方案（如给药体积、次数、时间间隔和速度等）的报道。上述不足主要归因于以下原因：（i）尚无针对小鼠建立最优的经鼻给药方法；（ii）目前普遍采用的移液器滴鼻法由于存在黏膜纤毛清除作用（MC），在动物个体间通常表现出较大的差异性，因而往往导致对特定药物实际鼻-脑递送潜力的低估。

使用异氟烷（诱导：4%，维持：2%）通过吸入式面罩对啮齿类动物实施吸入麻醉已得到广泛应用，旨在减轻或消除实验动物在手术过程中所经历的疼痛。使用面罩使得在吸入麻醉状态下通过皮下、腹腔和静脉途径对实验动物进行常规给药操作相对简便。然而，在进行鼻内给药时，需要暂时移除动物身上的面罩以便给药。在2%异氟烷维持麻醉的情况下，动物通常会迅速从麻醉状态中苏醒。当单次给药体积较大时，药液可能从鼻腔流入食管，因此对小型动物进行鼻内给药时，可能需要将单次大剂量拆分为多次小剂量给药。由于鼻内给药需要反复移除面罩，并确保有足够时间实现鼻腔内的持续递送，小鼠在给药过程中苏醒的可能性较高。这使得在稳定的麻醉状态下完成鼻内给药变得非常困难，并可能导致啮齿类动物中观察到的鼻-脑递送个体间差异。

因此，在本研究中，我们开发了两种在吸入麻醉下进行稳定经鼻给药的新方法，这些方法对实验动物造成的生理应激极小。第一种方法采用了一种可临时打开的面罩，在吸入麻醉过程中实现经鼻给药。该面罩的可开启部分包含一个硅胶塞，可根据给药时机打开，便于使用移液器稳定地进行经鼻给药。第二种方法通过手术将导管从食管插入鼻腔，并连接注射泵，从而在稳定的吸入麻醉条件下，将药物溶液直接且可靠地输送到鼻腔内。该方法可通过显著减少黏膜纤毛清除（MC）的影响，提高药物在鼻腔内的滞留，进而增强药物经鼻-脑通路向脑部的递送。此外，我们还描述了一种定量评估药物在脑内分布水平（每克脑组织中占注射剂量的百分比）的方法，采用放射性标记的[¹⁴C]-菊粉[分子量（MW）：5,000]作为水溶性大分子模型物质。

方案

本动物实验（#AP17P004）遵循日本东京日本大学动物护理与使用委员会批准的指南进行。本研究（#17-0001）已获日本大学药学院放射性同位素中心批准。

1. 用于吸入麻醉下经鼻给药的实验动物

1. 将实验小鼠饲养在不锈钢笼具中，置于12小时光照/12小时黑暗循环（光照时间：上午8:00至晚上8:00）的环境下，温度控制在23 ± 1°C，相对湿度维持在50% ± 10%，并 随意摄取 食物和水的获取
2. 实验前，先以4%异氟烷诱导，随后维持在2%异氟烷吸入麻醉。通过检测表面翻正反射消失来确认小鼠达到所需的麻醉深度。  

2. 给药溶液的制备

1. 用磷酸盐缓冲液稀释，配制 [¹⁴C]-菊粉的给药溶液（50 μM，每只小鼠 0.5 μCi/mL），4 °C 保存备用。

3. 小鼠鼻内给药

1. 使用可临时开启的吸入式面罩的微量移液器法（图1）
   注意：该技术是对Frey et al.³建立的使用微量移液器进行鼻内给药方案的改进
   1. 在2%异氟烷吸入麻醉下，将小鼠仰卧固定于软木板上，用胶带固定其四肢（图1A）。
   2. 在小鼠处于吸入麻醉固定状态下，交替向左、右鼻孔每次给予1–2 μL给药溶液，每隔30秒给药一次，每只小鼠总给药体积为25 μL（图1B和C）。
   3. 注意： 当面罩开启时，麻醉废气通过主动方式 （通风橱、硬管式生物安全柜、真空系统等）清除；当面罩关闭时，通过被动方式 （麻醉废气吸收罐）清除    
2. 经食管从气道侧进行逆行插管法（图2）
   注意：该技术是对Hirai et al.⁷建立的大鼠鼻内吸收方案的改进
   1. 在2%异氟烷吸入麻醉下，将小鼠仰卧固定于软木板上，用胶带固定其四肢。
   2. 使用剪刀做一小切口（1.5 cm）后，用镊子撑开颈部皮肤，剃除颈部毛发，并使用聚维酮碘或氯己定消毒，随后用酒精冲洗  。
   3. 剪开皮肤后，用镊子撑开喉部下方皮肤，暴露气管和食管。
   4. 使用剪刀在气管上做一1 mm切口。
   5. 将一根导管（内径：0.58 mm，外径：0.965 mm）插入至1.2 cm深度，并将导管另一端连接至吸入式面罩内部。
   6. 使用剪刀在食管上做一1 mm切口，将另一根导管（内径：0.28 mm，外径：0.61 mm）向鼻腔后部方向插入1.4 cm，并进行结扎固定（图2A和B）。
      注意：步骤3.2.2至3.2.4在体视显微镜下以×10放大倍数进行。
   7. 将一根针头（27G × 1/2）连接至装有给药溶液的1 mL注射器，并接入可编程微量注射泵。
   8. 将上述针头连接至步骤3.2.5中已插入食管的导管（图2C）。
   9. 以恒定速率（5 μL/min）给予总体积为25 μL的[¹⁴C]-菊粉溶液（图2C和2D）。

4. 使用放射性标记的水溶性大分子（[¹⁴C]-菊粉）进行定量实验

1. 在麻醉状态下处死实验小鼠 ，使用剪刀从延髓侧方打开颅骨，注意避免损伤脑组织。
2. 用微型刮匙从颅腔中小心刮取完整脑组织。
3. 将浸有生理盐水的滤纸置于冰上预冷的培养皿中。
4. 将取出的脑组织放置在湿润的滤纸上。
5. 用浸有生理盐水的棉签擦拭脑表面附着的血液，以尽量消除脑表面血液中[¹⁴C]-菊粉对实验结果的影响。
6. 迅速解剖脑组织，并将其分为三部分：嗅球、大脑和延髓（包括脑桥）。
7. 将脑组织样本置于组织消化液中，50 °C 下孵育 1 小时。
8. 向脑组织样本中加入 10 μL 液体闪烁液。
9. 取 25 μL 溶于闪烁液中的给药溶液，转移至闪烁瓶中，用于测定给药溶液的放射活性。
10. 使用配备适当³H与¹⁴C串扰校正功能的液体闪烁计数器，测定脑组织样本中[¹⁴C]放射活性的每分钟衰变数（[¹⁴C] X_brain）以及给药溶液中的每分钟衰变数（[¹⁴C] X_{IN dose}）。

5. 数据分析

1. 使用以下公式计算注射剂量（ID%）的药物分布水平（%）：
   ID%⁄g 脑组织 = ([¹⁴C] X_脑组织/[¹⁴C] X_{鼻腔给药剂量}) × 100，
   其中 X_脑组织（每克脑组织的计数/分钟，dpm/g 脑组织）为在脑组织中测得的[¹⁴C]-菊粉含量，X_{鼻腔给药剂量}（每25 μL溶液的计数/分钟，dpm/25 μL 溶液）为用于鼻腔给药的溶液中[¹⁴C]-菊粉的浓度。

结果

图3展示了本研究中采用两种不同鼻内给药方式后，嗅球（A）、大脑（B）和延髓（C）中[¹⁴C]-菊粉的含量（ID%⁄g 脑组织）。使用移液器法进行鼻内给药可在开放式吸入麻醉面罩条件下实现[¹⁴C]-菊粉向脑内的递送（图1）。在吸入麻醉状态下，定量结果显示出受试动物之间无明显的个体间差异，表现为标准误差较低。当采用食管反向插管鼻腔给药法在吸入麻醉条件下给予[¹⁴C]-菊粉时（图2），在嗅球（图3A）、大脑（图3B）和延髓（图3C）中检测到的[¹⁴C]-菊粉水平均显著高于移液器法。此外，在脑组织内部，参与鼻脑通路较为显著的嗅球和延髓中的[...

讨论

药物经鼻入脑递送有望对中枢神经系统疾病产生显著疗效，因为该途径提供了一条绕过血脑屏障（BBB）的直接转运路径。迄今为止，已有三种不同的经鼻入脑通路被报道⁸。第一种是嗅神经通路，该通路从鼻黏膜中的嗅黏膜经嗅神经到达前脑。第二种是三叉神经通路，该通路从鼻黏膜中的呼吸黏膜经三叉神经到达后脑的脑干。第三种是脑脊液（CSF）通路，通过脑脊液将物质分布至全脑。经鼻入脑通路在递送亲水性大分子药物方面受到了广泛关注，这类分子通常难以穿越血脑屏障，因此该通路被视为将生物药物递送至中枢神经系统的一种有效手段^8,9,10,11,12。然而，既往很少有研究明确描述用于小动物的鼻腔给药方法，以验证候选药物经由经鼻入脑通路的递送效果。因此，利用小动物开展与经鼻入脑药物递送机制相关的研究进展十分缓...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ddY小鼠	日本 SLC 公司		雄性，4–6 周龄，20–30 g
异氟烷	辉瑞	v002139
异氟烷装置设置	SHINANO制造有限公司	SN-487-OTAir，SN-489-4
异氟烷面罩	SHINANO 制造有限公司		对于小型啮齿类动物
异氟烷面罩（可开启型）	SHINANO 制造有限公司		特殊订单
麻醉箱	SHINANO 制造株式会社	SN-487-85-02
动物实验剪刀-1	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-27H
动物实验剪刀-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-13H
镊子-1	FINE SCIENCE TOOLS 公司	11272-30	Dumont #7 Dumoxel
镊子-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	A-12-1
导管管（PE-50）	Becton, Dickinson and Company	5069773	内径：0.58 mm，外径：0.965 mm
导管管（SP-10）	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	KN-392	内径：0.28 mm，外径：0.61 mm
夏弗	MARUKAN, LTD.	DC-381
体视显微镜	奥林巴斯株式会社	SZ61
27G 1/2 英寸 13 毫米针头	TERUMO CORPORATION	NN-2738R
1 mL 注射器	TERUMO CORPORATION	SS-01T
注射泵	神经科学	NE-1000
纤维素膜	东洋纺织会社有限公司	00011090
微型刮勺	Shimizu Akira Inc.	91-0088
微量移液器（0.5–10 μL）	Eppendorf AG	Z368083
移液芯片	Eppendorf AG	0030 000.811
胶带	TimeMed Labeling System, Inc.	T-534-R	用于固定小鼠
[14C]-聚果糖	American Radiolabeled Chemicals 公司	ARC0124A	0.1 mCi/mL
EtOH	和光纯药工业株式会社	054-00461
液体闪烁计数器	Perkin Elmer生命与分析科学公司	Tri-Carb 4810TR