本研究描述了一种基于荧光显微镜技术的斑马鱼胚胎模型，可用于活体可视化及随时间动态进行生物材料相关感染的活体分析。该模型是一种有前景的研究体系，可作为小鼠等哺乳动物模型的补充，用于体内研究生物材料相关感染。
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本文内容
摘要
摘要
生物材料相关感染（BAI）是导致生物材料/医疗器械失效的主要原因。 金黄色葡萄球菌 是导致骨整合感染（BAI）的主要病原体之一。目前用于BAI研究的哺乳动物实验模型（如小鼠模型）成本高且耗时长，因此不适合高通量分析。因此，亟需建立新型动物模型作为补充体系，以实现在体内研究BAI。在本研究中，我们旨在建立一种基于荧光显微镜技术的斑马鱼胚胎模型，用于在生物材料存在条件下对细菌感染进行活体可视化和实时分析。此外，还研究了由此引发的巨噬细胞反应。为此，我们采用了表达荧光蛋白的 S. aureus 以及在巨噬细胞中表达荧光蛋白的转基因斑马鱼胚胎，并建立了一种将细菌单独或与微球共同注射到胚胎肌肉组织中的实验方法。为了实时监测活体胚胎中细菌感染的进展过程，我们设计了一种简单且可靠的荧光细菌显微评分方法。显微评分结果显示，所有细菌数量超过20个菌落形成单位（CFU）的胚胎均能检测到阳性荧光信号。为研究生物材料对感染的潜在影响，我们测定了不同组别中细菌的CFU数量 S. aureus 含和不含10 µm聚苯乙烯微球（PS10）作为胚胎中的模型生物材料。此外，我们使用了ObjectJ项目文件 "斑马鱼免疫检测" 在 ImageJ 中操作以定量荧光强度 S. aureus 有无PS条件下的感染10 随着时间的推移。两种方法的结果均显示数量较高 S. aureus 在感染的胚胎中，含有微球的胚胎比不含微球的胚胎表现出更高的感染易感性，表明该生物材料的存在增加了感染风险。因此，本研究展示了斑马鱼胚胎模型结合本研究建立的方法在研究生物材料相关感染（BAI）方面的潜力。
引言
多种医疗器械（被称为"生物材料"）在现代医学中被越来越多地用于修复或替代人体组织1。然而，植入生物材料会增加患者发生感染的风险，这种感染被称为生物材料相关性感染（BAI），是外科植入物常见的严重并发症。Staphylococcus aureus 和 Staphylococcus epidermidis 是导致BAI最常见的两种细菌2,3,4,5,6。植入的生物材料表面容易形成细菌生物膜。此外，植入的生物材料可能扰乱局部免疫反应，导致细菌清除能力下降。感染细菌的初始清除主要依赖于浸润的中性粒细胞，但在存在植入生物材料的情况下，中性粒细胞的杀菌能力显著降低7。此外，在中性粒细胞大量浸润之后，巨噬细胞会进入组织吞噬残留细菌，但由于生物材料与细菌共存所引起的免疫信号紊乱，巨噬细胞无法在细胞内有效杀灭这些细菌8。因此，生物材料的存在可能促进细菌在细胞内存活9,
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方案
本方案中，成年斑马鱼的饲养符合当地动物福利委员会批准的动物福利法规。胚胎实验按照2010/63/EU指令进行。
1. 准备 "仅含细菌" 细菌-微球悬浮液
注意： 的 S. aureus 表达 mCherry 荧光蛋白的 RN4220 菌株（S. aureus-mCherry）被使用。该 S. aureus RN4220菌株的毒力调控基因发生突变 agrA （辅助基因调节子A）34，因此在斑马鱼胚胎模型中可能具有相对较低的毒力。其他沙门氏菌（S.） aureus 可用于BAI的菌株或其他细菌种类。
- 取4到5个菌落 S. aureus 从添加了10 µg/mL氯霉素的胰蛋白胨大豆琼脂培养皿中挑取RN4220细菌，接种于10 mL含有10 µg/mL氯霉素的胰蛋白胨大豆肉汤中，在37 °C、振荡条件下培养至对数生长中期。
- 培养过程中，取100 µL细菌悬液加入900 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，于光径1 cm比色皿内混匀，测定620 nm处的光密度（OD）620）。将细菌培养至OD620 达到....
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结果
本研究评估了斑马鱼胚胎作为研究生物材料相关感染的新型脊椎动物模型的适用性。显微注射技术常用于将不同种类的细菌注入斑马鱼胚胎以诱导感染22,26,27,30,36. 采用图示流程所示的方法 图1, S. aureus 单独或与...一起 10 µm PS微球（PS10) 在本研究中被注射到斑马鱼胚胎的肌肉组织中。肌肉内注射 S. aureus 在胚胎中引起剂量依赖性感染（图2）。注射的剂量接近预期的攻毒剂量（第0天 图2
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讨论
生物材料相关感染（BAI）是一种严重的临床并发症。深入了解BAI在体内的发病机制，将有助于改进BAI的预防和治疗策略。然而，目前常用的BAI实验动物模型（如小鼠模型）成本高、劳动强度大，且需要经过复杂外科技术培训的专业人员操作，因此不适合进行高通量分析。由于斑马鱼胚胎模型所需条件相对简单，总体成本也低于小鼠模型，本研究旨在评估斑马鱼胚胎是否可作为一种新型的脊椎动物模型，用于体内BAI研究，作为哺乳动物模型的补充。
为了建立斑马鱼胚胎细菌-生物材料相互作用（BAI）模型，我们开发了一种细菌与微球共注射的方案，该方案基于此前报道的胚胎肌肉内注射微球的方法33。通过这种方法，大部分细菌位于胚胎中微球的周围，模拟了在人类/哺乳动物体内植入生物材料时或植入后不久发生的细菌与生物材料之间的相互作用。
为了能够比较微球存在与不存在时斑马鱼胚胎中感染进展的情况，应使用相似初始数量的细菌对胚胎进行攻毒处理，无论是否含有微球。然而，根据我们的经验，共注射细菌-微球悬浮液所注入的细菌数量会多于仅注射&.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由生物医学材料（BMM）计划的IBIZA项目资助，并由荷兰经济事务部联合资助。作者谨此感谢澳大利亚莫纳什大学的Graham Lieschke教授提供斑马鱼转基因品系（mpeg1:Gal4/UAS:Kaede）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | BD Difco | 236950 | AMC 媒介制备单元 |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | BD Difco | 211825 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮40 | Applichem | A2259.0250 | |
| 10 µm 直径聚苯乙烯微球（蓝色荧光） | Life technology/ThemoFisher | F8829 | |
| 玻璃微毛细管（1 mm 外径 × 0.78 mm 内径） | Harvard Apparatus | 30-0038 | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Inc | Flaming p-97 | |
| LM 20 光学显微镜 | Leica | MDG33 10450123 | |
| 3-氨基苯甲酸（Tricaine） | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| 低熔点琼脂糖 | Roche | 11388991001 | |
| LM80 体视荧光显微镜 | Leica | MDG3610450126 | |
| Microloader 移液器吸头 | Eppendorf | 5242956.003 | |
| M3301 型微操纵器配 M10 支架 | World Precision Instruments | 00-42-101-0000 | |
| FemtoJet express 微注射仪 | Eppendorf | 5248ZO100329 | |
| 2 mL 聚丙烯微量离心管 | Sarstedt | 72.693.005 | |
| 氧化锆珠 | Bio-connect | 11079124ZX | |
| MagNA 裂解仪 | Roche | 41416401 | |
| MSA-2 平板（甘露醇盐琼脂-2） | Biomerieux | 43671 | Chapmon 2 培养基 |
| 甲基纤维素 4000cp | Sigma-Aldrich | MO512-250G | |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| 旋转摇床（用于细菌培养） | New Brunswick Scientific | G10 | |
| 斑马鱼培养箱 | VWR | Incu-line | |
| 比色皿 | BRAND | 759015 | |
| 离心机 | Hettich-Zentrifugen | ROTANTA 460R | |
| 分光光度计 | Pharmacia biotech | Ultrospec®2000 | |
| 镊子 | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | |
| 48 孔板 | Greiner bio-one | 677180 | |
| 96 孔板 | Greiner bio-one | 655161 | |
| 培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 培养皿 | Biomerieux | NL-132 | |
| ImageJ | 不适用 | 不适用 | 链接: https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| GraphPad 7.0 | Prism | 不适用 |
参考文献
- Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
- Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10(2012).
- Otto, M.
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重印与许可
