本研究中，我们介绍了一种分离派尔集合淋巴结（Peyer's Patches, PPs）中淋巴细胞的新型且高效的方法，该方法可后续用于 体内 和 体外 功能检测以及滤泡辅助性T细胞和生发中心B细胞的流式细胞术研究。
本文内容
摘要
摘要
在肠道黏膜中，免疫细胞构成一个独特的免疫学实体，既能促进免疫耐受，又能同时抵御病原体的侵袭。已有充分证据表明，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）通过容纳多种效应性T细胞和B细胞亚群，在黏膜免疫网络中发挥着关键作用。其中一部分效应细胞，即滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心（GC）B细胞，专门负责调控体液免疫。因此，从分化程序和功能特性方面对PPs中的这些细胞亚群进行表征，可为理解黏膜免疫提供重要信息。为此，一种简便、高效且可重复的PPs淋巴细胞分离方法将对研究人员具有重要价值。在本研究中，我们旨在建立一种高效分离小鼠PPs淋巴细胞并获得高细胞得率的方法。我们的研究发现，初始组织处理步骤（如消化试剂的使用和组织振荡）、细胞染色条件以及抗体组合的选择，均对分离所得淋巴细胞的质量、细胞身份鉴定及实验结果具有显著影响。
本文介绍了一种实验方案，使研究人员能够高效地从小肠派伊尔结（Peyer's patches, PPs）中分离淋巴细胞群体，从而可重复地基于流式细胞术对T细胞和B细胞亚群进行分析，主要聚焦于 TFH 和生发中心B细胞（GC B cell）亚群。
引言
从起始到末端，整个胃肠道都分布着一个广泛的淋巴组织网络，其含有的免疫细胞数量超过人体和小鼠其他任何器官1。派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是该细胞免疫系统肠道分支——即肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue, GALT）的主要组成部分2,3。在PPs中，来源于食物成分、共生微生物群以及病原体的数十亿抗原被持续取样，并在必要时启动相应的免疫应答，从而维持肠道免疫稳态。从这一意义上讲，PPs可被称为"小肠的扁桃体"。PPs由多个主要亚区构成：位于上皮下的穹窿区（subepithelial dome, SED）、大型B细胞滤泡区；覆盖其上的滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）以及含有T细胞的滤泡间区域（interfollicular region, IFR）4。PPs这种独特的区室化结构使得不同效应细胞亚群能够协同作用，从而赋予肠道免疫应答能力。
PPs 缺乏传入淋巴管，因此从小肠运输到 PP 的抗原不会像大多数其他淋巴器官那样通过淋巴管传导。相反，位于 FAE 中的特化上皮细胞，即所谓的 M 细胞，负责将管腔内的抗原转运至 PP5。随后，这些被转运的抗原由位于 FAE 下方的上皮下穹窿区（SED）中的树突状细胞（DCs）和吞噬细胞摄取6,7。DCs 在 PP 中的这种抗原分选过程对于启动适应性免疫应答8以及后续产生分泌 IgA 的细胞9至关重要。
由于共生菌群和饮食物质带来的大量抗原负荷，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）内源性活化的效应T细胞和B细胞亚群（如滤泡辅助性T细胞和IgA）数量丰富+ 生发中心B细胞10，表明浆母细胞是活跃免疫反应的位点11. 在总CD4细胞中检测到高达20–25%的TFH细胞+ 在未免疫的年轻C57BL/6小鼠所采集的PPs中，T细胞区室及占总B细胞10–15%的生发中心B细胞是可能存在的12与其他辅助性T细胞类型相比（即.，Th1、Th2、Th17细胞）相比，TFH细胞由于表达CXCR5，可沿CXCL13浓度梯度迁移，从而特异性归巢至B细胞滤泡，表现出独特的趋向性13在派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）的B细胞滤泡区域，T滤泡辅助细胞（TFH细胞）诱导活化B细胞发生IgA类别转换重组和体细胞高频突变，进而分化为高亲和力IgA产生细胞。14随后，这些分泌抗体的浆细胞迁移至固有层（LP），并在肠道中调节免疫稳态。10.
在派伊尔集合淋巴结（PPs）中鉴定和表征滤泡辅助性T细胞（TFH）与生发中心B细胞（GC B cell）群体，可能使研究人员能够在稳态条件下研究体液免疫应答的动态变化，而无需依赖传统TFH-GC B细胞研究中耗时较长的免疫接种模型15,16,17,18。然而，对PPs中TFH细胞的分析并不像其他细胞亚群那样直接。技术上的挑战包括确定理想的组织制备条件、细胞表面抗体标记组合，以及选择适当的阳性和阴性对照。目前TFH细胞和PPs的研究领域在实验操作流程方面存在较大差异，由于多种原因，尚未形成共识以建立标准化的操作方案。首先，PPs中的各个细胞亚群对组织制备条件的反应各不相同，因此需要针对不同细胞亚群进行特异性优化。其次，已有文献报道的从PPs中制备细胞的具体方法存在显著差异。第三，针对PPs和TFH细胞研究中理想组织制备技术及实验条件的基于方案的比较研究数量仍然十分有限。
目前推荐用于PP细胞制备的基于方案的研究19,20,21,22并未针对TFH细胞或生发中心B细胞（GC B cell）展开。此外，某些先前推荐用于PP组织制备的条件19,20，例如基于胶原酶的消化方法，已被发现会负面影响通过流式细胞术鉴定TFH细胞的结果18。基于上述问题，我们认为，开发一种优化、标准化且可重复的实验方案，用于研究PP内TFH细胞与GC B细胞的动态变化，将对该领域的研究人员具有重要价值。这一需求促使我们建立了一种改进且最新的PP淋巴细胞分离与表征方案，该方案在细胞回收率、存活率以及对多种T细胞和B细胞亚群进行流式细胞术分析的效率方面均经过精细优化。同时，我们的目标还包括剔除以往方案中建议的若干繁琐的制备步骤，从而减少从PP组织中进行样本与细胞制备所需的操作流程和时间。
方案
本方案中描述的所有研究和实验均根据贝斯以色列女执事医疗中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。
1. 实验设计与小鼠分组
- （可选）将实验小鼠同笼饲养，以促进实验小鼠间肠道微生物群的水平传播，并降低派伊尔集合淋巴结（PP）淋巴细胞中的非特异性变异。此外，使用同窝出生且性别相同的对照小鼠，以尽量减少个体差异。
2. 手术切除和组织制备步骤：
- 小肠（SI）的手术切除
- 使用 CO2 窒息法或机构动物伦理委员会批准的任何等效方法处死小鼠。
- 将小鼠转移至专门用于手术切除的区域。使其背部朝下放置，并用 70% 乙醇消毒腹部。沿中线从耻骨至肋骨处切开腹壁皮肤和腹膜，打开腹腔。
注意：首先在皮肤上做一小段切口，以避免穿透腹膜并损伤肠组织。继续切开至所需解剖边界。 - 识别盲肠，盲肠是检测回肠末端（小肠远端部分）的理想解剖标志。
注意：盲肠通常位于小鼠腹部的左下侧。 - 精确定位回盲交界处，并在此水平尽可能远端进行切割，以分离小肠与盲肠。在后续步骤中，避免过度接触肠壁，因为脆弱的派伊尔结（PPs）容易因触碰而塌陷。
- 用剪刀剪断肠系膜，轻柔地取出整个小肠直至幽门括约肌。识别幽门与十二指肠的交界处，并在此水平剪断十二指肠，从而完全将小肠从腹腔中分离。
注意：(i) 避免过度拉伸，以免导致肠壁破裂。(ii) 如果除派伊尔结淋巴细胞外还需分离固有层（LP）淋巴细胞，则必须完全去除肠系膜脂肪。然而，若仅用于派伊尔结分离，保留的肠系膜脂肪在后续分离步骤中可能提供一定益处，因此应予以保留。 - 将分离的小肠置于盛有冷 RPMI + 10% 胎牛血清（FBS）的 6 孔板中，并手动轻轻搅动组织，直至所有肠段均浸没于冷培养基中。在后续步骤中始终将组织置于冰上。
- 在解剖完所需数量的小鼠小肠后，继续从收集的小肠中进行派伊尔结的切除。
- 派伊尔结的手术切除及单细胞悬液制备：
- 用镊子夹住肠系膜脂肪，将小肠轻柔地转移至一张纸巾上，并使肠系膜面朝向纸巾。用冷 RPMI + 10% FBS 润湿整个肠段，以防止组织脱水和粘连。
注意：保留的肠系膜脂肪在此阶段可能有所帮助，因为小肠肠系膜面上的脂肪组织会粘附在纸巾上，使对侧（非肠系膜面）朝上。 - 识别派伊尔结，其在肠壁非肠系膜面呈白色多叶状聚集，形似“花椰菜”。
注意：在完成所有派伊尔结切除前，不建议冲洗肠腔内容物。排空肠腔内容物可能导致派伊尔结塌陷，并消除派伊尔结与肠壁之间的颜色对比，而这种对比对视觉识别派伊尔结非常有帮助。 - 在非肠系膜面识别派伊尔结后，将手术弯头剪刀置于派伊尔结上方（弯曲面朝上），从远端和近端两侧固定派伊尔结。
可选： 用指尖轻轻将派伊尔结推向剪刀刀刃。此操作有助于更好地排除周围非派伊尔结组织。轻柔切除派伊尔结，避免带入周围肠组织。
注意：(i) 此步骤至关重要，可在最大程度获取派伊尔结细胞的同时，最小化来自邻近肠区室（如固有层和肠上皮）的细胞污染，这些区域也富含 T 细胞。(ii) 从小鼠（C57BL/6 品系）切除的一段小肠中，通常可收集到 5–10 个派伊尔结（平均大小，多叶状）。若进一步收集更小的派伊尔结（非多叶状），使用本方案每只小鼠（C57BL/6）最多可收集 12–13 个派伊尔结。 - 用镊子或弯头手术剪将切除的派伊尔结转移至盛有冰冻 RPMI + 10% FBS 的 12 孔细胞培养板中，并置于冰上保存。
注意：(i) 派伊尔结切除后应立即用纸巾轻轻擦拭其表面，以清除黏液和肠内容物。此步骤有助于提高派伊尔结淋巴细胞的存活率。(ii) 除转移至培养板外，也可根据总样本数量考虑将派伊尔结转移至独立的离心管中。 - 可选：当派伊尔结切除并转移至培养板后，可通过拍摄含派伊尔结的培养板照片，记录不同实验组或小鼠组所收集派伊尔结的数量和大小。
- 准备若干 50 mL 圆锥形离心管，每管加入 25 mL 预热至 37 °C 的 RPMI + 10% FBS。用剪刀剪去 1,000 µL 枪头的尖端，使其开口大小适中，便于用 1 mL 移液器吸取派伊尔结。用 1 mL 移液器吸取派伊尔结，并将其从 12 孔细胞培养板转移至已准备好的 50 mL 圆锥形离心管中。
注意：每个小鼠样本应使用新的枪头，以避免样本间的交叉污染。 - 盖紧管盖，将离心管垂直置于 37 °C 摇床中，以 125–150 rpm 连续振荡 10 分钟。同时，准备另一组 50 mL 离心管，并在每管顶部放置 40 µm 细胞筛网，用于制备单细胞悬液。
注意：(i) 振荡步骤可去除残留的肠内容物、黏液和细胞碎片，若不除去这些物质，会降低派伊尔结淋巴细胞的存活率和回收率。(ii) 不得对派伊尔结组织使用任何消化酶，因为消化过程会导致细胞表面 CXCR5 表达显著下降。 - 振荡结束后，将派伊尔结转移至放置在新制备的 50 mL 圆锥形离心管顶部的 40 µm 细胞筛网上。使用 10 mL 注射器活塞的圆头端，轻柔地将派伊尔结压过细胞筛网，以获得单细胞悬液。用 15–20 mL 冷 RPMI + 10% FBS 冲洗筛网。
注意：(i) 过滤前，水平轻摇含有派伊尔结的离心管。这一短暂摇动有助于将派伊尔结转移至细胞筛网中。(ii) 建议使用 70 µm 细胞筛网分离非淋巴样免疫细胞（例如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞）。 - 将单细胞悬液在 4 °C 条件下以 350–400 x g 离心 10 分钟。
- 小心弃去上清液，将细胞重悬于浓度为 10 x 106 细胞/mL 的溶液中。使用血细胞计数板进行细胞计数。
注意：(i) 在细胞计数前，可通过以下公式大致估算每只小鼠派伊尔结组的总细胞数：“0.5–1 x 106 细胞 x（派伊尔结数量）= 总细胞数”。细胞计数时可能需要进一步用台盼蓝稀释。(ii) 除手动计数外，也可使用自动细胞计数仪。 - 将 2–2.5 x 106 个细胞（以适当体积，例如，200 µL）转移至 96 孔圆底板中。
注意：对于单色染色和阴性对照样本，0.5–1 x 106 个细胞可能已足够。 - 在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。轻弹板子。
- 用 200 µL 染色缓冲液洗涤细胞。
- 用镊子夹住肠系膜脂肪，将小肠轻柔地转移至一张纸巾上，并使肠系膜面朝向纸巾。用冷 RPMI + 10% FBS 润湿整个肠段，以防止组织脱水和粘连。
3. 表面抗体染色
- 活力染色：
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 100 μL 用 PBS 稀释的可固定活力染料（1:1,000）中，在冰上或 4 °C 避光孵育 30 分钟。
注意：（i）检测 Foxp3 或 Bcl-6 等关键转录因子的胞内染色需要对细胞进行固定。在此情况下，不可固定的活细胞染料（例如., 7-AAD、DAPI）无法使用。（ii）稀释可固定活力染料时，切勿使用任何含有蛋白质的染色缓冲液。此步骤中使用的培养基必须无蛋白质。（iii）通过活力染色排除死细胞至关重要，因为死细胞在流式细胞术分析中会发出自发荧光，并非特异性结合表面抗体，可能导致严重的实验技术问题和假阳性结果。 - 用染色缓冲液洗涤细胞两次。在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。轻弹培养板。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 100 μL 用 PBS 稀释的可固定活力染料（1:1,000）中，在冰上或 4 °C 避光孵育 30 分钟。
- Fc封闭与表面标记-第一层
- 通过将抗 CD16/32 抗体以 1:200 比例稀释于染色缓冲液中，制备 Fc 封闭溶液 缓冲液
- 将细胞重悬于20 μL预配的Fc阻断液中，冰上孵育15分钟。
- 不进行洗涤，直接加入 80 μL 表面抗体混合液（参见 表1 （针对抗体摘要）以适当稀释度配制，冰上孵育至少30分钟。
- 洗涤两次，加入过量染色液 缓冲液。在 4 °C 下以 350 x g 离心 5 分钟。轻弹培养板。
- 表面层 II：
- 用染色缓冲液稀释荧光素标记的链霉亲和素，制备链霉亲和素染色液。
- 最后一次洗涤后，加入100 μL预稀释的链霉亲和素（1:100）染色液重悬细胞。冰上避光孵育至少15分钟。
- 用染色缓冲液洗涤两次，350 × g 离心 5 分钟，4°C。轻弹培养板。
可选：如需进行滤泡内细胞内染色 若无需检测调节性T细胞，最后一次洗涤后，将细胞重悬于200 μL染色缓冲液中，转移至合适的流式管中，用于流式细胞仪检测。若样本未固定，应在3–4小时内完成流式细胞术的数据采集，以获得准确结果。
4. 细胞固定
- 使用Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒中的试剂配制固定/破膜（Fix/Perm）工作液。将一份固定/破膜浓缩液与三份固定/破膜稀释液混合，得到所需体积的终工作液。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于200 μL Fix/Perm工作液中。
- 将板置于冰上或4 °C孵育20分钟。此步骤不得超过20分钟，过长的孵育时间可能导致细胞回收率显著下降。
- 在4 °C下以350 x g离心5分钟。轻弹板子去除上清。（可选）此步骤后，固定的细胞可在含有牛血清白蛋白（BSA）或胎牛血清（FBS）的染色缓冲液中于4 °C保存数天，直至进行后续的胞内染色或流式细胞术检测。
- 将细胞重悬于200 μL破膜缓冲液（x1）中，该缓冲液需用纯化去离子水新鲜预稀释。
- 在室温 (RT)下以350 x g离心5分钟。
- 用200 μL破膜缓冲液洗涤一次，并在室温下以350 x g离心5分钟。
5. 胞内染色
- 通过将抗 CD16/32 抗体以 1:200 比例稀释于破膜缓冲液中，制备 Fc 阻断溶液。
注意：固定步骤完成后，细胞必须始终保存在破膜缓冲液中，直至胞内染色过程结束。 - 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 20 μL Fc 阻断溶液中，室温避光孵育 10–15 分钟。
- 无需洗涤，直接加入 80 μL 已预先用破膜缓冲液稀释的胞内抗体混合液（终体积为 100 μL），室温孵育 30 分钟。
- 加入 100 μL 破膜缓冲液，于室温以 350 × g 离心 5 分钟。
- 用 200 μL 破膜缓冲液洗涤一次，于室温以 350 × g 离心 5 分钟。
- 最后一次洗涤后，将细胞重悬于 200 μL 染色缓冲液中，并转移至适当的管中（染色缓冲液终体积为 400 μL），通过流式细胞术获取数据。若使用配备微孔板读板功能的流式细胞仪，染色后的 96 孔板样品也可 直接上机检测，无需转移至管中。此步骤可最大限度减少细胞转移过程中的损失。
- 在流式细胞仪上至少采集 5 × 105 个总细胞，以便对滤泡辅助性 T 细胞（TFH）、滤泡调节性 T 细胞（TFR）以及生发中心 B 细胞（GC B 细胞）进行可重复的分析。
结果
与之前的一项方案相比20我们观察到，PPs 在小肠（SI）内并非均匀分布，而是更密集地分布于小肠远端和近端，如图所示。 图1A. 流式细胞术分析显示，若严格按照本方案操作，所获得的PP淋巴细胞群体表现出与脾细胞相似的前向-侧向散射分布（图 2A，E， 和 二维，H）与 >95% 细胞活力图2B 和 2F）。与其他次级淋巴器官（SLOs）相比，在C57BL/6小鼠中，约70–80%的肠集合淋巴结（PP）总淋巴细胞为B细胞，而CD4+ T细胞仅占全部PP淋巴细胞的10–15%图2C 和 2G).
请注意，CD4+ CD19+ 双阳性（DP）细胞约占PP淋巴细胞总数的≈1%。在细胞制备过程中需采取某些预防措施，例如对B细胞的Fc受体进行Fc阻断，并排除双联体，CD4+ CD19+ DP 细胞群体可能会减少（图3A 和 B然而，不可避免地会存在一部分不具有前向散射（FSC）双联体特征的双峰群体，应从单阳性的T细胞和B细胞门中设门排除 (图3B）。我们的结果表明，DP细胞中的B细胞在其表面高表达CXCR5（图3C可能导致TFH门控（基于CD4中CXCR5表达设定）出现假阳性结果+ T细胞。另一方面，我们发现活化B细胞的标志物GL7也在CD4中表达+ CD19+ DP细胞（图3D), 这可能会干扰GC B细胞的设门。
TFH 和 GC B 细胞门控算法的示例如图所示 图4. 对于生发中心B细胞的圈门，我们采用GL7标记与CD38对照，将生发中心B细胞定义为GL7+ CD38- B细胞（图4A- B）。可使用PNA标记代替GL723 而CD38可由以下标记物之一替代：IgD、Bcl-6和CD95。文中展示了生发中心B细胞的其他设门策略。 图S1。 在C57BL/6小鼠中，PPs内GC B细胞比例表现出较大变异性。然而，与其他SLOs相比，在稳态条件下，PPs具有显著更高的GC B细胞比例，占总B细胞的2–10%。PP中TFH细胞的设门策略定义为CD19- CD4+ PD-1你好 CXCR5+ T细胞（图 4A，C）。“Zebra图”被发现是展示TFH设门策略的最佳方法，因为它能够呈现PD-1你好 与其他图类型相比，该群体分布更为离散图4C）。TFR 是表达 Foxp3 的 TFH 细胞亚群，其门控为 CD19- CD4+ PD-1你好 CXCR5+ Foxp3+ T细胞（图4D）。与GC B细胞类似，未免疫小鼠个体中的TFH细胞比例也存在差异，占总CD19- CD4+ PP 淋巴细胞。TFH 细胞的替代门控算法细节见于 图4E，F 和 图S1C，D。
为避免因背景染色和自发荧光导致的假阳性结果，应在染色方案中加入同型对照或替代性等效对照（如单荧光减一对照，FMO），作为T滤泡辅助细胞（TFH）和生发中心B细胞（GC B cell）标志物的阴性对照（图4G-J）。
为了优化PP组织制备的条件，我们开发了一种新型的内部对照实验策略，其中PPs取自同一只小鼠，并根据其解剖来源分别收集和分组例如，十二指肠，回肠）。进行实验时，将集合后的派伊尔结（Peyer's patches, PPs）分配至各个组别，以确保每个实验组和对照组均包含相同数量的来自各解剖区域的PPs。图 5A）。通过该方法，我们发现基于胶原酶的酶消化法（每25 mL消化液中使用37.5 mg胶原酶II或IV，即1.5 mg/mL），即常用于从多种黏膜组织中分离淋巴细胞的方法，会显著降低派伊尔结（PP）淋巴细胞中CXCR5的表达水平（图5B），尤其是在TFH细胞中（图5F-I），而其他表面分子的表达（例如，CD19，CD4）保持完整（图5C-E）。CXCR5的检测显著降低，以至于经胶原酶处理的TFH细胞上的CXCR5表达几乎无法与同型对照区分（图 5F-I）。进一步实验表明，酶消化对CXCR5表达的干扰程度取决于所用CXCR5抗体的克隆株图6A-F）。具体而言，在胶原酶II处理后，CXCR5抗体克隆2G8的检测能力受损程度明显大于CXCR5抗体克隆L138D7的检测能力图6A-D).
酶消化不仅降低了CXCR5的表达，还减少了PP细胞中总淋巴细胞的比例（根据FSC-SSC特性确定），而从消化后的PP中分离出的相当一部分细胞表现出比PP淋巴细胞更高的前向散射和侧向散射强度（图7A-C）。胶原酶对细胞回收率的影响呈剂量依赖性（图7A, H-J）。酶消化提高了细胞活力（图7D, E）。然而，这一益处并非由胶原酶消化直接引起，因为在37 °C下振荡但未使用胶原酶时，从PP中分离的细胞同样具有较高的活力（图7F）。对于本研究中特别关注的核转录因子Foxp3（通常在TFH细胞分离过程中用于鉴定TFR细胞），无论是否进行胶原酶消化，在37 °C下振荡均能改善其检测效果（图7G）。
图1：小鼠派伊尔结的宏观结构及其解剖分布。（A）从小肠十二指肠端连同胃部获取的图像，十二指肠中两个相邻的派伊尔结以黑色箭头标示。（B）从11只C57BL/6小鼠收集的派伊尔结被分别保存在12孔板中。（C）新鲜切除的小鼠派伊尔结置于40 µm细胞筛网上拍摄的图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：PP 淋巴细胞的流式细胞术表征及基本设门策略。（A）散点图显示新鲜分离的未固定PP淋巴细胞在FSC和SSC轴上的分布，其形态与（D）中所示脾细胞高度相似。（B）通过7AAD表达排除死细胞。7AAD-细胞代表活细胞。（C）基于CD19和CD4对预设门的活PP细胞中的T细胞和B细胞进行免疫表型分析。（E-G）固定后PP淋巴细胞的代表性流式分析结果。（H）固定后脾细胞的代表性流式特征。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：CD4+CD19+ 双阳性（DP）细胞导致滤泡辅助性 T 细胞（TFH）和生发中心 B 细胞（GC B cell）设门时出现假阳性。（A）展示活体腹腔（PP）细胞中 CD4+CD19+ 双阳性（DP）淋巴细胞。（B）根据前向散射（FSC）特征将 DP 细胞区分为双联体和单细胞。（C、D）在直方图中显示 DP 细胞上 CXCR5 和 GL7 的表达情况。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：滤泡辅助性T细胞（TFH）与生发中心B细胞（GC B cell）设门策略代表性图例。 脾脏组织（PPs）取自3月龄小鼠，淋巴细胞的分离方法见“实验方案”部分。 (A) 显示活体PP淋巴细胞中CD19与CD4的标记情况。(B) 将CD38lo GL7hiCD19+ B细胞设门为生发中心B细胞（GC B cells）。(C) 滤泡辅助性T细胞（TFH）设门为CXCR5+PD-1hi CD4+细胞。(D) 滤泡调节性T细胞（TFR）是表达调节性T细胞特异性转录因子Foxp3并同时表达TFH标志物的一类TFH细胞亚群，设门为CXCR5+ PD-1hi Foxp3+ CD4+ T细胞。(E-F) 通过NP-OVA免疫小鼠脾细胞中BCL-6的表达情况，验证TFH表面标志物的设门策略。(G-J) 显示关键TFH、TFR及生发中心细胞标志物的荧光减一（FMO）对照。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 5：基于胶原酶的酶消化导致 CXCR5 检测信号大幅降低。（A）从一只两个月大的小鼠中分别收集位于十二指肠（约近端1/3）、空肠（约中段1/3）和回肠（约远端1/3）的派伊尔结（Peyer's patches, PPs），并分别合并。将合并后的PPs均等分配至各实验组。使用1.5 mg/mL浓度的II型或IV型胶原酶在37 °C条件下振荡消化10分钟。（B-E）直方图显示经胶原酶消化后从PPs中分离的细胞表面分子（CXCR5、CD19、PD-1、CD4）的表达情况。（F-I）在斑马图中展示胶原酶处理组与对照组中滤泡辅助性T细胞（TFH）的设门策略。数据代表三次独立实验的结果。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：胶原酶对CXCR5表达的影响因抗CXCR5抗体克隆的不同而表现出显著差异。 来自6个月大小鼠的PP淋巴细胞被收集后混合，并根据所使用的抗体克隆和酶消化处理情况分为不同组别。A-F) 预设门控的活细胞、CD19阳性细胞中TFH细胞的比例以斑马图显示- CD4+ T细胞 (A，C 和 E) PP细胞使用生物素偶联的抗小鼠CXCR5抗体（2G8克隆）以及BV421荧光染料偶联的链霉亲和素进行染色。 (B，D 和 FPP细胞用偶联的一抗抗小鼠CXCR5抗体（L138D7克隆）进行染色。 (A-B) 未消化PP淋巴细胞的TFH门控图。 (C-D) 用胶原酶 II（20 mg/25 mL 消化液）消化并振荡 10 分钟的 PPs 37 °C数据代表两次独立实验。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 7：基于胶原酶的消化及在 37 °C 下的振荡影响细胞活力、回收率和细胞内染色效率。 处死一只 3 月龄的 C57BL/6 小鼠；按照 图 5A 所述方法收集并合并派伊尔结（PPs）。(A) 收集 PPs 后，组织在含有胶原酶 II（37.5 mg/25 mL 消化液）的条件下振荡 10 分钟，固定后的 PP 细胞的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）特征如图 (A) 所示，活力染色图显示在 (D)。(B, E) 收集 PPs 后，组织在无振荡或酶消化的条件下置于冰上；固定后 PP 细胞的 FSC 和 SSC 特征如图 (B) 所示，活力染色结果如图 (E) 所示。(C, F) 收集 PPs 后，组织在 37°C 下以 125–150 rpm 的速度振荡 10 分钟，但不添加胶原酶；固定后 PP 细胞的 FSC 和 SSC 特征及活力染色结果分别如图 (C, F) 所示。(G) 直方图显示了在未使用胶原酶的情况下，从振荡与未振荡的 PPs 中分离出的调节性 T 细胞中 Foxp3 表达的比较结果。(H–J) 从一只 6 月龄 C57BL/6 小鼠收集的 PPs 经不同浓度的胶原酶 II 处理：每 25 mL 消化液中加入 25 mg、15 mg 胶原酶 II，或不加胶原酶。FSC 和 SSC 图显示了酶消化对 PP 细胞回收率和得率的影响。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8：CXCR5的分子模型及其完整的氨基酸序列。 (A) 建模了CXCR5的七次跨膜蛋白结构。 (BCXCR5 的完整氨基酸序列如图所示。胞外区序列以红色标出，具有推测可被胶原酶切割的化学键的胞外氨基酸以黄色标出。 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 抗原 | 克隆 | 荧光染料 | 稀释比例 |
| CD4 | GK1.5,RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1:100 |
| CD19 | 6D5 | FITC, APC/Cy7 | 1:100 |
| PD-1 | J43 | PE ef 610 (Texas Red) | 1:100 |
| ICOS | 15 F9, 7E.17G9 | PE | 1:100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1:75 |
| CXCR5 | 2G8,L138D7* | 生物素 | 1:50 |
| BCL-6 | 7D1 | PE/Cy7 | 1:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, PE | 1:100 |
| 链霉亲和素 | - | BV421, PE | 1:100 |
| 可固定活力染料 | - | BV 510(AQUA) | 1:1,000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1:500 |
| Fc阻断剂 (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1:200 |
表1：抗体汇总。 相关抗体及活力染料的稀释比例、克隆号和荧光素偶联情况已列出。最佳稀释比例可能因实验条件及产品批次质量不同而有所变化。实验显示，BV421标记的L138D7克隆抗体以1:20稀释时，对CXCR5的检测能力与生物素标记的2G8克隆抗体以1:50稀释时相当。因此，可使用直接偶联荧光素的L138D7克隆抗体替代生物素偶联的2G8克隆抗体。
图补充1（S1）：TFH细胞和生发中心B细胞的替代门控策略。（A）显示来自3月龄C57BL/6背景小鼠的活PP淋巴细胞。（B-C）生发中心B细胞被设门为CD38- GL7+（B）以及BCL-6+ GL7+ B细胞（C）。（D-E）TFH细胞被显示为PD-1hi CXCR5+（D）以及ICOS+CXCR5+ CD4+ T细胞（E）。请点击此处下载该文件。
讨论
在此，我们描述了一种针对滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心B细胞（GC B细胞）流式细胞术表征的优化方案。本方案的主要优势之一在于，能够从单个样本中分离出多达10^6个细胞7 （平均 4–5 x 106 细胞）单只小鼠（C57BL/6品系）的总PP细胞，无需任何消化处理。我们观察到，总细胞得率与PP数量呈正相关，并可通过以下简单公式进行估算，有助于实验设计： "总PP细胞数 每 小鼠 = 0.5–1 ×（切除的PP数量） 每 小鼠) × 106"。该高细胞得率伴随着细胞活性的显著提高（>95%）。改进后的细胞回收率和存活率使得能够并行使用多种抗体染色组合，对 PPs 中各类淋巴细胞亚群进行流式细胞术分析。
与 De Jesus et al.20 最近发表的 PP 分离方案以及先前的报道19,21 相比，尽管未使用胶原酶消化，本方案仍获得了明显更高的总细胞产量和细胞活性。尽管初次操作的研究人员可能觉得 PP 的识别较为“困难”，但本方案的学习曲线较为陡峭，一旦掌握，即可在短时间内完成小肠中 PP 的识别与手术切除。若首次尝试后未达到所需的 PP 数量，建议重复 PP 识别步骤，重点关注小肠的远端和近端。在我们的实践中，几乎每只小鼠的十二指肠端（图 1A）均可检测到两个位置相近的 PP，且在回肠末端 5 cm 范围内至少可检测到 2–3 个 PP。
TFH 染色可能比 PPs 中其他细胞亚群更具挑战性，因此需要格外注意18。如果在组织处理和细胞分离过程中遗漏某些步骤，结果可能会产生严重误导。因此，我们建议研究人员关注以下实验“要点”。由于关键的 TFH 和生发中心 B 细胞标志物（如 CXCR5 和 GL7）在 B 细胞和 T 细胞中均可表达，因此在抗体组合中加入 B 细胞标志物至关重要，以避免因污染的 CD19+CD4+ 双阳性（DP）细胞导致假阳性结果24（图 2）。请注意，仅依赖 T 细胞标志物的设门策略25无法充分排除 DP 细胞，因为这些细胞同样高表达 CD3（未显示数据）和 CD4 等 T 细胞标志物。除了排除 DP 细胞外，还应通过使用适当的阴性对照（例如，同型对照、FMO 对照）来验证和确认流式细胞术结果。不仅假阳性结果，TFH 设门位置的错误也可能导致错误的结论。调整 TFH 设门有时可能具有挑战性，特别是当 TFH 细胞群体数量较少时，在流式图中可能无法形成明显的独立群体。为克服这一局限，可在抗体组合中加入多个 TFH 标志物（例如，BCL-6、PD-1、ICOS），以提供替代的设门方案并提高准确性26。出于实际考虑，BCL-6 被发现是用于替代 TFH 设门的理想共染标志物，因为它可同时用于生发中心 B 细胞的设门16（图 S1C）。
此外，使用含有较高比例滤泡辅助性T细胞（TFH）的阳性对照样本，可帮助研究人员准确设定TFH细胞门控位置。在我们的实验中，采用老龄小鼠（6个月以上）的派伊尔集合淋巴结（PP）样本作为阳性对照，因为我们发现，在稳态条件下，衰老可使PP中TFH细胞的比例提升至总CD4+ T细胞的40%（数据未显示）。我们也建议对TFH染色技术细节有进一步兴趣的研究人员参考已发表的TFH细胞染色实验方案手册中的方法18。
在派尔集合淋巴结（PP）中验证实验假设可能相对困难，为达到统计学显著性，每组可能需要使用大量小鼠21。通过利用本方案获得的高细胞得率，我们采用以下实验策略克服了这一障碍。首先，我们根据派尔集合淋巴结的解剖来源（例如，十二指肠、空肠和回肠）分别切除并分选PP。随后，我们将这些汇集的PP均匀分配至不同的实验组和对照组。这种内部对照的实验策略使我们能够在所有细胞均来自同一只小鼠的前提下，最大限度地减少小鼠个体间的差异。
此外，不同肠段之间存在差异性（例如，十二指肠 与. 回肠）——先前已有报道称其具有重要意义2 —因实验组和对照组在每个解剖区域均采用相同数量的派尔集合淋巴结（PPs），从而避免了该问题图 5A). 通过重复进行独立实验 采用相同的方法，我们提高了实验结果的可靠性和显著性。该方法不仅消除了非特异性变异，还有助于节约实验小鼠、试剂和时间。
在本方案的开发与优化过程中，我们的结果表明，基于胶原酶II型和IV型的消化显著降低了CXCR5的表达（图 5B）而用于检测TFH和GC B细胞的其他表面分子仍保持完整（图5C-). 在最近报道的 JoVE 方案中19，研究表明胶原酶II对从派伊尔结（PPs）和固有层（LPs）中分离淋巴细胞非常有效。然而，已有文献报道胶原酶II具有较高的胰蛋白酶活性，可导致多种表面分子的裂解。鉴于其对表面分子较为温和的特性27 由于胰蛋白酶活性较低，且在文献中更为常用28,29,30，本研究中除胶原酶II外还加入了胶原酶IV，并按照既往文献推荐的浓度使用。由于消化酶可能对免疫细胞产生非预期影响，例如改变细胞表面分子的表达，因此胶原酶及相关酶的使用在黏膜免疫学领域一直存在争议31,27.
此前有报道称，使用不同类型的胶原酶可能干扰人肠道内流式细胞术对 CXCR5 的检测32 和扁桃体样本18相反，其他研究证实，无需使用胶原酶即可从派伊尔结中分离出滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心B细胞（GC B细胞）。24,33然而，迄今为止尚未有比较性研究评估在从小鼠 PPs 中分离表达 CXCR5 的 TFH 细胞时，是否应包含或排除胶原酶消化步骤以获得最佳条件。小鼠 CXCR5 是一种由 374 个氨基酸组成的七次跨膜蛋白，与其他在 PPs 淋巴样细胞中高表达的跨膜蛋白（如 CD4、CD19）相比，其胞外区域相对较短（数据来源于 UniProt）。 图 8A- B，展示了小鼠 CXCR5 的分子模型及其完整的氨基酸序列，并标示了基于胶原酶消化的假定靶序列，该酶消化倾向于解离甘氨酸（Gly）与中性氨基酸之间的化学键34七次跨膜分子结构导致的较短胞外结构域可能是使CXCR5分子易于受到酶消化的原因图 8A）。有趣的是，我们发现经胶原酶处理后CXCR5表达的检测效果取决于所使用的抗体克隆。尽管在未消化的PP组中，2G8和L138D7克隆在检测相当的TFH细胞比例方面表现相似，但在消化的PP组中，L138D7克隆检测到的CXCR5阳性细胞比例约为2G8克隆的3倍（≈ 9%）更高的CD4+细胞内TFH细胞比例+ T 细胞多于 2G8 克隆（≈ 3%) (图6这一结果表明，CXCR5 染色减弱可能是由于胶原酶的酶活性改变了三维表位构象所致。我们的结果提示，在 Peyer's 结节制备过程中应避免使用基于胶原酶的消化方法。
通过省略消化步骤，避免了胶原酶解离对CXCR5分子检测的干扰。然而需要注意的是，对于某些组织（如固有层LP），仅靠机械性破坏不足以分离细胞，此类组织仍需使用酶消化19。未来，有必要测试替代性的消化条件以及与消化兼容的抗体克隆，以克服需要酶消化处理组织的技术局限。在此之前，成像技术（如免疫荧光显微镜）仍将是这些组织中TFH检测的首选方法。除了分离LP细胞外，从PPs中分离某些造血细胞亚群（如树突状细胞DCs和浆细胞）也需要酶消化35。当研究人员采用本方案并希望从PPs中分离这些细胞亚群时，应加入适当的酶消化步骤20。需考虑酶消化可能对DC标志物表达产生的干扰，并根据需要优化消化条件。当需要同时分离TFH和GC B细胞以及某种需要胶原酶消化的细胞亚群时36，可将每只小鼠获取的PPs分为两组，分别平行进行有或无胶原酶处理的后续操作。
胶原酶对派伊尔集合淋巴结（PP）淋巴细胞的影响不仅限于表面分子的表达。我们的结果表明，酶消化以剂量依赖的方式导致派伊尔集合淋巴结细胞中淋巴细胞比例相对下降（图7）。淋巴细胞比例的降低可能是胶原酶介导释放了其他类型的造血细胞亚群（如吞噬细胞和树突状细胞）所致，这些细胞比淋巴样细胞更大且更具颗粒性。此外，胶原酶消化可能促使邻近固有层（LP）和上皮内区室的细胞释放 ，从而影响前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）的分布图谱。来自其他肠道区室的这类细胞污染也可能干扰派伊尔集合淋巴结淋巴细胞的流式分析。基于此，为了最大化细胞纯度，我们还避免添加EDTA或DTT等常用于提取上皮细胞和黏液的试剂20，尽可能保持组织制备条件接近生理状态且不受人为干预。尽管酶消化存在上述不利影响，但也发现了其对派伊尔集合淋巴结淋巴细胞的有益作用，例如改善胞内染色效果和提高细胞活力（图7D-F, G）。然而，进一步分析表明，这些效应实际上归因于37 °C条件下的振荡过程，而非酶消化本身，因为在无胶原酶存在下进行振荡时，细胞活力和胞内Foxp3染色的改善程度相当。从机制上讲，振荡的有益作用可能是由于更有效地清除了派伊尔集合淋巴结中的肠内容物和黏液所致。
总之，我们介绍了一种简化的小鼠派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）淋巴细胞分离方案。所分离的细胞可用于多种细胞亚群的流式细胞术表征，也可进行细胞分选后应用于各种后续实验。 体外 和 体内 功能分析
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢Laura Strauss和Peter Sage在流式细胞术分析方面的有益讨论和支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗小鼠 CD4 抗体 | eBioscience，Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 CD19 抗体 | eBioscience | MA5-16536 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 PD-1 抗体 | eBioscience | 61-9985-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 ICOS 抗体 | eBioscience | 12-9942-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠GL7抗体 | Biolegend | 144610 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 CXCR5 抗体 | Biolegend*，BD Bioscience | 145512*, 551960 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 BCL-6 抗体 | Biolegend | 358512 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 抗小鼠 Foxp3 抗体 | eBioscience | 17-5773-82 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 链霉亲和素-BV421 | BD生物科学 | 563259 | 详细信息见表1 |
| 可固定活力染料 | eBioscience | L34957 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | 有关详细信息，请参见表1 |
| Fc阻断剂（CD16/32） | BD生物科学 | 553141 | 有关详细信息，请参见表1 |
| 胶原酶II | 沃辛顿 | LS004176 | |
| 胶原酶IV | 沃辛顿 | LS004188 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6孔，12孔 &和 96 孔板 | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL 一次性离心管 | Falcon | 3520 | |
| 40 µm细胞滤筛 | Falcon | 352340 | |
| 10 mL 注射器-推杆 | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | 康宁 | 15-040-CV | |
| PBS | 康宁 | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 轨道摇床 | VWR | Model 200 | |
| 弯头剪刀 | |||
| 精细有齿镊 | |||
| 小型弯剪 |
参考文献
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114(2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167(2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282(2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225(2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
重印与许可
