同时对多个啮齿类动物脑组织进行冷冻切片

摘要

本文介绍一种可同时对多只动物的脑组织进行冷冻切片的实验方案，作为替代单个处理脑组织的省时方法。该方法可降低免疫组织化学染色过程中的变异性和减少冷冻切片及成像所需的时间。

摘要

组织学和免疫组织化学是用于观察显微解剖结构及定位生物组织内蛋白质的常规分析方法。这些技术广泛应用于神经科学以及众多其他科学领域。免疫组织化学实验可在载玻片上固定的组织或游离漂浮切片上进行。制备载玻片固定样本是一个耗时较长的过程。以下介绍一种名为“Megabrain”的技术，通过将多个脑组织整合为一个单一的冷冻组织块，使冷冻切片和组织贴片所需时间最多减少90%。此外，在一项大规模组织化学研究中，该技术还降低了不同染色轮次之间的变异性。目前该技术已针对啮齿类动物脑组织在后续免疫组织化学分析中的应用进行了优化；但也可适用于其他需要冷冻切片技术的科学领域。

引言

本文介绍了一种新方法——我们称之为Megabrain——的实验方案，该方法旨在同时对多个啮齿类动物脑组织进行冷冻切片，以用于后续的免疫组织化学实验。Megabrain技术可实现单张载玻片上包含来自多个动物的脑组织。该技术已优化为可同时切割9个成年大鼠半脑或5个成年完整脑组织的冠状切片。因此，该技术最适用于大规模免疫组织化学研究，或其他需要在载玻片上进行脑组织分析的大样本动物实验。

免疫组织化学通过使用针对特定目标蛋白的特异性抗体，来研究和表征这些蛋白在特定组织中的表达情况及细胞水平的变化^1,2,3。在神经科学研究及其他科学领域中，免疫组织化学被广泛应用，有助于深入理解脑组织的细胞与分子机制⁴。涉及大量动物和脑切片的大规模研究往往耗费大量资源和时间。因此，开发“Megabrain”具有多方面的意义：可减少冷冻切片、贴片和染色过程所需的时间，同时降低试剂用量。此外，该方法能够简化操作流程，实现多个脑组织在同一批次中同时染色，从而减轻免疫组织化学中常见的不同染色批次之间的变异问题³。另外，对Megabrain进行切片相比逐个切片冷冻啮齿类动物脑组织更为节省时间，并可通过显微镜技术快速比较不同动物甚至不同....

方案

Megabrain 技术已使用经心脏灌注 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）后，再灌注 4% 多聚甲醛的雄性成年 C57Bl6 小鼠⁵、幼年 Sprague-Dawley 大鼠以及成年 Sprague-Dawley 大鼠的完整脑和半脑组织进行优化⁶。该技术在其他品系的小鼠和大鼠中，无论性别与年龄差异，均可获得类似结果。本研究论文所用数据来自幼年 Sprague-Dawley 大鼠，实验方案经亚利桑那大学机构动物照护与使用委员会批准，实验动物的饲养和管理均遵循《实验动物照护与使用指南》⁷。

1. 灌注大脑的冷冻保护

1. 成功进行经心脏灌注⁶后，从动物体内取出完整脑组织^6,8，并将其置于含有25 mL 4%多聚甲醛PBS溶液的容器中，固定24小时。
   注意：多聚甲醛是一种有毒的组织固定剂，操作时需谨慎。应在化学通风橱内将多聚甲醛转移至专门标记的废液容器中，并注明其浓度和体积，随后存放于化学废液柜中，待化学安全人员或经过专业培训的人员处理。
2. 24小时后，在通风橱内使用刮铲将脑组织从4%多聚甲醛溶液中取出，转移至含有约20 mL 15....

结果

本实验成功的最终结果是组织平整地贴附在载玻片上，无气泡或撕裂，并保持其冷冻时的方向。由于在OCT包埋时对脑组织的精确定位以及良好的标记（如图1所示），切片在载玻片上分布均匀且易于识别。假设脑组织来源于年龄相近的动物，并且在OCT中组织已正确对齐，则同一张载玻片上收集的切片应代表相似的冠状切面，从而允许在不同动物之间比较脑区。若组织冷冻良好，冰冻伪影最小，可进行苏木精-伊红（H&E）染色以评估冷冻保护的质量⁹。免疫组织化学染色也可按图6所示染色结果的方法进行。

讨论

在操作过程中应注意，必须持续监测大鼠脑组织及其周围环境的温度，以防止组织解冻和再次冻结。大鼠脑组织从-20 °C冰箱中取出的操作最多不得超过3次，因为每次接触并将其置于温度较高且波动的冰冻切片机中时，组织都会发生解冻和再冻结，导致组织呈现胶冻状质地及异常的结构完整性¹⁰。因此，最佳方案是一次性完成大鼠脑组织的切片。

组织固定和冷冻保护是本方案中的关键步骤，旨在最大限度地减少冰晶形成、抑制外部微生物生长并终止酶促反应，从而保持组织完整性¹⁰。如果脑组织未用蔗糖进行冷冻保护，则在冷冻过程中组织内的水分会形成冰晶，导致组织被撕裂并产生空洞。尽管我们建议使用TBS中梯度递增的蔗糖溶液，但脑组织也可直接置于30%蔗糖溶液中较长时间（48–72小时）以达到类似的冷冻保护效果。然而，强烈建议使用TBS配制蔗糖溶液；若改用PBS或水等替代方案，将导致Megabrain的冷冻保护效果不佳及组织质量下降。苏木精-伊红（H&E）染色可用于评估冷冻保护的质量以及由此产生的冷冻伪影

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Andwin scientific 组织冷冻包埋剂 Tissue-Tek CRYO-OCT（每箱12瓶）	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon 一次性 Peel-A-Way 包埋模具	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand 高精度直头宽尖强韧镊子/持针钳	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL 高密度聚乙烯闪烁瓶，带聚丙烯盖	Fisher Scientific	03-337-23
蔗糖，聚乙烯瓶装，2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	需配制 15% 和 30% 两种浓度的蔗糖溶液。
2-甲基丁烷（认证级），Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX 高型烧杯	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand 通用型玻璃液体温度计（部分浸入式，-50 至 +50 °C）	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand 药匙铲	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY 剃刀刀片	Grainger	4A807
Edge-Rite 切片机刀片	Fisher Scientific	14-070-60
显微镜载玻片（1" 磨砂面）— 白色	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS（磷酸盐缓冲液）10x，pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	使用前稀释至 1X
15 件套精细画笔	Amazon	B079J12ZRV
疏水笔（PAP pen）	abcam	ab2601
图4所示样品台由实验室技术人员定制加工，但其他公司也可商业订购类似尺寸的产品。	Electron Microscopy Sciences	EMS065