同时对多个啮齿类动物脑组织进行冷冻切片

摘要

本文介绍一种可同时对多只动物的脑组织进行冷冻切片的实验方案，作为替代单个处理脑组织的省时方法。该方法可降低免疫组织化学染色过程中的变异性和减少冷冻切片及成像所需的时间。

摘要

组织学和免疫组织化学是用于观察显微解剖结构及定位生物组织内蛋白质的常规分析方法。这些技术广泛应用于神经科学以及众多其他科学领域。免疫组织化学实验可在载玻片上固定的组织或游离漂浮切片上进行。制备载玻片固定样本是一个耗时较长的过程。以下介绍一种名为“Megabrain”的技术，通过将多个脑组织整合为一个单一的冷冻组织块，使冷冻切片和组织贴片所需时间最多减少90%。此外，在一项大规模组织化学研究中，该技术还降低了不同染色轮次之间的变异性。目前该技术已针对啮齿类动物脑组织在后续免疫组织化学分析中的应用进行了优化；但也可适用于其他需要冷冻切片技术的科学领域。

引言

本文介绍了一种新方法——我们称之为Megabrain——的实验方案，该方法旨在同时对多个啮齿类动物脑组织进行冷冻切片，以用于后续的免疫组织化学实验。Megabrain技术可实现单张载玻片上包含来自多个动物的脑组织。该技术已优化为可同时切割9个成年大鼠半脑或5个成年完整脑组织的冠状切片。因此，该技术最适用于大规模免疫组织化学研究，或其他需要在载玻片上进行脑组织分析的大样本动物实验。

免疫组织化学通过使用针对特定目标蛋白的特异性抗体，来研究和表征这些蛋白在特定组织中的表达情况及细胞水平的变化^1,2,3。在神经科学研究及其他科学领域中，免疫组织化学被广泛应用，有助于深入理解脑组织的细胞与分子机制⁴。涉及大量动物和脑切片的大规模研究往往耗费大量资源和时间。因此，开发“Megabrain”具有多方面的意义：可减少冷冻切片、贴片和染色过程所需的时间，同时降低试剂用量。此外，该方法能够简化操作流程，实现多个脑组织在同一批次中同时染色，从而减轻免疫组织化学中常见的不同染色批次之间的变异问题³。另外，对Megabrain进行切片相比逐个切片冷冻啮齿类动物脑组织更为节省时间，并可通过显微镜技术快速比较不同动物甚至不同处理组之间的组织差异。

方案

Megabrain 技术已使用经心脏灌注 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）后，再灌注 4% 多聚甲醛的雄性成年 C57Bl6 小鼠⁵、幼年 Sprague-Dawley 大鼠以及成年 Sprague-Dawley 大鼠的完整脑和半脑组织进行优化⁶。该技术在其他品系的小鼠和大鼠中，无论性别与年龄差异，均可获得类似结果。本研究论文所用数据来自幼年 Sprague-Dawley 大鼠，实验方案经亚利桑那大学机构动物照护与使用委员会批准，实验动物的饲养和管理均遵循《实验动物照护与使用指南》⁷。

1. 灌注大脑的冷冻保护

1. 成功进行经心脏灌注⁶后，从动物体内取出完整脑组织^6,8，并将其置于含有25 mL 4%多聚甲醛PBS溶液的容器中，固定24小时。
   注意：多聚甲醛是一种有毒的组织固定剂，操作时需谨慎。应在化学通风橱内将多聚甲醛转移至专门标记的废液容器中，并注明其浓度和体积，随后存放于化学废液柜中，待化学安全人员或经过专业培训的人员处理。
2. 24小时后，在通风橱内使用刮铲将脑组织从4%多聚甲醛溶液中取出，转移至含有约20 mL 15%蔗糖溶液（溶于1×Tris缓冲盐水，TBS）的容器中，直至脑组织沉降至容器底部（约需24小时）。
3. 随后，将脑组织转移至另一含有约20 mL 30%蔗糖溶液（溶于1×TBS）的容器中，直至脑组织完全沉降至容器底部（约需24–48小时）。

2. 脑组织冷冻

1. 将一个500 mL的玻璃烧杯放置在冰桶中的干冰床上。向玻璃烧杯中倒入300–400 mL异戊烷（2-甲基丁烷）。
2. 使异戊烷的温度降至-45 °C至-50 °C之间。使用温度计密切监测并维持此温度范围，在整个操作过程中保持恒定。确保温度读数取自溶液中部，且测量时温度计不得接触烧杯底部或侧壁。
3. 在实验台面上，取一次性包埋模具（见材料列表），加入约1/2体积的包埋剂OCT（Optimal Cutting Temperature，见材料表）。确保OCT中无气泡；如有气泡，用刮刀或针头将其去除。
4. 用刮刀从30%蔗糖瓶中取出第一只脑组织。根据实验设计，此时可选择整体冷冻脑组织或进行半脑切分。
   1. 对于需半脑切分的样本，使用新的剃须刀片在组织上做一干净切割，以分离左右半球。若研究不需要小脑和嗅球，可在该步骤将其去除。若研究需要小脑，建议在脑组织后端切出一个平整面，以便脑组织在模具中直立放置。若研究仅需局部脑区组织，可使用啮齿类脑矩阵根据已知坐标对脑组织进行定位切块。
5. 为脑组织建立数字编号系统。绘制如图1所示示意图。将第一个放入Megabrain模具的脑组织编号写在位置2，位置1留空，以便快速识别脑组织冷冻时的方向。
6. 使用钝头镊子夹取将要放入位置1的脑组织。使待切面朝上，调整脑组织方向。将脑组织缓缓放入OCT中的相应位置，并用镊子微调其位置，直至其能独立直立。
7. 对需放入位置3–10的其余脑组织或半脑重复步骤2.3–2.5。避免将脑组织或半脑以对称方式排列。
8. 检查Megabrain模具中的全部9个脑组织。当所有脑组织均能独立、直立且方向正确地固定于OCT中后（如图2B所示），向模具中继续添加OCT，直至完全覆盖脑组织顶部。再次确认OCT中无可见气泡。
9. 用镊子夹住模具一角，确保镊子不部分浸入OCT中（见图3A）。小心保持模具水平，将模具缓慢浸入异戊烷（-45 °C至-50 °C）中，使模具底部约三分之一部分浸没。保持此状态，使OCT中的气泡上升至表面并远离组织（见图3B）。
10. 30秒后，将整个模具完全浸入异戊烷中，并松开镊子，使Megabrain在异戊烷中至少浸泡3分钟（见图3C）。确保模具始终保持水平，以使脑组织保持直立且间距均匀（见图3D）。
11. 3分钟后，用镊子将含有已冷冻并包埋于OCT中的脑组织的模具从异戊烷中取出（见图3E）。
12. 立即用铝箔包裹模具及其内容物，并标注动物编号或Megabrain识别号。尽量减少接触已冷冻的Megabrain，以防组织解冻。
13. 该Megabrain现在可转移至-20 °C冰箱中，至少保存24小时。
    注意：本方案可在此暂停，Megabrain可在冷冻状态下长期保存，直至进行冰冻切片。

3. 准备大鼠脑组织以进行冰冻切片机切片

1. 将冷冻切片机的箱内温度设置为 -19 °C。确保在继续操作前已达到该温度。在整个切片过程中，确保箱内温度保持在 -18 °C 至 -20 °C 之间。
2. 从 -20 °C 冰箱中取出Megabrain，并将其放入冷冻切片机中。同时，将合适尺寸的样品头以及两支细头画笔放入冷冻切片机内。将Megabrain和样品头在冷冻切片机中静置至少15分钟，使其温度与冷冻切片机内部温度平衡。
3. 用Megabrain的编号和玻片编号正确标记载玻片，并将这些载玻片放置于玻片加热台（35–45 °C）上。
4. 将Megabrain从铝箔纸中取出。使用刀片垂直切割模具的四个角，以便于将OCT包埋块从模具中轻松取出（图4A）。
5. 在样品头上 dispensing 一层薄薄的OCT（厚度约为3 mm）。
6. 迅速将Megabrain放置在样品头上，尽量减少手指与OCT的接触，确保其处于所需的方向。也可使用大号镊子完成此步骤，以减少样品融化。在开始切片前，将已固定的Megabrain连同样品头在冷冻切片机中静置15–20分钟，使OCT完全冻结。
7. 当底部OCT层完全冻结后，在Megabrain四周涂上约2 mm厚的OCT，使其自然流下并覆盖样品头边缘，以增强Megabrain与样品头之间的固定效果。再次在继续操作前，将已固定的样品在冷冻切片机中静置15–20分钟，使OCT完全冻结。
8. 使用刀片去除样品头侧面或底部多余的OCT（图4B）。

4. 大脑的冷冻切片

1. 开始前，确保可获取一个装有至少 20 mL 1× PBS 的烧杯。
2. 将安装了Megabrain的持样器放入冰冻切片机的持样器头中（图 4B）。
3. 设置冰冻切片机以所需的切片厚度进行切片。当前方法已针对 10 µm 至 50 µm 的切片厚度进行了优化。
4. 根据需要修切OCT包埋剂和组织，以暴露目标脑区用于组织收集（图 4C）。
5. 准备收集组织时，降低防卷板直至其接触载物台，然后转动冰冻切片机手柄以切出单一切片。缓慢抬起防卷板，注意确保切下的Megabrain切片未粘附在防卷板上，且不会从载物台上脱落（图 4D）。
6. 轻轻使用画笔将Megabrain切片展开，使其平铺于冰冻切片机载物台上（图 5A）。（如有需要，可用画笔压住OCT以防止其卷曲）。
7. 从载片加热台上取下载玻片，并将载玻片标签面朝下悬于载物台上的Megabrain切片上方，使切片粘附至载玻片。
8. 迅速在载玻片上的每个组织切片上滴加一滴 1× PBS，并在用画笔展平前防止其干燥（见步骤 4.9）。
9. 使用蘸有 1× PBS 的细头画笔轻刷组织中的气泡，并将组织展开使其完全平铺于载玻片上（图 5B）。操作时注意不要改变脑切片的位置，以免丧失其与其他组织切片的相对位置关系。小心操作组织以避免撕裂。将脑切片置于载玻片中央，远离边缘，因为在某些染色方案中，边缘区域需用于盖玻片和PAP笔的使用。
10. 将载玻片放回载片加热台，干燥 45 分钟。根据需要进行覆盖，防止灰尘落在组织上。干燥后，将载玻片储存于 -80 °C，直至后续使用。

结果

本实验的阳性结果是组织平整地贴附在载玻片上，无气泡或撕裂，且保持其冷冻时的方向。由于在OCT包埋时脑组织放置得当，并有良好的标记（如图1所示），组织切片间距均匀，易于识别。假设脑组织来源于年龄相近的动物，并且在OCT中组织已正确对齐，则载玻片上的切片应代表相似的冠状面，从而允许在不同动物之间比较脑区。只要组织冷冻良好，冰冻伪影最小化，即可进行苏木精-伊红（H&E）染色以评估冷冻保护的质量⁹。免疫组织化学染色也可按图6所示染色结果进行操作。

讨论

在操作过程中应注意，必须持续监测大鼠脑组织及其周围环境的温度，以防止组织解冻和再次冻结。大鼠脑组织从-20 °C冰箱中取出的操作最多不得超过3次，因为每次接触并将其置于温度较高且波动的冰冻切片机中时，组织都会发生解冻和再冻结，导致组织呈现胶冻状质地及异常的结构完整性¹⁰。因此，最佳方案是一次性完成大鼠脑组织的切片。

组织固定和冷冻保护是本方案中的关键步骤，旨在最大限度地减少冰晶形成、抑制外部微生物生长并终止酶促反应，从而保持组织完整性¹⁰。如果脑组织未用蔗糖进行冷冻保护，则在冷冻过程中组织内的水分会形成冰晶，导致组织被撕裂并产生空洞。尽管我们建议使用TBS中梯度递增的蔗糖溶液，但脑组织也可直接置于30%蔗糖溶液中较长时间（48–72小时）以达到类似的冷冻保护效果。然而，强烈建议使用TBS配制蔗糖溶液；若改用PBS或水等替代方案，将导致Megabrain的冷冻保护效果不佳及组织质量下降。苏木精-伊红（H&E）染色可用于评估冷冻保护的质量以及由此产生的冷冻伪影

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Andwin scientific 组织冷冻包埋剂 Tissue-Tek CRYO-OCT（每箱12瓶）	Fisher Scientific	14-373-65
Thermo Scientific Shandon 一次性 Peel-A-Way 包埋模具	Fisher Scientific	18-41
Fisherbrand 高精度直头宽尖强韧镊子/持针钳	Fisher Scientific	12-000-128
Fisherbrand 20 mL 高密度聚乙烯闪烁瓶，带聚丙烯盖	Fisher Scientific	03-337-23
蔗糖，聚乙烯瓶装，2.5 kg	Fisher Scientific	S2-212	需配制 15% 和 30% 两种浓度的蔗糖溶液。
2-甲基丁烷（认证级），Fisher Chemical	Fisher Scientific	O3551-4
PYREX 高型烧杯	Fisher Scientific	02-546E
Fisherbrand 通用型玻璃液体温度计（部分浸入式，-50 至 +50 °C）	Fisher Scientific	13-201-642
Fisherbrand 药匙铲	Fisher Scientific	14-357Q
STANLEY 剃刀刀片	Grainger	4A807
Edge-Rite 切片机刀片	Fisher Scientific	14-070-60
显微镜载玻片（1" 磨砂面）— 白色	Fisher Scientific	22-034-979
Gibco PBS（磷酸盐缓冲液）10x，pH 7.2	Fisher Scientific	70-013-032	使用前稀释至 1X
15 件套精细画笔	Amazon	B079J12ZRV
疏水笔（PAP pen）	abcam	ab2601
图4所示样品台由实验室技术人员定制加工，但其他公司也可商业订购类似尺寸的产品。	Electron Microscopy Sciences	EMS065