方法文章

一种用于活体可视化及活体分析生物材料相关反应的斑马鱼胚胎模型 金黄色葡萄球菌 感染

DOI：

10.3791/58523

⸱

2019年1月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究描述了一种基于荧光显微镜技术的斑马鱼胚胎模型，可用于活体可视化及随时间动态进行生物材料相关感染的活体分析。该模型是一种有前景的研究体系，可作为小鼠等哺乳动物模型的补充，用于体内研究生物材料相关感染。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物材料相关感染（BAI）是导致生物材料/医疗器械失效的主要原因。 金黄色葡萄球菌 是导致骨整合感染（BAI）的主要病原体之一。目前用于BAI研究的哺乳动物实验模型（如小鼠模型）成本高且耗时长，因此不适合高通量分析。因此，亟需建立新型动物模型作为补充体系，以实现在体内研究BAI。在本研究中，我们旨在建立一种基于荧光显微镜技术的斑马鱼胚胎模型，用于在生物材料存在条件下对细菌感染进行活体可视化和实时分析。此外，还研究了由此引发的巨噬细胞反应。为此，我们采用了表达荧光蛋白的 S. aureus 以及在巨噬细胞中表达荧光蛋白的转基因斑马鱼胚胎，并建立了一种将细菌单独或与微球共同注射到胚胎肌肉组织中的实验方法。为了实时监测活体胚胎中细菌感染的进展过程，我们设计了一种简单且可靠的荧光细菌显微评分方法。显微评分结果显示，所有细菌数量超过20个菌落形成单位（CFU）的胚胎均能检测到阳性荧光信号。为研究生物材料对感染的潜在影响，我们测定了不同组别中细菌的CFU数量 S. aureus 含和不含10 µm聚苯乙烯微球（PS10）作为胚胎中的模型生物材料。此外，我们使用了ObjectJ项目文件 "斑马鱼免疫检测" 在 ImageJ 中操作以定量荧光强度 S. aureus 有无PS条件下的感染10 随着时间的推移。两种方法的结果均显示数量较高 S. aureus 在感染的胚胎中，含有微球的胚胎比不含微球的胚胎表现出更高的感染易感性，表明该生物材料的存在增加了感染风险。因此，本研究展示了斑马鱼胚胎模型结合本研究建立的方法在研究生物材料相关感染（BAI）方面的潜力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多种医疗器械（被称为"生物材料"）在现代医学中被越来越多地用于修复或替代人体组织1。然而，植入生物材料会增加患者发生感染的风险，这种感染被称为生物材料相关性感染（BAI），是外科植入物常见的严重并发症。Staphylococcus aureus 和 Staphylococcus epidermidis 是导致BAI最常见的两种细菌2,3,4,5,6。植入的生物材料表面容易形成细菌生物膜。此外，植入的生物材料可能扰乱局部免疫反应，导致细菌清除能力下降。感染细菌的初始清除主要依赖于浸润的中性粒细胞，但在存在植入生物材料的情况下，中性粒细胞的杀菌能力显著降低7。此外，在中性粒细胞大量浸润之后，巨噬细胞会进入组织吞噬残留细菌，但由于生物材料与细菌共存所引起的免疫信号紊乱，巨噬细胞无法在细胞内有效杀灭这些细菌8。因此，生物材料的存在可能促进细菌在细胞内存活9,10,11,12,13，并在植入的生物材料表面形成生物膜4,14。因此，BAI可能导致植入生物材料失效并需要更换，造成发病率和死亡率升高、住院时间延长以及额外的医疗费用2,15。

正在开发的抗BAI策略数量日益增加2,16,17在相关动物模型中对这些策略的有效性进行体内评估至关重要。然而，传统的实验性BAI动物模型（例如, 小鼠模型通常成本较高、耗时较长，因此不适合用于多种策略的高通量测试18基于宿主细胞和细菌的生物发光/荧光标记的生物光学成像技术的最新发展，可能实现对单个小动物（如小鼠）中细菌性人工关节感染（BAI）进展以及宿主-病原体/宿主-材料相互作用的连续监测。18,19,20,21然而，该技术相对复杂，尚处于初级阶段，要实现骨面积指数（BAI）的定量分析，还需解决若干问题。18例如，需要较高的挑战剂量才能观察到细菌定植。此外，还必须解决哺乳类实验动物组织中生物发光/荧光信号的光散射和吸收问题。18,19,21因此，能够实现活体可视化并随时间进行定量分析的新型、经济高效的动物模型，是研究体内BAI的有价值的补充系统。

斑马鱼（胚胎）已被用作一种多功能的活体工具，用于解析多种细菌（如分枝杆菌）的宿主-病原体相互作用及感染致病机制。22, 铜绿假单胞菌23, 大肠杆菌24, Enterococcus faecalis25，以及 葡萄球菌26,27斑马鱼胚胎具有多种优势，例如光学透明性、相对较低的维护成本，以及拥有与哺乳动物高度相似的免疫系统28,29这使得斑马鱼胚胎成为一种经济高效的活体模型生物，可用于活体可视化观察和分析感染进程及相关宿主反应28,29为了在活体中观察细胞行为，可使用带有不同类型免疫细胞的转基因斑马鱼品系（例如, 巨噬细胞和中性粒细胞），甚至带有荧光标记的亚细胞结构的成像方法已被开发出来28,29此外，斑马鱼的高繁殖率使得开发高通量检测系统成为可能，该系统包含自动化机器人注射、自动化荧光定量以及RNA测序分析。27,30.

在本研究中，我们旨在利用荧光成像技术建立一种用于生物材料相关感染的斑马鱼胚胎模型。为此，我们开发了一种将细菌注射入斑马鱼胚胎的方案（S. aureus在存在生物材料微球的条件下将其注入斑马鱼胚胎的肌肉组织中。我们使用了 S. aureus 表达mCherry荧光蛋白的RN4220S. aureus-mCherry），其构建方法已在其他文献中针对另一种情况描述过 S. aureus 菌株10,31表达Kaede绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系（mpeg1: UAS/Kaede），其Kaede蛋白在巨噬细胞中表达32 并使用了蓝色荧光聚苯乙烯微球。在之前的研究中，我们已证明通过肌肉注射将微球注入斑马鱼胚胎以模拟生物材料植入是可行的33为了对单个胚胎中BAI的进展及相关细胞浸润进行定量分析，我们使用了 "斑马鱼免疫检测" 项目文件，该文件在...中运行 "ObjectJ" （ImageJ 的插件）用于定量分析微球注射部位附近定植的细菌和浸润的巨噬细胞的荧光强度33此外，我们测定了胚胎中存在和不存在微球情况下细菌的菌落形成单位（CFU）数量，以研究生物材料对感染的潜在影响。本研究表明，利用本文建立的方法，斑马鱼胚胎 是一种有前景的新型 用于体内研究生物材料相关感染的脊椎动物动物模型

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方案

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本方案中，成年斑马鱼的饲养符合当地动物福利委员会批准的动物福利法规。胚胎实验按照2010/63/EU指令进行。

1. 准备 "仅含细菌" 细菌-微球悬浮液

注意： 的 S. aureus 表达 mCherry 荧光蛋白的 RN4220 菌株（S. aureus-mCherry）被使用。该 S. aureus RN4220菌株的毒力调控基因发生突变 agrA （辅助基因调节子A）34，因此在斑马鱼胚胎模型中可能具有相对较低的毒力。其他沙门氏菌（S.） aureus 可用于BAI的菌株或其他细菌种类。

  1. 取4到5个菌落 S. aureus 从添加了10 µg/mL氯霉素的胰蛋白胨大豆琼脂培养皿中挑取RN4220细菌，接种于10 mL含有10 µg/mL氯霉素的胰蛋白胨大豆肉汤中，在37 °C、振荡条件下培养至对数生长中期。
    1. 培养过程中，取100 µL细菌悬液加入900 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，于光径1 cm比色皿内混匀，测定620 nm处的光密度（OD）620）。将细菌培养至OD620 达到 0.4–0.8。
      注意： OD620 0.1 通常对应于 3.0 × 107 CFU/mL S. aureus. OD620 处于对数生长中期的细菌接种物的OD值在0.4–0.8之间。其他细菌种类和菌株可能需要不同的培养时间。
  2. 3,500 x g 离心细菌 g 孵育10分钟，将菌体沉淀重悬于1 mL无菌PBS中。随后用无菌PBS洗涤细菌2次，最后将细菌重悬于1.1 mL 4%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮中40 （聚乙烯吡咯烷酮，PVP）40PBS中的溶液。
  3. 将该细菌悬液涡旋混匀，取100 µL悬液加入900 µL无菌PBS中，于比色皿中测定OD620 测量。用PVP调整细菌悬液的浓度40 溶液。这是 "仅含细菌" 悬浮液
  4. 可自由选择生物材料与细菌悬液混合。本研究中采用市售聚苯乙烯（PS）微球（蓝色荧光，10 µm）。为制备细菌-微球悬液，将微球在1,000 ×g下离心1分钟 x g，室温下弃去上清液，将微球重悬于  “仅细菌”悬液（在PVP中）40 溶液
  5. 为了在有微球和无微球条件下注射大致相等的细菌剂量，需将细菌-微球悬液的浓度调整为“仅含细菌”悬液（不含微球）浓度的三分之二。这可通过向细菌-微球悬液中加入0.5倍体积的PVP进行稀释来实现。40 溶液。通过涡旋振荡混合悬浮液。需要注意的是，该比例（三分之二）已进行过评估 S. aureus。同样适用于 S. epidermidis但建议验证该比例是否也适用于其他细菌种类，以及适用于其他尺寸（非10 µm）或形状（非微球）的待注射生物材料。
  6. 通过10倍系列稀释的定量培养法检测“仅细菌”组及细菌-微球悬浮液的浓度，具体步骤如下：取100 µL悬浮液加入96孔板中，通过将10 µL等分试样转移至90 µL无菌PBS中进行系列稀释。将未稀释及稀释后悬浮液的10 µL等分试样分别接种于琼脂糖平板，每个样本设两个重复孔，于37 °C培养过夜，计数菌落并计算细菌数量（菌落形成单位，CFU）。

2. 斑马鱼胚胎的繁殖、采集与培养

  1. 按照先前所述的一般步骤35,36进行斑马鱼胚胎的繁殖、收集和培养，具体修改如下：在养殖箱中将野生型Tupfel长鳍（TL）斑马鱼品系或选定的转基因品系斑马鱼（本实验中为Mpeg1:Kaede）进行交配，箱内放置隔离网，以便在光照开启后诱导成年雌鱼产卵，随后将成年鱼与所产卵分离。
  2. 次日收集胚胎，并剔除不透明的非存活胚胎。将约60个胚胎置于直径为100 mm的培养皿中，使用E3培养基37在28 °C条件下培养。每日清除死亡及异常胚胎，并更换新鲜E3培养基。

3. 注射针头的制备

  1. 使用拉针仪制备用于注射的玻璃微量毛细管针。设置参数如下：加热温度：772，拉力：100，速度：200，时间：40，气压：75。
  2. 在显微镜下利用目镜中的标尺，用镊子在毛细管外径约为 20 µm 的位置（适用于 10 µm 微球）折断针尖。应避免使用开口过大的针头，因其会降低胚胎存活率。
    注意：针尖开口大小可根据待注射生物材料的尺寸和形状适当调整。文献报道，使用开口直径约 50 µm 的针头进行注射会导致胚胎存活率显著下降38。

4. 注射 "仅细菌" 或细菌-微球悬浮液注入斑马鱼胚胎

  1. 将琼脂糖溶液（1–1.5% (wt)，溶于去离子水）用微波炉加热溶解后，倒入100 mm培养皿中。将塑料模具模板放置在培养皿内的琼脂糖溶液表面，以在凝固后的琼脂糖中形成凹陷，用于固定胚胎位置，便于注射操作。室温孵育，待琼脂糖溶液完全凝固后移除模具。
  2. 受精后3天，将胚胎置于含有0.02% (w/v) 3-氨基苯甲酸（Tricaine）的100 mm培养皿中进行麻醉。5分钟后，将胚胎转移至覆盖有含0.02% (w/v) Tricaine的E3培养基的琼脂糖板上，并将其排列成一致方向以便注射。对于Mpeg1:Kaede转基因品系，首先在含0.02% (w/v) tricaine的E3培养基中麻醉胚胎，然后 使用体视荧光显微镜筛选表达绿色荧光蛋白的胚胎。
  3. 使用微量移液器吸头将约10 µL的"仅细菌"或细菌-微球悬浮液吸入注射针中。将注射针安装至连接显微注射仪的显微操作器上。对于本实验所用的注射仪（见材料表），注射2–3 nL时采用以下参数设置：压力：300–350，回压：0，时间：2 ms。
    注意：显微注射仪的参数设置取决于所使用的具体仪器型号。当注射与其他形状或尺寸的生物材料混合的细菌时，可能需要调整注射参数。
    1. 对"仅细菌"悬浮液和细菌-微球悬浮液的注射应使用相同口径的注射针。若注射针断裂或堵塞，须立即更换新针以继续注射操作。
  4. 在光学显微镜下将注射针以45–60°角插入胚胎的肌肉组织（图1），通过轻微前后移动调整针头在组织中的位置。使用连接显微注射仪的脚踏开关控制注射过程。
  5. 注射荧光标记细菌后，在体视荧光显微镜下评估胚胎是否成功感染。弃去评分阴性者（未见荧光标记细菌或荧光微球）。将阳性胚胎单独维持在48孔板的E3培养基中，每日更换培养基。

5. 胚胎破碎、显微镜评分及细菌定量培养

  1. 从注射后立即开始，每天使用体视荧光显微镜在显微镜下对所有胚胎进行评分，检测是否存在荧光细菌，直至随机选取胚胎进行定量培养。
  2. 注射后不久，随机选取少量存活的感染胚胎（本研究中为5至6个），使用无菌吸头将其分别转移至独立的2 mL微量离心管中。去除培养基，用无菌PBS轻轻洗涤胚胎一次，然后加入100 µL无菌PBS。
  3. 向每管中加入2–3颗无菌氧化锆珠（直径2 mm），使用匀浆器（见材料表）以3,500 rpm速度研磨30秒。按照步骤1.3所述方法对匀浆液进行定量培养。
    注意：其他类型的匀浆器可能需要不同的设置参数。
  4. 在注射后的后续各天，按照步骤5.3的方法随机选取多个胚胎进行定量培养。

6. 斑马鱼胚胎感染进展及诱导细胞浸润的荧光显微观察

  1. 按照步骤4.2所述方法对胚胎进行麻醉。将500 µL含2%（wt）甲基纤维素的PBS溶液加入含有E3培养基和0.02%（w/v）三卡因的培养皿中。将胚胎置于甲基纤维素溶液中，保持其笔直且水平。
    注意： 甲基纤维素溶液用作“胶水”，由于其黏度，可暂时固定胚胎，使其处于最佳成像方向。
  2. 使用配备明场、mCherry、绿色荧光蛋白（GFP）和紫外（UV）滤光片的体视荧光显微镜，在相同优化条件下对单个胚胎进行成像（例如, 在160倍放大倍数下设置图像采集参数（包括强度、增益和曝光时间）。使用明场滤光片，调节焦平面使注射造成的组织损伤区域处于清晰对焦状态。设置Z轴扫描深度为10 µm，步进大小为5 µm，以实现连续3层图像的采集。
  3. 从注射后5小时起，每天对单个胚胎进行一次成像，持续至第2天 注射后排除死亡胚胎（无心跳或胚胎部分降解），不再用于后续成像和分析。将胚胎单独置于48孔板中的E3培养基中培养，每日更换培养基。

7. 使用对象 J 项目文件“Zebrafish-Immunotest”对感染进展和诱导细胞浸润的荧光强度进行定量分析

  1. 从以下链接下载“Zebrafish-Immunotest”及详细使用手册： <https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>，如先前一项研究所述33简而言之，使用免费软件 Image J 中的“Zebrafish-Immunotest”功能打开图像进行分析。在每幅加载的图像中，根据胚胎观察到的组织损伤情况，手动标记注射位点。
    注意： 标记位点被“Zebrafish-Immunotest”用作中心点，在50 µm范围内检测荧光峰。检测到的荧光峰随后作为标准化区域（直径100 µm）的中心，用于荧光测量。
  2. 在 Object J 菜单中点击“calculation”，以对所有图像自动运行多通道（如适用）的荧光测量。导出数据，并采用适当的统计检验方法进行分析。

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结果

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本研究评估了斑马鱼胚胎作为研究生物材料相关感染的新型脊椎动物模型的适用性。显微注射技术已常用于将不同种类的细菌注入斑马鱼胚胎以诱发感染22,26,27,30,36. 采用图示流程所示的方法进行操作 图1, S. aureus 单独或与10 µm PS微球（PS10) 在本研究中被注射到斑马鱼胚胎的肌肉组织中。肌肉内注射 S. aureus 在胚胎中引起剂量依赖性感染（图2）。注射的剂量接近预期的攻毒剂量（第0天 图2...

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讨论

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生物材料相关感染（BAI）是一种严重的临床并发症。深入了解BAI在体内的发病机制，将有助于改进BAI的预防和治疗策略。然而，目前常用的BAI实验动物模型（如小鼠模型）成本高、劳动强度大，且需要经过复杂外科技术培训的专业人员操作，因此不适合进行高通量分析。由于斑马鱼胚胎模型所需条件相对简单，总体成本也低于小鼠模型，本研究旨在评估斑马鱼胚胎是否可作为一种新型的脊椎动物模型，用于体内BAI研究，作为哺乳动物模型的补充。

为了建立斑马鱼胚胎细菌-生物材料相互作用（BAI）模型，我们开发了一种细菌与微球共注射的方案，该方案基于此前报道的胚胎肌肉内注射微球的方法33。通过这种方法，大部分细菌位于胚胎中微球的周围，模拟了在人类/哺乳动物体内植入生物材料时或植入后不久发生的细菌与生物材料之间的相互作用。

为了能够比较微球存在与不存在时斑马鱼胚胎中感染进展的情况，应使用相似初始数量的细菌对胚胎进行攻毒处理，无论是否含有微球。然而，根据我们的经验，共注射细菌-微球悬浮液所注入的细菌数量会多于仅注射&...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由生物医学材料（BMM）计划的IBIZA项目资助，并由荷兰经济事务部联合资助。作者谨此感谢澳大利亚莫纳什大学的Graham Lieschke教授提供斑马鱼转基因品系（mpeg1:Gal4/UAS:Kaede）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白胨大豆琼脂BD Difco236950AMC 媒介制备单元
胰蛋白胨大豆肉汤BD Difco211825
聚乙烯吡咯烷酮40ApplichemA2259.0250
10 µm 直径聚苯乙烯微球（蓝色荧光）Life technology/ThemoFisherF8829
玻璃微毛细管（1 mm 外径 × 0.78 mm 内径）Harvard Apparatus30-0038
微量移液器拉制仪Sutter Instrument IncFlaming p-97
LM 20 光学显微镜LeicaMDG33 10450123
3-氨基苯甲酸（Tricaine）Sigma-AldrichE10521-50G
低熔点琼脂糖Roche11388991001
LM80 体视荧光显微镜LeicaMDG3610450126
Microloader 移液器吸头Eppendorf5242956.003
M3301 型微操纵器配 M10 支架World Precision Instruments00-42-101-0000
FemtoJet express 微注射仪Eppendorf5248ZO100329
2 mL 聚丙烯微量离心管Sarstedt72.693.005
氧化锆珠Bio-connect11079124ZX
MagNA 裂解仪Roche41416401
MSA-2 平板（甘露醇盐琼脂-2）Biomerieux43671Chapmon 2 培养基
甲基纤维素 4000cpSigma-AldrichMO512-250G
氯霉素Sigma-AldrichC0378
旋转摇床（用于细菌培养）New Brunswick ScientificG10
斑马鱼培养箱VWRIncu-line
比色皿BRAND759015
离心机Hettich-ZentrifugenROTANTA 460R
分光光度计Pharmacia biotechUltrospec®2000
镊子Sigma-AldrichF6521-1EA
48 孔板Greiner bio-one677180
96 孔板Greiner bio-one655161
培养皿Falcon353003
培养皿BiomerieuxNL-132
ImageJ不适用不适用链接: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0Prism不适用

参考文献

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