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方法文章

在体外流动条件下同时研究单核细胞亚群的募集

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DOI：

10.3791/58509

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2018年11月26日

 ,  ,  ,  , 
1Hematology service, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 2Department of Pathology and Immunology, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Centre Médical Universitaire (CMU), Medical faculty, University of Geneva

本文内容

摘要

本文介绍了一种整合性实验方案，通过特异性表面标志物和共聚焦荧光显微镜，在体外流动条件下检测单核细胞亚群的迁移行为。该方案可用于研究单核细胞募集的连续步骤，也可通过其他特异性表面标志物对其他白细胞亚型进行分析。

摘要

单核细胞从血液中募集至特定外周组织，在组织损伤、肿瘤发生和自身免疫性疾病过程中的炎症反应中起着关键作用。这一过程通过单核细胞从自由流动状态被捕获到活化的内皮细胞管腔表面，随后黏附并穿越内皮层（即跨内皮迁移）进入下方受累组织而实现。然而，支持单核细胞亚群在特定条件下优先募集的机制目前尚未完全阐明。因此，我们建立了一种可在流动条件下同时可视化并定量不同单核细胞亚群募集过程的方法。该方法基于延时共聚焦成像技术，能够明确区分黏附的单核细胞与已发生跨内皮迁移的单核细胞。本文详细描述了如何利用该方法在体外同时研究促血管生成型与非血管生成型单核细胞的募集级联过程。此外，该方法还可拓展用于研究最多三种单核细胞群体募集过程中的各个步骤。

引言

单核细胞是先天免疫系统中具有吞噬功能的重要组成部分，在抵御病原体、清除受损组织、血管生成以及多种疾病（包括癌症）的病理生理过程中发挥关键作用1,2,3。单核细胞来源于骨髓，是一类具有异质性的细胞亚群，可在血液中循环，并通过特定的分子机制被募集至外周组织的炎症部位。单核细胞的募集过程与白细胞总体类似，涉及多个连续步骤，包括捕获、滚动、爬行、停滞、跨内皮迁移（即转迁移）以及穿过血管壁（包括基底膜和壁细胞）的迁移4。这些步骤主要依赖于内皮腔面在炎症诱导下表达的分子，如选择素、糖蛋白配体、趋化因子、细胞间黏附分子和连接黏附分子，以及白细胞表面相应的受体，例如选择素配体和整合素。白细胞可通过内皮细胞间的连接处（旁细胞途径）或直接穿过内皮细胞本体（跨细胞途径）穿越内皮屏障5。尽管历史上记录单核细胞主要通过跨细胞途径进行转迁移，但随着单核细胞不再被视为均一的细胞群体，其迁移路径可能存在差异的观点也逐渐被提出。目前日益明确的是，不同单核细胞亚群的特性可通过其在渗出级联反应中的差异与共性加以定义3,6。因此，为了明确区分不同的单核细胞亚群，至关重要的是在募集过程中对各亚群的行为进行可视化观察并表型分析。

人、猪、大鼠和小鼠的单核细胞被划分为具有特定功能和特异性迁移行为的表型亚群7,8,9例如，在人类中，单核细胞可根据其表面表达的CD14（细菌脂多糖的共受体）和CD16（Fc-γ受体III）分为三个亚群。人类单核细胞亚群包括经典的CD14+CD16-，中间型 CD14+CD16+ 非经典CD14暗淡CD16+ 细胞6,9经典CD14+CD16- 单核细胞被证明主要具有炎症特性，而CD16阳性单核细胞群体则+ 单核细胞被发现普遍表达TIE2并具有促血管生成功能10一致地，使用人肿瘤坏死因子（TNF）α或白细胞介素（IL-1）β等炎性细胞因子刺激内皮细胞（传统性炎症）足以触发经典CD14的完全募集+CD16- 单核细胞。然而，需要血管内皮生长因子（VEGF）A和TNFα的共同作用（由促血管生成因子驱动的炎症）才能引发CD16阳性单核细胞的跨内皮迁移+ 促血管生成单核细胞群3历史上，传统的Transwell系统在静态条件下、平行板流动腔以及µ-slide流动腔已被用于定量分析单个白细胞群体的募集。 体外11,12,13尽管这些方案已经过验证，但能够同时分析多种单核细胞亚群的更稳健方法将更具洞察力。此类方法必须考虑多种相互作用以及各亚群不同的频率，同时提供对定义每种单核细胞亚群募集级联过程中共性与特异性的机制性理解。

本文介绍一种基于在流动条件下对单核细胞募集进行延时成像的方法，该方法结合共聚焦显微镜，可同时研究不同单核细胞亚群的迁移级联过程。该方法整合了若干关键特征，能够模拟内皮细胞炎症状态以及后微静脉中循环单核细胞的血流动力学环境——后者是体内白细胞募集的主要部位。本方法采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），这些细胞通过已建立的从人脐带中分离提取的标准方案获得。这一临床资源作为生物副产品易于获取，同时可从脐静脉中分离获得数量可观的内皮细胞。我们还使用荧光染料和免疫荧光技术以区分不同的细胞组分，并通过共聚焦显微镜随时间明确界定单核细胞的位置（管腔侧 vs. 管腔外侧）。本文所述方案旨在同时测定单核细胞亚群的跨内皮迁移水平。此外，需注意的是，通过采用不同的生物标志物和标记方法，该技术还可拓展用于研究其他白细胞亚群及其募集过程。

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方案

人体材料的使用已获得志愿者捐献者的知情同意，并符合瑞士临床研究伦理委员会的规定。

1. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离与冻存

  1. 在开始 HUVEC 分离前，向 T75 培养瓶中加入 5 mL 包被液（含 0.1 mg/mL 胶原蛋白 G 和 0.2% 明胶的 pH 7.4 磷酸盐缓冲液 PBS），于 37 °C 孵育 30 分钟。
  2. 用 PBS 清洗脐带，以无菌纱布擦拭，并将其置于无菌的 20 cm 培养皿中。用无菌剪刀剪去脐带两端。
  3. 识别单根大静脉和两根小动脉。将连接三通止液夹的导管轻轻插入脐带两端的静脉末端。
  4. 用一段金属丝牢固地固定脐带与导管的连接处。
  5. 用含 100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 B 的 RPMI 培养基各 20 mL 对脐带灌注两次，以清洗脐静脉。此过程会使脐带外观变得更白更透明。在加入胶原酶前，用注射器从一端收集 RPMI 培养基，排空静脉。
  6. 用 12 mL 1 mg/mL I 型胶原酶溶液（经 0.22 µm 滤膜过滤）灌注静脉。
  7. 关闭脐带两端的止液夹，于 37 °C 孵育 12 分钟。
  8. 轻轻按摩脐带，使内皮细胞从静脉腔脱落。
  9. 用 50 mL 注射器吸取 30 mL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基，并连接至脐带一端。
  10. 将一个空的 50 mL 注射器连接至脐带另一端。
  11. 打开止液夹，从一端灌注静脉，同时从另一端交替收集液体。
    注意： 收集到的悬液中含有内皮细胞。
  12. 将该细胞悬液以 200 x g 离心 5 分钟。
  13. 弃去上清液，用 10 mL 完全 M199 培养基重悬细胞沉淀（M199 培养基含 20% 胎牛血清、15 µg/mL 内皮细胞生长补充物、100 µg/mL 肝素钠、0.5 µM 氢化可的松、10 µg/mL L-抗坏血酸、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 B）。
  14. 从 T75 培养瓶中移除包被液，并用 PBS 冲洗一次。
  15. 将步骤 1.13 收集的细胞接种至 T75 培养瓶中，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
  16. 次日，用完全 M199 培养基冲洗培养瓶 3 次以去除残留的红细胞，之后每 2 天更换一次培养基，直至细胞融合。
  17. 当细胞融合度达 80–90% 时，用 5 mL PBS 冲洗 HUVEC 单层细胞一次，再加入 5 mL 含 1 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶于 37 °C 消化 5 分钟。加入 4 mL M199 培养基和 1 mL 胎牛血清以终止胰蛋白酶作用。轻柔吹打培养瓶，使所有 HUVEC 脱落。
  18. 取 50 µL 细胞样品用于 VE-钙黏蛋白、PECAM-1 和 gp38 的染色，并通过流式细胞术分析以检测 HUVEC 纯度。
  19. 将步骤 1.18 剩余的 HUVEC 收集至 15 mL 离心管中，于室温下以 200 x g 离心 5 分钟。
  20. 弃去步骤 1.19 的上清液，用冻存液（含 10% DMSO 的胎牛血清）将细胞沉淀重悬至密度为 5 x 105 个细胞/mL，分装至冻存管中，于 -80 °C 或液氮中保存备用。
  21. 检测 HUVEC 纯度：
    1. 向步骤 1.18 收集的 50 µL HUVEC 样品中加入 1 µL 抗人 VE-钙黏蛋白-FITC 抗体、1 µL 抗人 PECAM-1-PE 抗体和 1 µL 抗人 Podoplanin-APC 抗体。
    2. 室温孵育 10 分钟。
    3. 加入 100 µL PBS，以 400 x g 离心 30 秒。
    4. 弃去上清液，用 100 µL PBS 重悬细胞。现在可通过流式细胞术获取数据。
      注意： HUVEC 对 VE-钙黏蛋白和 PECAM-1 呈阳性，对 Podoplanin 呈阴性。

2. HUVEC 解冻

注意：实验中使用低代次的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（最多不超过5代）。

  1. 在 37 °C 下，用 1 mL 包被液对 T75 培养瓶进行包被，孵育 30 分钟。
  2. 在 37 °C 下快速解冻 HUVEC 细胞 2 分钟，并将细胞重悬于 10 mL 完全 M199 培养基中。
  3. 在室温下以 200 × g 离心细胞 5 分钟，弃去上清液。
  4. 将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全 M199 培养基中。
  5. 将细胞悬液转移至预先包被的培养瓶中。将培养瓶置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中培养，每 2 天更换一次培养基。

3. 0.4 µ-Slide 培养小室中 HUVEC 的培养

  1. 在开始流体实验前五天，将含有0.1 mg/mL胶原蛋白G和0.2%明胶的30 µL PBS加入0.4 µ-载玻片的腔室中，于37 °C孵育30分钟，预先包被腔室。
  2. 用100 µL PBS洗涤腔室。
  3. 从T75培养瓶中处于80–90%融合状态的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）上消化细胞。
  4. 用5 mL PBS冲洗HUVEC，并加入5 mL 0.05%胰蛋白酶，在37 °C下消化5分钟以脱离细胞。
  5. 冲洗并收集细胞悬液至完全M199培养基中，采用最便捷的方法计数细胞。在室温下以200 × g离心5分钟。
  6. 将细胞沉淀重悬至浓度为106 个细胞/mL，每腔室加入30 µL（含30,000个细胞）。
  7. 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1小时。
  8. 向每个腔室加入150 µL完全M199培养基，在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养5天，每2天更换一次培养基。

4. 流动条件下内皮细胞单核细胞募集实验的染色

  1. 在细胞标记前，将由 M199 培养基和 1 µM CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）组成的标记培养基于 37 °C 预热 5 分钟。
  2. 用 37 °C 预热的 M199 培养基洗涤 HUVEC 细胞两次。
  3. 加入 30 µL 含 1 µM CMFDA 的预热标记培养基，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 10 分钟。
  4. 用完全 M199 培养基洗涤一次，然后在 37 °C、5% CO2 的培养箱中用完全 M199 培养基继续孵育细胞 30 分钟。
    注意：在加入标记溶液前必须彻底去除血清残留，否则可能影响 HUVEC 的染色效果。
  5. 更换为含人 TNFα（500 U/mL）或人 TNFα（500 U/mL）与人 VEGFA（1 µg/mL）混合物的完全 M199 培养基，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 6 小时。

5. 人泛单核细胞的分离及亚群染色

  1. 使用浓缩人血的血沉棕黄层，或采集于实验当日、含EDTA真空采血管中的20 mL新鲜分离人血。
  2. 用 PBS-1 mM EDTA 将血液稀释（1:1），轻轻将 20 mL 稀释后的血液加至 20 mL 密度梯度介质上方。以 400 × g 离心 g 室温下缓慢加速，无刹车，离心30分钟。
  3. 收集外周血单个核细胞（PBMC）-血小板层（位于密度梯度介质与血浆层之间），转移至含有40 mL PBS-1 mM EDTA的新的50 mL离心管中。用PBS-1 mM EDTA补至50 mL。
  4. 200 x g 离心 g 室温孵育5分钟。弃去上清液。
  5. 用10 mL染色缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白BSA的PBS-1 mM EDTA）重悬细胞沉淀。
  6. 以 200 x 离心 g 室温孵育5分钟。弃去上清液。
  7. 重复步骤 5.5 和 5.6。
  8. 用10 mL染色缓冲液重悬细胞沉淀。取一份等分试样 10 µL 用于细胞计数。
  9. 使用流式细胞仪快速检测PBMC群体并计数细胞。
    注意： 可以观察到特征性的淋巴细胞和单核细胞群体（图1A）。从 50 mL 新鲜人血中预计可获得 50–100 × 106 PBMC
  10. CD14+ 的招募 与 流式条件下的CD14- PBMC:
    1. 用流式缓冲液（含0.5% BSA的M199）洗涤细胞沉淀3次，并将单个核细胞重悬于流式缓冲液中，浓度为6 x 10⁶6 每毫升细胞数
    2. 分装成等份 200 µL 每次检测。在 37 °C 直到检测前20分钟
    3. 添加 5 µL 抗CD14-PE和Hoechst 33342，终浓度为 2 µM 向每份等分试样中加入。混匀后于 37 °C 10 分钟。
    4. 将等分试样在400 x g离心 g 30秒。
    5. 弃去上清液，用缓冲液重悬沉淀物 200 µL 流式缓冲液。
  11. 在流动条件下单核细胞亚群的募集:
    1. 使用全单核细胞分离试剂盒，按照制造商说明书分离单核细胞。
      注意： 以下分离方案适用于 50 x 106 细胞。只要在制造商建议的范围内，均可进行扩增或缩小。
    2. 将 PBMC 悬液以 200 x g 室温下孵育5分钟。
    3. 弃去上清液，用缓冲液重悬沉淀物 400 µL 染色缓冲液
    4. 添加 50 µL Fc受体阻断试剂的 50 µL Pan 单核细胞抗体混合液
    5. 室温孵育10分钟。
    6. 添加 400 µL 染色缓冲液和 100 µL 磁珠偶联抗生物素抗体。室温孵育15分钟。
    7. 加入2 mL染色缓冲液，使用与磁铁偶联的MACS LS柱。
    8. 将LS柱置于磁铁上，加入1 mL染色缓冲液，弃去穿流液。
    9. 将PBMC悬液通过柱子，收集含有泛单核细胞的澄清流穿液至新的15 mL离心管中。
    10. 加入染色缓冲液至终体积5 mL。
    11. 取一份等分试样，使用流式细胞仪检测单核细胞分离的质量。
    12. 确定全单核细胞计数。
      注意： 仅能观察到单核细胞群体 （图1B）.
    13. 离心步骤5.11.11中剩余的单核细胞，200 x g 5 分钟。
    14. 弃去上清液。
    15. 将细胞沉淀重悬于5 mL流式缓冲液（含0.5% BSA的M199培养基）中。
    16. 重复步骤 5.11.13 至 5.11.14 两次，以彻底去除 EDTA 残留。
  12. 在流式缓冲液（M199 加 0.5% BSA）中制备单核细胞悬液，浓度为 6 x 106 cells/mL
  13. 分装成等份 200 µL 每次招募实验所需的单核细胞数量。
  14. 保持分装样本于 37 °C 在注射前20分钟从培养箱中取出。
  15. 添加 5 µL 抗CD16-PE抗体和Hoechst 33342（2 µM 最终）加入至每份等量样品中。
  16. 混合并在指定条件下孵育 37 °C 10 分钟
  17. 将等分试样在400 x g条件下离心 g 30 秒。
  18. 弃去上清液，用缓冲液重悬沉淀物 250 µL 流式缓冲液
  19. 添加 30 µL 将单核细胞悬液加入载玻片的一个腔室中，用于在共聚焦显微镜上设置采集参数。
  20. 将第5.18步中制备的单核细胞悬液分装样品保存于 37 °C.
    注意： 该悬浮液已准备好注入流动系统。

6. 流体系统的准备

  1. 确保用于成像的细胞培养箱温度设置为 37 °C。
    注意： 流动系统的示意图见图 2。
  2. 组装管路部分 I：将一个公型鲁尔接头插入一段硅胶管（8 cm 长，3 mm 厚）的一端，另一端连接至在线鲁尔注射装置。将该鲁尔接头的另一端连接至另一段硅胶管（40 cm 长，3 mm 厚）的一端。
    注意： 可选地，可在在线鲁尔注射装置与硅胶管之间插入一个三通旋塞，并连接一个 5 mL 注射器，以便去除可能存在的气泡。
  3. 组装管路部分 II：将一个 20 mL 注射器连接至一段硅胶管（1 m 长，3 mm 厚）的一端。在管路的另一端插入一个公型鲁尔接头。
  4. 通过将两个公型鲁尔接头插入一个母型鲁尔锁紧耦合器，连接管路部分 I 和部分 II（图 2A）。
  5. 将硅胶管的自由端放入盛有预热至 37 °C 的流动缓冲液（M199 + 0.5% BSA）的储液槽中。
  6. 拉动 20 mL 注射器的活塞，使管路中充满流动缓冲液。
  7. 将注射器安装到泵上并固定。
  8. 将泵设置为抽吸模式（而非灌注模式），并设定流速。
  9. 根据所使用的 IBIDI 载片，使用以下公式确定流速：
    流速方程：剪切应力除以缓冲液黏度与载片因子；流体动力学公式。
    注意：载片因子取决于实验中所使用的 IBIDI 载片类型。本示例中使用的 µ-slide I0.4 Luer lock 载片因子为 131.6。具体载片因子请参见公司官网14。流动缓冲液的黏度为 0.0072 dyn.s/cm2。后微静脉处的剪切应力约为 0.5 dyn/cm2。
  10. 连接载片（图 2B）：
    1. 用夹具夹住母型鲁尔锁紧耦合器周围的硅胶管，并将两个公型鲁尔接头从耦合器上断开。
    2. 将它们分别连接至载片中含刺激后 HUVEC 的储液室，并用培养基充满。此步骤应避免产生气泡。
    3. 取下夹具，确保连接处无泄漏。
  11. 将载片置于显微镜下进行延时成像，并启动泵。

7. 通过共聚焦显微镜进行流动条件下单核细胞募集的延时成像

  1. 使用40倍物镜（见材料表）进行成像。
  2. 启动405 nm（蓝色单核细胞核）、488 nm（绿色内皮细胞）和561 nm（红色CD16+亚群）激光器。
  3. 使用含有单核细胞的腔室设置采集参数。
    注意： 为同时检测未迁移和已迁移的单核细胞，需将405 nm激光的针孔和激光强度设置较高。因此，未迁移的单核细胞在基底层面可轻微可见，但只有已迁移的单核细胞在细胞核周围呈现未染色区域，该区域对应其位于内皮细胞下方所占据的新空间。
  4. 将待采集的腔室置于显微镜下。
  5. 在1 cm半径范围内选择3个视野，用于多点共聚焦成像。
  6. 确定内皮细胞的基底侧和顶侧。
  7. 设置z轴堆栈范围为10–12 µm（步长0.5 µm），每1分钟进行一次时间序列采集。
  8. 成像3分钟后，通过在线鲁尔注射口注入200 µL单核细胞悬液（6x106 个细胞/mL）。
    注意： 单核细胞迅速出现在顶焦平面，黏附并开始迁移（从顶侧向基底侧移动）。
  9. 至少成像30分钟。完成后停止成像并停止流动，夹闭管路以将其从载玻片上断开。
  10. 用4%多聚甲醛在4 °C固定载玻片10分钟。
  11. 用PBS洗涤载玻片，如需进一步分析，将载玻片在4 °C保存。

8. 使用 ImageJ 分析数据

  1. 计数每个视野中总的贴壁单核细胞数量，计算每 mm2 的细胞数。
  2. 计数位于内皮细胞下方基底侧平面中、且在细胞核周围可见黑色空斑（绿色荧光通道）的跨膜迁移单核细胞。
  3. 将跨膜迁移的白细胞数量除以总的贴壁白细胞数量，跨膜迁移率以贴壁单核细胞的百分比表示。
  4. 为便于说明，可同时显示顶端侧和基底侧，以展示发生在这些内皮细胞区室中的事件。

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结果

确定TNFα诱导的HUVEC活化状态

炎性细胞因子TNFα的生物活性可能因批次不同以及冻融循环次数而有所变化。因此，检测TNFα处理后HUVEC的活化状态非常重要。可通过平行染色检测汇合的HUVEC样本中选择素、ICAM-1和VCAM-1的炎性诱导情况来实现15,16,17。另一种更简便的方法是观察内皮细胞在炎性刺激下发生的形态学变化，以判断HUVEC的活化状态。如图3所示，在TNFα存在条件下培养6小时后，HUVEC相较于未刺激细胞出现明显的伸长现象。当HUVEC受到TNFα与VEGFA混合刺激时，也可观察到类似的伸长变化。记录HUVEC的活化状态至关重要，因为单核细胞跨内皮迁移实验的最终结果将取决于内皮细胞活化...

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讨论

本文报道了一种详细研究单核细胞亚群如何穿过炎症激活的内皮单层的方法。该方法采用共聚焦显微镜，而非相衬显微镜——后者也常用于在流动条件下研究单核细胞的募集过程3,11,19。使用共聚焦显微镜进行延时成像的一个主要优势在于，能够明确区分单核细胞的跨内皮迁移与强黏附状态。尽管基于相衬显微镜的方法同样可靠，但其应用需要操作者具备一定经验，以避免将已迁移的细胞与强烈黏附的细胞混淆。在此情况下，必须建立严格的分析标准，以清晰区分单核细胞募集级联过程中的这两种状态。此外，还应通过共聚焦显微镜进行终点分析，以验证相衬显微镜所观察到的整体趋势。因此，直接采用共聚焦显微镜在流动条件下研究单核细胞募集，可对所捕获单核细胞的实际跨内皮迁移状态提供清晰明确的结果。

在流动条件下使用相差显微镜进行白细胞募集实验时，主要瓶颈之一是分析过程耗时较长，需要从捕获到穿过内皮细胞间连接发生跨内皮迁移的整个过程中追踪单个细胞。尽管此类分...

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

感谢 Paul Bradfield 博士对文稿的审阅和反馈。A. S. 收到了来自 Sir Jules Thorn 慈善海外信托注册机构的经济支持，

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
75 cm² 组织培养瓶2TPP90076分离的HUVEC常规培养
µ-滑片 VI 0.4IBIDI80606
15 mL 离心管TPP191015
50 mL 离心管TPP191050
胶原蛋白 GBiochromL 7213用于细胞培养瓶的包被
明胶Sigma-Aldrich1393用于细胞培养瓶的包被
杜尔贝科’无氯化镁磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline, PBS）2 和 CaCl2)Sigma-AldrichD8537
杜尔贝科’含MgCl的磷酸盐缓冲液（PBS）2 和 CaCl2)Sigma-AldrichD8662
RPMI-1640 培养基Sigma-AldrichR8758
三通旋塞阀BIO-RAD7328103
青霉素 10,000 μ/mL 链霉素 10,000 μg/mL 药物真菌素 25 μ/mLAMIMED4-02F00-H
I型胶原酶沃辛顿LS004216
含Earle's盐、L-谷氨酰胺、25 mM HEPES的Medium 199 1xGIBCO22340020
牛血清白蛋白第五组分赛默飞世尔科技15260037
内皮细胞生长补充剂，150 mgMillipore02-102
肝素钠Sigma-AldrichH3149RT
氢化可的松Sigma-AldrichH6909
L-抗坏血酸Sigma-AldrichA 4544
EDTA 二钠盐二水合物 C10H14N2Na2O8 · 2H2OAPPLICHEMA2937.0500
CD144（VE-钙黏蛋白），人重组克隆：REA199，FITCMiltenyi Biotech130-100-713AB_2655150
CD31-PE 抗体，人源重组克隆：REA730，PEMiltenyi Biotech130-110-807AB_2657280
抗Podoplanin-APC，人重组单抗：REA446，APCMiltenyi Biotech130-107-016AB_2653263
BD Accuri C6 PlusBD生物科学
µ-滑动式鲁尔接头IBIDI80176
CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）赛默飞世尔科技C2925
重组人TNFαPeprotech300-01A
重组人 VEGFAPeprotech100-20
NE-1000 可编程注射泵KF技术NE-1000
Ficoll Paque PlusGE Healthcare17-1440-02
抗人 CD14-PE，人重组克隆：REA599，PEMiltenyi Biotech130-110-519AB_2655051
人全单核细胞分离试剂盒Miltenyi Biotech130-096-537
抗人 CD16-PE，人重组克隆：REA423，PEMiltenyi Biotech130-106-762AB_2655403
LS 柱Miltenyi Biotech130-042-401
QuadroMACS 分离器Miltenyi Biotech130-090-976
Hoechst 33342三盐酸盐三水合物ThermoFisherH1399
硅胶管IBIDI10841
肘型鲁尔接头IBIDI10802
女性鲁尔锁接头IBIDI10823
鲁尔锁母接头IBIDI10825
直通式鲁尔注射端口IBIDI10820
Ar1 共聚焦显微镜尼康
40倍物镜尼康40倍 0.6 数值孔径 CFI 超长工作距离平场荧光物镜 工作距离：3.6–2.8 mm 校正范围 0–2 mm
ImageJ 软件美国国立卫生研究院

参考文献

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