方法文章

一种用于快速鉴定烟粉虱（Bemisia tabaci）的环介导等温扩增（LAMP）检测方法

DOI：

10.3791/58502

⸱

2018年10月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Method Development and Analytics, Agroscope, 2Swiss Tropical and Public Health Institute, 3University of Basel, 4Swiss Federal Plant Protection Service, Federal Office for Agriculture, 5OptiGene Limited, 6Fera Science Limited, 7School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 8Department of Plants and Plant Products, Agroscope

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文报道了一种基于环介导等温扩增（LAMP）技术的烟粉虱（Bemisia tabaci）快速鉴定检测方法。该方案对实验室操作技能要求较低，因此可在植物进口口岸（如海港和机场）进行现场实施。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）是一种具有重要危害性的入侵性害虫，影响全球多个国家蔬菜和观赏作物的生产。其不仅通过直接取食造成严重减产，更重要的是还能传播超过100种有害的植物致病病毒。与其他入侵性害虫类似，日益频繁的国际贸易促进了B. tabaci扩散至其原生分布区以外的地区。因此，在港口、机场等入境口岸对植物进口产品进行检疫检查被视为一项重要的预防措施。然而，只有在能够快速鉴定可疑昆虫样本的方法 readily available 的情况下，这一最后防线才能有效发挥作用。由于受管制的B. tabaci与其无检疫地位的近缘种在形态学上难以区分，非分类学专业人员通常难以准确识别，因此已开发出一种基于环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术的快速分子鉴定方法。本文报道了该新方法的详细操作流程，包括快速DNA提取、LAMP反应体系的建立以及结果判读，可在一小时内完成对B. tabaci样本的鉴定。与现有的针对特定B. tabaci生物型检测方法相比，本方法可在单次反应中靶向整个B. tabaci种复合体。此外，该检测方法设计为可在入境口岸由植物检疫人员现场使用，仅需极少的实验室培训即可操作。在实验室及现场条件下进行的全面验证表明，所报道的LAMP检测方法是一种快速、可靠的鉴定工具，有助于提升对B. tabaci的防控管理水平。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）是一种入侵性害虫，影响多种重要经济作物的产量，包括观赏植物、蔬菜、豆类作物和棉花1,2。除通过直接取食韧皮部造成损害外，该同翅目物种还会通过向叶片和果实表面排泄大量蜜露，以及传播多种植物致病病毒，对植物造成间接危害1,3,4。近期基于线粒体基因细胞色素c氧化酶1（COI）DNA序列的遗传学研究发现，B. tabaci实际上是由至少34个形态隐存种组成的复合种3,4。该复合种中两个入侵性强且危害严重的生物型——源自中东及小亚细亚地区的B型和源自地中海地区的Q型——已通过植物产品国际贸易活动在全球范围内扩散，尤其是通过观赏植物的运输传播1,5,6。由于其全球性害虫地位，国际自然保护联盟（IUCN）将B. tabaci列为“"世界百大最危险外来入侵物种"”之一，该复合种的成员已被许多国家列为管制生物1,3,4。

在欧盟（EU）中，B. tabaci 被列入《植物卫生指令 2000/29/EC》附件 1AI，作为检疫性有害生物，禁止其从非欧盟国家传入以及在欧盟境内扩散4。防止检疫性有害生物传播的一项关键预防措施，是在入境点（POEs）如机场和港口对植物货物进行检查7,8。一旦发现检疫性有害生物，负责的国家植物保护组织（NPPO）将采取措施，或拒绝入境，或对受侵染的货物进行处理（包括销毁）9。然而，负责进口检查的人员通常缺乏准确识别与全球贸易相关众多害虫物种所需的分类学专业知识9。特别是对于无明显形态鉴别特征的不成熟发育阶段（例如，卵和幼虫），非分类学专家几乎无法进行准确鉴定8,9,10。因此，为能够以最小延误实施检疫措施，亟需开发替代性的、快速的现场鉴定检测方法9。

一种候选方法是环介导等温DNA扩增（LAMP）技术，最近的研究表明该技术适用于植物病原体的鉴定11,12,13。LAMP具有高度特异性，因为该方法使用至少两对引物识别六个不同的DNA靶序列14。由于Bst DNA聚合酶具有DNA链置换活性，LAMP反应可在等温条件下进行14。因此，与传统的基于聚合酶链式反应（PCR）的检测方法相比，无需使用热循环仪13,14。相较于基于PCR的检测方法，LAMP的另一优势在于其对DNA提取物中潜在抑制物具有较强的耐受性，从而避免了DNA纯化步骤13。由于该方案快速且操作简便，LAMP甚至可在现场条件下使用便携式、电池驱动的实时检测设备完成8,15。

一种环介导等温扩增（LAMP）检测方法被设计出来，以满足对快速现场鉴定方法的需求 B. tabaci8总体目标是开发一种可供植物检疫人员在实验室培训有限的情况下操作的检测方案。因此，重点在于优化该方案的速度和简便性。尽管现有的诊断检测通常针对一种或多种生物型的鉴定而开发， B. tabaci，该新型LAMP检测方法覆盖了整个 B. tabaci 复合种8,16,17,18通过使用不同引物组合以及简并引物，解决了该复合体在分类单元内存在显著遗传多样性的难题。8. 新型的 B. tabaci LAMP 检测的设计使得引物靶向线粒体 COI 基因 3' 端的一个片段8该基因是动物诊断检测的理想靶标，因其包含足够保守的区域，可确保对特定物种的诊断敏感性，同时又能充分区分近缘物种。19,20此外，COI 基因常被用作群体遗传学研究中的遗传标记，以及 DNA 条形码分析中的特征序列，因此在 GenBank 和 BOLD 等开源数据库中已积累了大量的 DNA 序列数据。21,22。除了公开可获取的COI序列外 B. tabaci，来自近缘物种的COI序列（Aleurocanthus 种 [N = 2]， Aleurochiton aceris, Aleurodicus dugesii, 烟粉虱属 sp. [N = 3]， Neomaskellia andropogonis, Tetraleurodes acaciae，以及 Trialeurodes spp. [N = 4] 被纳入本研究的引物设计中，并用于评估诊断的敏感性和特异性 计算机模拟8.

由于该方法具有较高的准确性、操作快速（<1 h）以及实验方案简便，已证明其适用于作为瑞士入境口岸进口控制程序的一部分进行现场应用8。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 准备工作

  1. 准备碱性DNA提取溶液的分装液。
    1. 使用分子级水配制碱性DNA提取溶液，其中添加600 µM氢氧化钾（KOH）和2 µM百里酚红。
      注意：KOH为溶于水的强碱。避免洒漏，防止接触皮肤和眼睛。
    2. 将30 µL碱性DNA提取溶液（按步骤1.1.1制备）分装至0.5 mL微量离心管中，并于4 °C保存。
      注：分装的DNA提取溶液应在1年内使用完毕。
  2. 准备B. tabaci阳性扩增对照（PAC）。
    1. 扩增LAMP目标DNA片段的PCR产物。
      注：Lorenz23提供了关于常规PCR原理与操作的介绍。
      1. 合成或获取引物C1-J-2195（5’-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3’）和TL2-N-3014（5’-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′），用于扩增线粒体COI基因的一段片段24,25。
      2. 按照表1所述设置PCR反应体系。使用参考样本B. tabaci的DNA提取物（见步骤2.1）作为DNA模板。
        注：可选地，也可根据厂商说明书使用商业试剂盒提取用于PAC的B. tabaci DNA。
      3. 使用以下程序设置PCR仪：95 °C预变性15 min；进行45个循环（95 °C变性40 s，45 °C退火15 s，60 s内升温至60 °C，72 °C延伸2 min）；72 °C最终延伸7 min；4 °C保存。
      4. 根据厂商说明书，使用商业PCR产物纯化试剂盒纯化PCR扩增产物，并用分子级水洗脱最终产物。
      5. 使用含DNA嵌入染料的商业试剂盒，按照厂商说明书测定PCR扩增产物的DNA浓度，并用分子级水稀释至1 ng/µL。将稀释后的PCR产物作为PAC储备液于-20 °C保存。
        注：PAC储备液应在1年内使用完毕。
      6. 向PAC储备液（按步骤1.2.1.5制备）中加入0.6 µM KOH，并用分子级水稀释至浓度为5 × 10-3 ng/µL。于4 °C保存。
        注：PAC应在5小时内使用，用于下一步所述即用型B. tabaci LAMP试剂盒的制备。
  3. 制备即用型B. tabaci LAMP试剂盒（20个单位的配制方案）
    1. 使用剪刀将8联管LAMP条带剪成两个4联管LAMP条带。
    2. 根据图1所示方案标记4联管LAMP条带上的各管。
    3. 配制B. tabaci LAMP反应预混液（80次反应的配制方案）。
      1. 向一个2 mL微量离心管中加入1195.1 µL即用型GspSSD等温扩增预混液（含GspSSD聚合酶、焦磷酸酶、硫酸镁、脱氧核苷酸、双链DNA结合染料）和717.4 µL B. tabaci LAMP引物混合液。短暂涡旋混匀后瞬时离心。
      2. 将22.5 µL B. tabaci LAMP反应预混液（按步骤1.3.3.1制备）分装至每个4联管LAMP条带（按步骤1.3.1制备）的各管中，随后瞬时离心。
    4. 快速涡旋振荡B. tabaci LAMP PAC（按步骤1.2制备），然后瞬时离心。 接着，向每个4联管LAMP条带中标记为“PAC”的管中加入2.5 µL （见图1）。
    5. 盖紧管盖，并将即用型B. tabaci LAMP试剂盒单元于-20 °C保存。
      注：应在1年内使用完毕。

2. 现场LAMP分析

  1. DNA提取
    1. 使用无菌牙签将昆虫标本转移至含有30 µL DNA提取液（步骤1.1.2中配制）的0.5 mL微量离心管中。
      注意：确保昆虫完全浸没在提取液中。
    2. 在95 °C下于恒温混匀仪（300 rpm）中孵育样品5分钟。短暂涡旋振荡后瞬时离心。
  2. B. tabaci LAMP 检测
    1. 解冻即用型 B. tabaci 步骤1.3中制备的LAMP试剂盒。快速涡旋并瞬时离心。
      注意：每个试剂盒可用于检测两种不同的样本，或对同一样本的DNA提取物进行双份分析。
    2. 将2.5 µL样本DNA提取物（步骤2.1中制备）加入预标记为“S1”和“S2”的即用型管中 B. tabaci LAMP试剂盒（图1).
    3. 向标记为“NAC”的试管中加入2.5 µL的纯碱性DNA提取液（按第1.1节制备），用于阴性扩增对照图1).
    4. 涡旋混匀即用型溶液 B. tabaci LAMP试剂盒快速脉冲离心。
    5. 插入即用型 B. tabaci 将LAMP试剂盒加入LAMP分析仪（具备实时荧光检测功能）或实时PCR平台，在65 °C下进行60分钟的等温DNA扩增分析。
    6. 通过实时荧光检测，将DNA扩增产物加热至98 °C，随后以0.05 °C/s的降温速率冷却至75 °C，测定其熔解温度。
  3. LAMP 检测结果读取
    1. 按照以下步骤手动验证 LAMP 的读出结果。
      1. 若样本和阳性对照（PAC）检测到DNA扩增，阴性对照（NAC）未检测到DNA扩增，且扩增产物的退火温度介于80.0至85.5 °C之间，则判定LAMP结果为阳性（POSITIVE）图2).
      2. 如果样品未出现DNA扩增（即， 标记为S1和S2的试管，但对于PAC和NAC，则视为LAMP结果为阴性（NEGATIVE）图2).
      3. 如果样本检测到了DNA扩增，但相应扩增产物的退火温度不在80.0 ‒ 85.5 °C范围内，和/或PAC未出现DNA扩增，和/或NAC出现DNA扩增，则视为LAMP结果无效图2).
    2. 可选地，使用 LAMP 验证应用程序验证 LAMP 读数（补充文件 1).
      1. 确定目标物种并定义测试样本数量。点击 "生成报告" 按钮。
      2. 将现场LAMP分析设备或实时PCR平台的读出结果（DNA扩增有/无、扩增产物的退火温度、PAC和NAC结果）转移至验证应用程序的相应输入字段。数据输入后，验证结果将立即显示。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在验证B. tabaci的LAMP检测方法期间，对瑞士常规进口检疫过程中截获的昆虫标本进行了分析8。这些标本来自八个不同的国家或地区（加那利群岛、多米尼加共和国、以色列、马来西亚、摩洛哥、新加坡、泰国和越南），反映了在欧洲入境口岸发现的B. tabaci的遗传多样性8。所有LAMP检测结果均通过DNA条形码技术进行了交叉验证8。

在通过LAMP分析的80个样本中，75个样本（93.8%）被正确鉴定为B. tabaci（真阳性），2个样本（2.5%）被正确鉴定为非B. tabaci（真阴性），3个样本（3.8%）被错误鉴定为非B. tabaci（假阴性）（表2）8。正确的阴性结果来自两个Trialeurodes vaporariorum样本，该物种虽未列入管制名单，但在植物产品入境口岸存在与B. tabaci混淆的高风险8。根据这些结果，计算出以下诊断准确性指标：检测特异性（真阴性率）为100%；检测灵敏度（真阳性率）为96.2%；检测效率（正确结果百分比）为96.3%（表2）8。在评估分析灵敏度（检测限）时，B. tabaci LAMP检测在三个技术重复中均成功扩增了浓度低至100 fg/µL的样本DNA（表3）。

部分检测（N = 13）由植物健康检查员在瑞士苏黎世机场入境点（POE）现场条件下，使用即用型 B. tabaci LAMP 试剂盒完成8。在参考实验室进行交叉验证时，所有现场检测结果均准确无误（检测效率 = 100%）8。评估现场 LAMP 检测性能显示，平均阳性时间（获得阳性结果所需时间）为 38.4 ± 10.3 分钟（均值 ± 标准差）8。在現場條件下進行的 B. tabaci LAMP 分析所得到的代表性 DNA 扩增曲线及其相应的熔解曲线导数图见图 3A 和 B。本示例中，样本一和样本二被正确鉴定为 B. tabaci，表现为约 30 分钟后出现 DNA 扩增（图 3A），并伴有约 82 °C 的预期退火温度（图 3B）。

“神经元标记示意图：S1、S2、PAC、NAC；神经科学研究中的关键脑区。”
图1：本实验方案中所述即用型B. tabaci LAMP试剂盒实验设置的可视化示意图。 S1，样本1；S2，样本2；PAC，阳性扩增对照；NAC，阴性扩增对照。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA扩增过程；说明实验对照和结果验证步骤的流程图。
图2：LAMP检测结果验证示意图。 PAC：阳性扩增对照；NAC：阴性扩增对照。 请点击此处查看该图的放大版本。

定量PCR分析的荧光随时间及温度导数图。
图3：B. tabaci 在现场条件下进行LAMP分析的DNA扩增曲线图（A）和退火导数图（B）。 荧光强度以相对单位表示。绿色线：样本1；橙色线：样本2；蓝色线：阴性扩增对照（NAC）；红色线：阳性扩增对照（PAC）。 请点击此处查看该图的放大版本。

组分储存浓度反应终浓度每反应体积
Taq Polymerase Master Mix  2x1x10 µL
引物 C1-J-219520 µM0.4 µM0.4 µL
引物 TL2-N-301420 µM0.4 µM0.4 µL
分子级水--8.2 µL
DNA 模板--1 µL

表1：用于B. tabaci阳性扩增对照的PCR反应预混液的配制。 配制一个PCR反应所需的组分及浓度。最终反应体积为20 µL。引物序列见1.2.1.1。

NNTPN荧光蛋白NTNNFN敏感性（%）SPE (%)EFF (%))
807502396.210096.3

表2：结果 B. tabaci LAMP 检测验证 N，分析数量；NTP，真阳性结果数量；N荧光蛋白假阳性结果数量；NTN，真阴性结果数量；NFN，假阴性结果数量；SEN，诊断敏感性；SPE，诊断特异性；EFF，检测效率。 

CDNA (fg/µL)NPRTP (min)
(均值 ± 标准差)		TA (°C)
(均值 ± 标准差)
1 x 105333.5 ± 2.981.3 ± 0.1
1 x 104330.7 ± 1.181 ± 0.0
1 x 103340.4 ± 3.981.1 ± 0.1
1 x 102350.7 ± 1.681.1 ±0.1
1 x 1010--
1 x 1000--

表3：分析灵敏度（检测限） B. tabaci LAMP 检测 每个稀释度均设置三个重复。CDNA，每反应 DNA 浓度；NPR，阳性重复数；TP，获得阳性结果所需的时间；TA退火温度；SD，标准差。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

准确快速地识别潜在有害生物是管理害虫物种的关键环节9,10,26。对于植物进口产品而言，理想的害虫鉴定方法不仅需要快速，还应能够在入境口岸（POEs）现场简便操作8,26。本文报道了一种用于快速鉴定频繁在欧洲边境被截获的检疫性昆虫B. tabaci的新型LAMP检测方法（https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt_annual-report _2016.pdf）。

开发该诊断检测方法的目的是设计一种易于遵循的操作流程，使植物检疫人员在植物进口检验过程中仅需具备最少的实验室培训即可完成操作。为了使现场检测尽可能快速简便，该流程分为两个部分：即预制成即用型试剂盒，以及实际进行LAMP检测。第一部分可在外部实验室完成，以便植物检疫人员在现场只需进行一次移液操作，即可完成DNA提取和LAMP检测。

尽管只有一个步骤，但对于缺乏或没有实验室经验的用户来说，移取少量液体可能具有挑战性。为解决这一问题，可在提取液中加入一种染料（cresol red），以便操作者能够直观确认少量液体（即， 2.5 µL DNA被正确转移至相应的离心管中。该方案的另一项重要简化是验证应用，因其有助于对LAMP结果进行可靠解读（补充文件 1).

通过检测瑞士常规进口检疫过程中截获的昆虫标本，已在家用实验室和现场条件下验证了新型B. tabaci LAMP检测方法的有效性8。总共分析了来自非洲、欧亚大陆和北美洲三个大洲的80个标本。在80个标本中，仅有3个（3.8%）被错误鉴定（假阴性）8。在分析这些假阴性标本的引物靶标DNA序列后发现，它们属于此前尚未报道过的新型B. tabaci单倍型8。基于这些结果，已对B. tabaci LAMP引物组进行了修改，并成功完成了重新验证8。

包括LAMP在内的任何基于DNA扩增的方法的一个主要局限性在于，它们只能识别预先设定的目标DNA序列8,27。因此，充分了解引物靶序列中存在的遗传变异对于确保诊断准确性至关重要8,27。然而，此类信息通常非常有限，尤其是在新出现的有害生物物种中8。尽管罕见，但靶序列发生突变仍可能导致假阴性结果8。针对当前B. tabaci LAMP检测中的这一问题，一种解决方案是将其与基于DNA条形码的技术相结合，该策略已在苏黎世机场口岸实施该诊断检测的过程中得以实现8。在此流程中，所有LAMP检测结果为阴性的样本均被送往外部实验室进行DNA条形码分析8。若发现尚未被描述的新型有害生物单倍型，可利用条形码分析获得的DNA序列对LAMP引物进行优化修改8。由此，尽管在LAMP结果为阴性时会略微降低检测速度，但通过这一两阶段流程可确保最高的诊断准确性8。

目前在边境点实施该LAMP检测的设置成本约为25,000美元。随着针对植物害虫（e.g., Erwinia amylovora、黄化病、以及 Guignardia citricarpa）开发的LAMP检测方法日益增多，此类一次性投资显得合理13,15,28。然而，该方案仍有进一步降低成本的潜力。例如，在95 °C进行DNA提取时，此处使用的恒温混匀仪可替换为成本更低的水浴锅，或直接在实时LAMP设备中完成此步骤。此外，涡旋振荡的混匀步骤可能通过手动弹击离心管来替代，而在DNA转移步骤中，移液器或可用无菌接种环代替。

未来，对烟粉虱（B. tabaci）及害虫种类进行快速鉴定的进一步改进，可能包括实施现场测序方法，从而在入境口岸（POEs）开展DNA条形码分析。一种有前景的候选技术是纳米孔测序技术。事实上，该技术最近已成功应用于热带雨林生物多样性评估的现场DNA条形码研究中8,29,30。现场DNA条形码鉴定系统可完全取代靶向诊断检测方法的开发及其验证过程，同时还能够收集有关害虫特性的额外信息，例如杀虫剂抗性基因8。然而，在新型测序技术实现常规应用之前，烟粉虱（B. tabaci）的LAMP检测法仍是一种快速（<1 h）且准确的鉴定手段。

披露

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作者 Michael Andreou 是 OptiGene Limited 的股东，该公司生产本文所用的试剂和仪器。其他作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Annette Grendelmeier、Aurelia Drenovac、Cornelia Studer、Daniel Frei、Elisabeth Razavi、Markus Oggenfuss、Seraina Vonzun 和 Sven Moeller 参与验证 B. tabaci LAMP 检测方法。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B. tabaci LAMP 引物混合物OptiGene Ltd.on request用于制备即用型
B. tabaci LAMP 试剂盒
离心机 MiniSpinEppendorf AG5452000010用于多个离心步骤
甲酚红（红色染料）Sigma-Aldrich Corp.114472DNA 提取液的组分
Eppendorf ThermoMixerEppendorf AG5382000015用于 DNA 提取
Genie II（现场 LAMP 分析设备）OptiGene Ltd.Genie® II用于 LAMP 分析
Genie Strips（8 孔 LAMP 管条）OptiGene Ltd.OP-0008-50用于制备即用型
B. tabaci LAMP 试剂盒
HotStarTaq Master MixQiagen AG203443用于生成阳性
扩增对照
Labcycler（PCR 仪）SensoQuest GmbH,
由 Witec AG 分销		011-103用于 DNA 提取
GspSSD Lyse n' Lamp 等温扩增主混合液OptiGene Ltd.ISO-001LNL用于制备即用型
B. tabaci LAMP 试剂盒
Mini centrifuge Labnet PrismLabnet International Inc.C1801用于多个离心步骤
NucleoFast 96 PCRMarcherey-Nagel GmbH743500.4用于纯化阳性
扩增对照
氢氧化钾溶液Sigma-Aldrich Corp.319376DNA 提取液的组分
Qbit 荧光计 3Thermo Fisher Scientific Corp.Q33226用于测定阳性对照的
DNA 浓度
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo Fisher ScientificQ32854用于纯化阳性
扩增对照
Safe-Lock 管 0.5 mL（微量离心管）Eppendorf AG0030 121.023用于 DNA 提取
Safe-Lock 管 2.0 mL（微量离心管）Eppendorf AG0030 120.094用于制备即用型
B. tabaci LAMP 试剂盒
木制牙签VWR International LLC470226-594用于 DNA 提取
Vortex-Genie 2（涡旋振荡器）Scientific Industries Inc.SI-0236用于多个混匀步骤

参考文献

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