本研究中，我们介绍了一种分离派尔集合淋巴结（Peyer's Patches, PPs）中淋巴细胞的新型且高效的方法，该方法可后续用于 体内 和 体外 功能检测以及滤泡辅助性T细胞和生发中心B细胞的流式细胞术研究。
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摘要
摘要
在肠道黏膜中，免疫细胞构成一个独特的免疫学实体，既能促进免疫耐受，又能同时抵御病原体的侵袭。已有充分证据表明，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）通过容纳多种效应性T细胞和B细胞亚群，在黏膜免疫网络中发挥着关键作用。其中一部分效应细胞，即滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心（GC）B细胞，专门负责调控体液免疫。因此，从分化程序和功能特性方面对PPs中的这些细胞亚群进行表征，可为理解黏膜免疫提供重要信息。为此，一种简便、高效且可重复的PPs淋巴细胞分离方法将对研究人员具有重要价值。在本研究中，我们旨在建立一种高效分离小鼠PPs淋巴细胞并获得高细胞得率的方法。我们的研究发现，初始组织处理步骤（如消化试剂的使用和组织振荡）、细胞染色条件以及抗体组合的选择，均对分离所得淋巴细胞的质量、细胞身份鉴定及实验结果具有显著影响。
本文介绍了一种实验方案，使研究人员能够高效地从小肠派伊尔结（Peyer's patches, PPs）中分离淋巴细胞群体，从而可重复地基于流式细胞术对T细胞和B细胞亚群进行分析，主要聚焦于 TFH 和生发中心B细胞（GC B cell）亚群。
引言
从起始到末端，整个胃肠道都分布着一个广泛的淋巴组织网络，其含有的免疫细胞数量超过人体和小鼠其他任何器官1。派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是该细胞免疫系统肠道分支——即肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue, GALT）的主要组成部分2,3。在PPs中，来源于食物成分、共生微生物群以及病原体的数十亿抗原被持续取样，并在必要时启动相应的免疫应答，从而维持肠道免疫稳态。从这一意义上讲，PPs可被称为"小肠的扁桃体"。PPs由多个主要亚区构成：位于上皮下的穹窿区（subepithelial dome, SED）、大型B细胞滤泡区；覆盖其上的滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）以及含有T细胞的滤泡间区域（interfollicular region, IFR）4。PPs这种独特的区室化结构使得不同效应细胞亚群能够协同作用，从而赋予肠道免疫应答能力。
PPs 缺乏传入淋巴管，因此从小肠运输到 PP 的抗原不会像大多数其他淋巴器官那样通过淋巴管传导。相反，位于 FAE 中的特化上皮细胞，即所谓的 M 细胞，负责将管腔内的抗原转运至 PP5。随后，这些被转运的抗原由位于 FAE 下方的上皮下穹窿区（SED）中的树突状细胞（DCs）和吞噬细胞摄取6,7。DCs 在 PP 中的这种抗原分选过程对于启动适应性免疫应答8以及后续产生分泌 IgA 的细胞9至关重要。
由于共生菌群和饮食物质带来的大量抗原负荷，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）内源性活化的效应T细胞和B细胞亚群（如滤泡辅助性T细胞和IgA）数量丰富+ 生发中心B细胞10，表明浆母细胞是活跃免疫反应的位点11. 在总CD4细胞中检测到高达20–25%的TFH细胞+ 在未免疫的年轻C57BL/6小鼠所采集的PPs中，T细胞区室及占总B细胞10–15%的生发中心B细胞是可能存在的12与其他辅助性T细胞类型相比（即.，Th1、Th2、Th17细胞）相比，TFH细胞由于表达CXCR5，可沿CXCL13浓度梯度迁移，从而特异性归巢至B细胞滤泡，表现出独特的趋向性13在派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）的B细胞滤泡区域，T滤泡辅助细胞（TFH细胞）诱导活化B细胞发生IgA类别转换重组和体细胞高频突变，进而分化为高亲和力IgA产生细胞。14随后，这些分泌抗体的浆细胞迁移至固有层（LP），并在肠道中调节免疫稳态。10.
在派伊尔集合淋巴结（PPs）中鉴定和表征滤泡辅助性T细胞（TFH）与生发中心B细胞（GC B cell）群体，可能使研究人员能够在稳态条件下研究体液免疫应答的动态变化，而无需依赖传统TFH-GC B细胞研究中耗时较长的免疫接种模型15,16,17,18。然而，对PPs中TFH细胞的分析并不像其他细胞亚群那样直接。技术上的挑战包括确定理想的组织制备条件、细胞表面抗体标记组合，以及选择适当的阳性和阴性对照。目前TFH细胞和PPs的研究领域在实验操作流程方面存在较大差异，由于多种原因，尚未形成共识以建立标准化的操作方案。首先，PPs中的各个细胞亚群对组织制备条件的反应各不相同，因此需要针对不同细胞亚群进行特异性优化。其次，已有文献报道的从PPs中制备细胞的具体方法存在显著差异。第三，针对PPs和TFH细胞研究中理想组织制备技术及实验条件的基于方案的比较研究数量仍然十分有限。
目前推荐用于PP细胞制备的基于方案的研究19,20,21,22并未针对TFH细胞或生发中心B细胞（GC B cell）展开。此外，某些先前推荐用于PP组织制备的条件19,20，例如基于胶原酶的消化方法，已被发现会负面影响通过流式细胞术鉴定TFH细胞的结果18。基于上述问题，我们认为，开发一种优化、标准化且可重复的实验方案，用于研究PP内TFH细胞与GC B细胞的动态变化，将对该领域的研究人员具有重要价值。这一需求促使我们建立了一种改进且最新的PP淋巴细胞分离与表征方案，该方案在细胞回收率、存活率以及对多种T细胞和B细胞亚群进行流式细胞术分析的效率方面均经过精细优化。同时，我们的目标还包括剔除以往方案中建议的若干繁琐的制备步骤，从而减少从PP组织中进行样本与细胞制备所需的操作流程和时间。
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方案
本方案中描述的所有研究和实验均根据贝斯以色列女执事医疗中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。
1. 实验设计与小鼠分组
- （可选）将实验小鼠同笼饲养，以促进实验小鼠间肠道微生物群的水平传播，并降低派伊尔集合淋巴结（PP）淋巴细胞中的非特异性变异。此外，使用同窝出生且性别相同的对照小鼠，以尽量减少个体差异。
2. 手术切除和组织制备步骤：
- 小肠（SI）的手术切除
- 使用 CO2 窒息法或机构动物伦理委员会批准的任何等效方法处死小鼠。
- 将小鼠转移至专门用于手术切除的区域。使其背部朝下放置，并用 70% 乙醇消毒腹部。沿中线从耻骨至肋骨处切开腹壁皮肤和腹膜，打开腹腔。
注意：首先在皮肤上做一小段切口，以避免穿透腹膜并损伤肠组织。继续切开至所需解剖边界。 - 识别盲肠，盲肠是检测回肠末端（小肠远端部分）的理想解剖标志。
注意：盲肠通常位于小鼠腹部的左下侧。 - 精确定位回盲交界处，并在此水平尽可能远端进行切割，以分离小肠与盲肠。在后续步骤中，避免过度接触肠壁，因为脆弱的派伊尔结（PPs）容易因触碰而塌陷。
- 用剪刀剪断肠系膜，轻柔地取出整个小肠直至幽门括约肌。识别幽门与十二指肠的交界处，并在此水平剪断十二指肠，从而完全将小肠从腹腔中分离。
注意：(i) 避免过度拉伸，以免导致肠壁破裂。(ii) 如果除派伊尔结淋巴细胞外还需分离固有层（LP）淋巴细胞，则必须完全去除肠系膜脂肪。然而，若仅用于派伊尔结分离，保留的肠系膜脂肪在后续分离步骤中可能提供一定益处，因此应予以保留。 - 将分离的小肠置于盛有冷 RPMI + 10% 胎牛血清（FBS）的 6 孔板中，并手动轻轻搅动组织，直至所有肠段均浸没于冷培养基中。在后续步骤中始终将组织置于冰上。
- 在解剖完所需数量的小鼠小肠后，继续从收集的小肠中进行派伊尔结的切除。
- 派伊尔结的手术切除及单细胞悬液制备：
- 用镊子夹住肠系膜脂肪，将小肠轻柔地转移至一张纸巾上，并使肠系膜面朝向纸巾。用冷 RPMI + 10% FBS 润湿整个肠段，以防止组织脱水和粘连。
注意：保留的肠系膜脂肪在此阶段可能有所帮助，因为小肠肠系膜面上的脂肪组织会粘附在纸巾上，使对侧（非肠系膜面）朝上。 - 识别派伊尔结，其在肠壁非肠系膜面呈白色多叶状聚集，形似“花椰菜”。
注意：在完成所有派伊尔结切除前，不建议冲洗肠腔内容物。排空肠腔内容物可能导致派伊尔结塌陷，并消除派伊尔结与肠壁之间的颜色对比，而这种对比对视觉识别派伊尔结非常有帮助。 - 在非肠系膜面识别派伊尔结后，将手术弯头剪刀置于派伊尔结上方（弯曲面朝上），从远端和近端两侧固定派伊尔结。
可选： 用指尖轻轻将派伊尔结推向剪刀刀刃。此操作有助于更好地排除周围非派伊尔结组织。轻柔切除派伊尔结，避免带入周围肠组织。
注意：(i) 此步骤至关重要，可在最大程度获取派伊尔结细胞的同时，最小化来自邻近肠区室（如固有层和肠上皮）的细胞污染，这些区域也富含 T 细胞。(ii) 从小鼠（C57BL/6 品系）切除的一段小肠中，通常可收集到 5–10 个派伊尔结（平均大小，多叶状）。若进一步收集更小的派伊尔结（非多叶状），使用本方案每只小鼠（C57BL/6）最多可收集 12–13 个派伊尔结。 - 用镊子或弯头手术剪将切除的派伊尔结转移至盛有冰冻 RPMI + 10% FBS 的 12 孔细胞培养板中，并置于冰上保存。
注意：(i) 派伊尔结切除后应立即用纸巾轻轻擦拭其表面，以清除黏液和肠内容物。此步骤有助于提高派伊尔结淋巴细胞的存活率。(ii) 除转移至培养板外，也可根据总样本数量考虑将派伊尔结转移至独立的离心管中。 - 可选：当派伊尔结切除并转移至培养板后，可通过拍摄含派伊尔结的培养板照片，记录不同实验组或小鼠组所收集派伊尔结的数量和大小。
- 准备若干 50 mL 圆锥形离心管，每管加入 25 mL 预热至 37 °C 的 RPMI + 10% FBS。用剪刀剪去 1,000 µL 枪头的尖端，使其开口大小适中，便于用 1 mL 移液器吸取派伊尔结。用 1 mL 移液器吸取派伊尔结，并将其从 12 孔细胞培养板转移至已准备好的 50 mL 圆锥形离心管中。
注意：每个小鼠样本应使用新的枪头，以避免样本间的交叉污染。 - 盖紧管盖，将离心管垂直置于 37 °C 摇床中，以 125–150 rpm 连续振荡 10 分钟。同时，准备另一组 50 mL 离心管，并在每管顶部放置 40 µm 细胞筛网，用于制备单细胞悬液。
注意：(i) 振荡步骤可去除残留的肠内容物、黏液和细胞碎片，若不除去这些物质，会降低派伊尔结淋巴细胞的存活率和回收率。(ii) 不得对派伊尔结组织使用任何消化酶，因为消化过程会导致细胞表面 CXCR5 表达显著下降。 - 振荡结束后，将派伊尔结转移至放置在新制备的 50 mL 圆锥形离心管顶部的 40 µm 细胞筛网上。使用 10 mL 注射器活塞的圆头端，轻柔地将派伊尔结压过细胞筛网，以获得单细胞悬液。用 15–20 mL 冷 RPMI + 10% FBS 冲洗筛网。
注意：(i) 过滤前，水平轻摇含有派伊尔结的离心管。这一短暂摇动有助于将派伊尔结转移至细胞筛网中。(ii) 建议使用 70 µm 细胞筛网分离非淋巴样免疫细胞（例如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）。 - 将单细胞悬液在 4 °C 条件下以 350–400 x g 离心 10 分钟。
- 小心弃去上清液，将细胞重悬于浓度为 10 x 106 细胞/mL 的溶液中。使用血细胞计数板进行细胞计数。
注意：(i) 在细胞计数前，可通过以下公式大致估算每只小鼠派伊尔结组的总细胞数：“0.5–1 x 106 细胞 x（派伊尔结数量）= 总细胞数”。细胞计数时可能需要进一步用台盼蓝稀释。(ii) 除手动计数外，也可使用自动细胞计数仪。 - 将 2–2.5 x 106 个细胞（以适当体积，例如，200 µL）转移至 96 孔圆底板中。
注意：对于单色染色和阴性对照样本，0.5–1 x 106 个细胞可能已足够。 - 在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。轻弹板子。
- 用 200 µL 染色缓冲液洗涤细胞。
- 用镊子夹住肠系膜脂肪，将小肠轻柔地转移至一张纸巾上，并使肠系膜面朝向纸巾。用冷 RPMI + 10% FBS 润湿整个肠段，以防止组织脱水和粘连。
3. 表面抗体染色
- 活力染色：
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 100 μL 用 PBS 稀释的可固定活力染料（1:1,000）中，在冰上或 4 °C 避光孵育 30 分钟。
注意：（i）检测 Foxp3 或 Bcl-6 等关键转录因子的胞内染色需要对细胞进行固定。在此情况下，不可固定的活细胞染料（例如., 7-AAD、DAPI）无法使用。（ii）稀释可固定活力染料时，切勿使用任何含有蛋白质的染色缓冲液。此步骤中使用的培养基必须无蛋白质。（iii）通过活力染色排除死细胞至关重要，因为死细胞在流式细胞术分析中会发出自发荧光，并非特异性结合表面抗体，可能导致严重的实验技术问题和假阳性结果。 - 用染色缓冲液洗涤细胞两次。在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。轻弹培养板。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 100 μL 用 PBS 稀释的可固定活力染料（1:1,000）中，在冰上或 4 °C 避光孵育 30 分钟。
- Fc封闭与表面标记-第一层
- 通过将抗 CD16/32 抗体以 1:200 比例稀释于染色缓冲液中，制备 Fc 封闭溶液 缓冲液
- 将细胞重悬于20 μL预配的Fc阻断液中，冰上孵育15分钟。
- 不进行洗涤，直接加入 80 μL 表面抗体混合液（参见 表1 （针对抗体摘要）以适当稀释度配制，冰上孵育至少30分钟。
- 洗涤两次，加入过量染色液 缓冲液。在 4 °C 下以 350 x g 离心 5 分钟。轻弹培养板。
- 表面层 II：
- 用染色缓冲液稀释荧光素标记的链霉亲和素，制备链霉亲和素染色液。
- 最后一次洗涤后，加入100 μL预稀释的链霉亲和素（1:100）染色液重悬细胞。冰上避光孵育至少15分钟。
- 用染色缓冲液洗涤两次，350 × g 离心 5 分钟，4°C。轻弹培养板。
可选：如需进行滤泡内细胞内染色 若无需检测调节性T细胞，最后一次洗涤后，将细胞重悬于200 μL染色缓冲液中，转移至合适的流式管中，用于流式细胞仪检测。若样本未固定，应在3–4小时内完成流式细胞术的数据采集，以获得准确结果。
4. 细胞固定
- 使用Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒中的试剂配制固定/破膜（Fix/Perm）工作液。将一份固定/破膜浓缩液与三份固定/破膜稀释液混合，得到所需体积的终工作液。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于200 μL Fix/Perm工作液中。
- 将板置于冰上或4 °C孵育20分钟。此步骤不得超过20分钟，过长的孵育时间可能导致细胞回收率显著下降。
- 在4 °C下以350 x g离心5分钟。轻弹板子去除上清。（可选）此步骤后，固定的细胞可在含有牛血清白蛋白（BSA）或胎牛血清（FBS）的染色缓冲液中于4 °C保存数天，直至进行后续的胞内染色或流式细胞术检测。
- 将细胞重悬于200 μL破膜缓冲液（x1）中，该缓冲液需用纯化去离子水新鲜预稀释。
- 在室温 (RT)下以350 x g离心5分钟。
- 用200 μL破膜缓冲液洗涤一次，并在室温下以350 x g离心5分钟。
5. 胞内染色
- 通过将抗 CD16/32 抗体以 1:200 比例稀释于破膜缓冲液中，制备 Fc 阻断溶液。
注意：固定步骤完成后，细胞必须始终保存在破膜缓冲液中，直至胞内染色过程结束。 - 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 20 μL Fc 阻断溶液中，室温避光孵育 10–15 分钟。
- 无需洗涤，直接加入 80 μL 已预先用破膜缓冲液稀释的胞内抗体混合液（终体积为 100 μL），室温孵育 30 分钟。
- 加入 100 μL 破膜缓冲液，于室温以 350 × g 离心 5 分钟。
- 用 200 μL 破膜缓冲液洗涤一次，于室温以 350 × g 离心 5 分钟。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 200 μL 染色缓冲液中，并转移至适当的管中（染色缓冲液终体积为 400 μL），通过流式细胞术获取数据。若使用配备微孔板读板功能的流式细胞仪，染色后的 96 孔板样品也可 直接上机检测，无需转移至管中。此步骤可最大限度减少细胞转移过程中的损失。
- 在流式细胞仪上至少采集 5 × 105 个总细胞，以便对滤泡辅助性 T 细胞（TFH）、滤泡调节性 T 细胞（TFR）以及生发中心 B 细胞（GC B 细胞）进行可重复的分析。
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结果
与之前的一项方案相比20我们观察到，PPs 在小肠（SI）内并非均匀分布，而是更密集地分布于小肠远端和近端，如图所示。 图1A. 流式细胞术分析显示，若严格按照本方案操作，所获得的PP淋巴细胞群体表现出与脾细胞相似的前向-侧向散射分布（图 2A，E， 和 二维，H）与 >95% 细胞活力图2B 和 2F）。与其他次级淋巴器官（SLOs）相比，在C57BL/6小鼠中，约70–80%的肠集合淋巴结（PP）总淋巴细胞为B细胞，而CD4+ T细胞仅占全部PP淋巴细胞的10–15%图2C<...
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讨论
在此，我们描述了一种针对滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心B细胞（GC B细胞）流式细胞术表征的优化方案。本方案的主要优势之一在于，能够从单个样本中分离出多达10^6个细胞7 （平均 4–5 x 106 细胞）单只小鼠（C57BL/6品系）的总PP细胞，无需任何消化处理。我们观察到，总细胞得率与PP数量呈正相关，并可通过以下简单公式进行估算，有助于实验设计： "总PP细胞数 每 小鼠 = 0.5–1 ×（切除的PP数量） 每 小鼠) × 106"。该高细胞得率伴随着细胞活性的显著提高（>95%）。改进后的细胞回收率和存活率使得能够并行使用多种抗体染色组合，对 PPs 中各类淋巴细胞亚群进行流式细胞术分析。
与 De Jesus et al.20 最近发表的 PP 分离方案以及先前的报道19,
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Laura Strauss和Peter Sage在流式细胞术分析方面的有益讨论和支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗小鼠 CD4 抗体 | eBioscience，Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 CD19 抗体 | eBioscience | MA5-16536 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 PD-1 抗体 | eBioscience | 61-9985-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 ICOS 抗体 | eBioscience | 12-9942-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠GL7抗体 | Biolegend | 144610 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 CXCR5 抗体 | Biolegend*，BD Bioscience | 145512*, 551960 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 BCL-6 抗体 | Biolegend | 358512 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 Foxp3 抗体 | eBioscience | 17-5773-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 链霉亲和素-BV421 | BD生物科学 | 563259 | 详细信息见表1 |
| 可固定活力染料 | eBioscience | L34957 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | 有关详细信息，请参见表1 |
| Fc阻断剂（CD16/32） | BD生物科学 | 553141 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 胶原酶II | 沃辛顿 | LS004176 | |
| 胶原酶IV | 沃辛顿 | LS004188 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6孔，12孔 &和 96 孔板 | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL 一次性离心管 | Falcon | 3520 | |
| 40 µm细胞滤筛 | Falcon | 352340 | |
| 10 mL 注射器-推杆 | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | 康宁 | 15-040-CV | |
| PBS | 康宁 | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 轨道摇床 | VWR | Model 200 | |
| 弯头剪刀 | |||
| 精细有齿镊 | |||
| 小型弯剪 |
参考文献
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