经颈静脉穿刺作为大鼠采血的替代方法

摘要

本文介绍了一种从大鼠锁骨下静脉采集血液样本的实验方案。

摘要

在动物实验中，采集足量血液至关重要。与眼眶后丛采血等更具侵入性的方法相比，从大鼠尾静脉采血较为常用且应激较小。然而，该采血方法有时受限于成功率不理想。本文介绍一种经锁骨下静脉穿刺进行采血的方法。锁骨下静脉位于锁骨正下方，管径较粗，足以满足采血所需的血量要求。我们的结果表明，该方法安全可行，能够满足所需血量的采样需求。当大鼠尾静脉采血失败时，经锁骨下静脉穿刺采血可作为替代的采血方法。

引言

在动物研究中，采血是必不可少的操作。可用于采血的目标静脉包括眶后静脉丛、颈静脉、隐静脉、尾部血管以及颈动脉^1,2,3,4。有时也可从腹主动脉、下腔静脉甚至心脏采血^5,6,7。然而，采用这些方法时，动物必须被处死，无法用于后续观察，因此在日常实验工作中较少使用。相比之下，从大鼠尾静脉采血较为常用，且对动物造成的应激更小⁸。

然而，从尾静脉采血有时受限于不理想的采血成功率。偶尔也难以通过该方法获得足够的血量。由于锁骨下静脉足够粗大且位于锁骨下方，当常规采血方法失败时，锁骨下静脉穿刺可作为替代的采血方法。本文介绍一种通过锁骨下静脉穿刺在大鼠中进行采血的方法。

方案

本研究经中南大学湘雅二医院（中国长沙）动物研究伦理委员会批准。手稿的撰写遵循《动物研究：活体实验报告》（ARRIVE）指南⁹。

1. 材料与动物准备

1. 准备所需材料：胶带、脱毛剂、75% 乙醇、采血管、2.5 mL 注射器（连接 24 G，0.6 mm × 25 mm 针头）、毛发剃刀、电子天平和量规（参见材料表）。
2. 使用 20 只 8–10 周龄、体重为 153–200 g 的 Sprague-Dawley（SD）大鼠（参见材料表）。按照《实验动物护理与使用指南》¹⁰的要求进行大鼠饲养与管理。
3. 将大鼠饲养在标准条件下，自由摄取食物和饮用水。每笼 2 只，置于底面积为 530 cm² 的笼具中，垫以木屑作为垫料。保持动物饲养环境温度恒定，约为 25 °C。
4. 在进行锁骨下静脉穿刺前，通过腹腔注射给予戊巴比妥钠（40 mg/kg）诱导全身麻醉。
5. 将大鼠置于仰卧位，将其后肢固定于舒适位置，并将前肢平行于身体纵轴固定在躯干旁。
   注意：本操作无需机械通气（图 1）。
6. 清洁双侧锁骨下区域，去除毛发（使用毛发剃刀和脱毛剂，参见材料表）及任何可见污物。用 75% 乙醇擦拭颈部和胸部皮肤。用纱布保持穿刺区域清洁干燥。

2. 血液采集步骤

注意：锁骨下静脉两侧均适合穿刺，此处选择右侧进行穿刺。操作者用左手拇指确定右侧锁骨的位置和方向（图2）。用食指轻触胸骨上窝，因穿刺针的方向指向胸骨上窝（图2）。

1. 用肝素溶液（10 IU/mL）冲洗一支无菌的2.5 mL注射器。
2. 在右锁骨外侧1/3区域远端0.5 mm处确定穿刺部位（图3）。将注射器轻柔地刺入穿刺部位皮肤。一旦针头进入锁骨下皮肤，操作者用右手施加负压（图4）。
   注意：平均和最大采血量分别为1.0 mL和1.4 mL。针头方向应朝向胸骨上窝，并且几乎与锁骨平行，略偏其后方。通常沿此方向进针约2 mm即可到达锁骨下静脉。一旦针头进入静脉，血液将在负压作用下流入注射器。
   1. 保持负压状态，直至采集到足够的血量（图5）。
3. 若锁骨下静脉采血未成功，应将针头退至皮下区域，并轻微调整针头方向，使其更靠近胸骨内侧。
   1. 若连续三次尝试均失败，则应避免从同侧继续穿刺锁骨下静脉，改用对侧进行采血。
4. 采血完成后，拔出穿刺针，并对穿刺部位施加压力1–2分钟，以止血。
   注意：施加的压力必须非常轻柔，以防造成压迫窒息。

3. 血液样本处理

1. 将血液样本转移至含有抗凝剂（EDTA）的真空采血管中，以1600 × g离心10分钟，收集血浆。
2. 吸取上清液至洁净试管中，并于-80 °C保存（图6）。

结果

本实验共使用20只SD大鼠（雄性10只，雌性10只）。血液采集操作由熟练操作者和初学者操作者分别进行，其中熟练操作者具有20次以上大鼠锁骨下静脉采血经验，而初学者操作者无大鼠或其他动物锁骨下静脉穿刺经验。操作前，初学者至少观摩了3次熟练操作者完成的完整操作过程。

通过右侧锁骨下静脉通路，17只大鼠采血成功。3只大鼠该操作失败（熟练组1只，初学者组2只），这3只大鼠通过左侧锁骨下静脉通路成功完成采血。各案例的采血时间进程及采集血量如图所示 表1初学者组的成功率为80%，熟练组为90%，两组之间成功率相似。 p = 0.531）。当纳入3只大鼠额外的左侧锁骨下静脉通路时，两组的成功率均为100%。双尾Student's t检验结果显示，初学者组与熟练组在所用时间上无显著差异（102.1 ± 14.9 秒 vs. 84.3 ± 9.7 秒，p = 0.33），

讨论

本文介绍了一种从锁骨下静脉采血的替代方法，并证明该方法在大鼠血液采集中具有可行性、安全性和适用性。该方法借鉴了临床为患者植入起搏器导线时进行的锁骨下静脉穿刺技术¹¹。锁骨下静脉位于锁骨后下方，是腋静脉的延续，走行于第一肋骨外侧缘至前斜角肌内侧缘之间¹²。随后，该静脉与颈内静脉汇合形成头臂静脉，并汇入上腔静脉，位置恰在胸骨上窝下方（图8）。锁骨易于辨认，且锁骨下静脉与锁骨之间具有明确的解剖关系。本研究将这一临床技术应用于动物实验。由于人类与大鼠上肢的解剖方位不同，在操作过程中需将大鼠的上肢紧贴躯干放置，以暴露锁骨下方的空间，从而便于穿刺（图1）。

锁骨下静脉比尾静脉大得多，因此从锁骨下静脉获取足够血量比从尾静脉更容易。每次采血总量可达总循环血量的10%¹。如果传统的尾静脉采血或其他采血途径失败，研究人员可考虑采用锁骨下静脉穿...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠	湖南斯莱克实验动物有限公司（中国湖南长沙）
统计软件	SPSS Statistics 17
脱毛剂	中国广东省广州市法国伊莎化妆品有限公司
2.5 mL 注射器	山东威高集团医用高分子有限公司（中国山东省威海市）
毛发剃除器	上海飞科电器有限公司（中国上海）
胶带	3M Deutschland GmbH（德国卡门爱迪生街6号，邮编59157）
戊巴比妥钠	默克
75% 乙醇	中南大学湘雅二医院药学部
采血管	湖北金星科技&安普&发展有限公司（中国湖北省武汉市）（2 ml）
电子天平	中国广东省东莞市胜恒电子有限公司
帆布手套	用于麻醉
肝素	南京新百药业  有限公司（中国江苏省南京市）（2 mL，12500 IU）
生理盐水	中国湖南科伦制药有限公司（中国湖南岳阳，100 ml）