本研究中，我们介绍了一种分离派尔集合淋巴结（Peyer's Patches, PPs）中淋巴细胞的新型且高效的方法，该方法可后续用于 体内 和 体外 功能检测以及滤泡辅助性T细胞和生发中心B细胞的流式细胞术研究。
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本文内容
摘要
摘要
在肠道黏膜中，免疫细胞构成一个独特的免疫学实体，既能促进免疫耐受，又能同时抵御病原体的侵袭。已有充分证据表明，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）通过容纳多种效应性T细胞和B细胞亚群，在黏膜免疫网络中发挥着关键作用。其中一部分效应细胞，即滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心（GC）B细胞，专门负责调控体液免疫。因此，从分化程序和功能特性方面对PPs中的这些细胞亚群进行表征，可为理解黏膜免疫提供重要信息。为此，一种简便、高效且可重复的PPs淋巴细胞分离方法将对研究人员具有重要价值。在本研究中，我们旨在建立一种高效分离小鼠PPs淋巴细胞并获得高细胞得率的方法。我们的研究发现，初始组织处理步骤（如消化试剂的使用和组织振荡）、细胞染色条件以及抗体组合的选择，均对分离所得淋巴细胞的质量、细胞身份鉴定及实验结果具有显著影响。
本文介绍了一种实验方案，使研究人员能够高效地从小肠派伊尔结（Peyer's patches, PPs）中分离淋巴细胞群体，从而可重复地基于流式细胞术对T细胞和B细胞亚群进行分析，主要聚焦于 TFH 和生发中心B细胞（GC B cell）亚群。
引言
从起始到末端，整个胃肠道都分布着一个广泛的淋巴组织网络，其含有的免疫细胞数量超过人体和小鼠其他任何器官1。派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是该细胞免疫系统肠道分支——即肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue, GALT）的主要组成部分2,3。在PPs中，来源于食物成分、共生微生物群以及病原体的数十亿抗原被持续取样，并在必要时启动相应的免疫应答，从而维持肠道免疫稳态。从这一意义上讲，PPs可被称为"小肠的扁桃体"。PPs由多个主要亚区构成：位于上皮下的穹窿区（subepithelial dome, SED）、大型B细胞滤泡区；覆盖其上的滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）以及含有T细胞的滤泡间区域（interfollicular region, IFR）4。PPs这种独特的区室化结构使得不同效应细胞亚群能够协同作用，从而赋予肠道免疫应答能力。
PPs 缺乏传入淋巴管，因此从小肠运输到 PP 的抗原不会像大多数其他淋巴器官那样通过淋巴管传导。相反，位于 FAE 中的特化上皮细胞，即所谓的 M 细胞，负责将管腔内的抗原转运至 PP
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方案
本方案中描述的所有研究和实验均根据贝斯以色列女执事医疗中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。
1. 实验设计与小鼠分组
- （可选）将实验小鼠同笼饲养，以促进实验小鼠间肠道微生物群的水平传播，并降低派伊尔集合淋巴结（PP）淋巴细胞中的非特异性变异。此外，使用同窝出生且性别相同的对照小鼠，以尽量减少个体差异。
2. 手术切除和组织制备步骤：
- 小肠（SI）的手术切除
- 使用 CO2 窒息法或机构动物伦理委员会批准的任何等效方法处死小鼠。
- 将小鼠转移至专门用于手术切除的区域。使其背部朝下放置，并用 70% 乙醇消毒腹部。沿中线从耻骨至肋骨处切开腹壁皮肤和腹膜，打开腹腔。
注意：首先在皮肤上做一小段切口，以避免穿透腹膜并损伤肠组织。继续切开至所需解剖边界。 - 识别盲肠，盲肠是检测回肠末端（小肠远端部分）的理想解剖标志。
注意：盲肠通常位于小鼠腹部的左下侧。 - 精确定位回盲交界处，并在此水平尽可能远端进行切割，以分离小肠与盲肠。在后续步骤中，避免过度接触肠壁，因为脆弱的派伊尔结（PPs）容易因触碰而塌陷。
- 用剪刀剪断肠系膜，轻柔地取出整个小肠直至幽门括约肌。识别幽门与十二指肠的交界处，并在此水平剪断十....
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结果
与之前的一项方案相比20我们观察到，PPs 在小肠（SI）内并非均匀分布，而是更密集地分布于小肠远端和近端，如图所示。 图1A. 流式细胞术分析显示，若严格按照本方案操作，所获得的PP淋巴细胞群体表现出与脾细胞相似的前向-侧向散射分布（图 2A，E， 和 二维，H）与 >95% 细胞活力图2B 和 2F）。与其他次级淋巴器官（SLOs）相比，在C57BL/6小鼠中，约70–80%的肠集合淋巴结（PP）总淋巴细胞为B细胞，而CD4+ T细胞仅占全部PP淋巴细胞的10–15%图2C<.......
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讨论
在此，我们描述了一种针对滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心B细胞（GC B细胞）流式细胞术表征的优化方案。本方案的主要优势之一在于，能够从单个样本中分离出多达10^6个细胞7 （平均 4–5 x 106 细胞）单只小鼠（C57BL/6品系）的总PP细胞，无需任何消化处理。我们观察到，总细胞得率与PP数量呈正相关，并可通过以下简单公式进行估算，有助于实验设计： "总PP细胞数 每 小鼠 = 0.5–1 ×（切除的PP数量） 每 小鼠) × 106"。该高细胞得率伴随着细胞活性的显著提高（>95%）。改进后的细胞回收率和存活率使得能够并行使用多种抗体染色组合，对 PPs 中各类淋巴细胞亚群进行流式细胞术分析。
与 De Jesus et al.20 最近发表的 PP 分离方案以及先前的报道19,
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Laura Strauss和Peter Sage在流式细胞术分析方面的有益讨论和支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗小鼠 CD4 抗体 | eBioscience，Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 CD19 抗体 | eBioscience | MA5-16536 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 PD-1 抗体 | eBioscience | 61-9985-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 ICOS 抗体 | eBioscience | 12-9942-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠GL7抗体 | Biolegend | 144610 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 CXCR5 抗体 | Biolegend*，BD Bioscience | 145512*, 551960 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 BCL-6 抗体 | Biolegend | 358512 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 Foxp3 抗体 | eBioscience | 17-5773-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 链霉亲和素-BV421 | BD生物科学 | 563259 | 详细信息见表1 |
| 可固定活力染料 | eBioscience | L34957 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | 有关详细信息，请参见表1 |
| Fc阻断剂（CD16/32） | BD生物科学 | 553141 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 胶原酶II | 沃辛顿 | LS004176 | |
| 胶原酶IV | 沃辛顿 | LS004188 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6孔，12孔 &和 96 孔板 | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL 一次性离心管 | Falcon | 3520 | |
| 40 µm细胞滤筛 | Falcon | 352340 | |
| 10 mL 注射器-推杆 | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | 康宁 | 15-040-CV | |
| PBS | 康宁 | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 轨道摇床 | VWR | Model 200 | |
| 弯头剪刀 | |||
| 精细有齿镊 | |||
| 小型弯剪 |
参考文献
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W.
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