方法文章

用于靶向质粒DNA输送的美聚氨酸功能化生物相容性块共聚物

DOI：

10.3791/58527

⸱

2019年8月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center of Clinical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital & Jiangsu Institute of Cancer Research & Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital, 2Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Clinical Medicine, Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本作品通过可逆添加-碎片链转移(RAFT)方法介绍了蛋氨酸功能化生物相容性块共聚物(mBG)的制备。研究了获得mBG的质粒DNA复合能力及其转染效率。RAFT方法对聚合含有特殊功能组的单体非常有益。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

可逆添加-碎片链转移(RAFT)聚合融合了基聚合和活聚合的优点。本作品介绍了通过RAFT聚合制备蛋氨酸功能化生物相容性块共聚物。首先,N,N-二乙二醇(2-羟基苯甲酸酯)甲酰胺-b-N-(3-氨基丙烯酰胺)甲酰胺(BNHEMA-b-APMA,BA)通过RAFT聚合合成,使用4,4'-亚索比(4-青黄酸)(ACVA)作为启动剂和4-氰化二苯甲酸二甲苯甲酸(CTP)作为链转移剂。随后,N,N-bis(2-羟基)甲酰胺-b-N-(3-关尼诺丙基)甲酰胺(美聚氨酸嫁接BNHEMA-b-GPMA,mBG)通过用甲胺和瓜尼丁修饰APMA中的胺组制备组。合成了三种块状聚合物,mBG1、mBG2和mBG3进行比较。使用宁西林反应来量化APMA含量;mBG1、mBG2 和 mBG3 分别占 APMA 的 21%、37% 和 52%。凝胶渗透色谱(GPC)结果表明,BA共聚物的分子量为16,200(BA1)、20,900(BA2)和27,200(BA3)克/摩尔。研究了获得块共聚物基因载体的质粒DNA(pDNA)复合能力。当pDNA分别与mBG1、mBG2、mBG3完全复合时,电荷比(N/P)为8、16和4。当mBG/pDNA多聚体N/P比高于1时,mBG的Zeta电位为正。在 16 和 32 之间的 N/P 比率下,mBG/pDNA 聚丛的平均颗粒大小在 100-200 nm 之间。总体而言,这项工作说明了块共聚载体合成的简单和方便的方案。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来,基因疗法已出现以核酸的治疗性输送为治疗各种疾病的药物。包括质粒DNA(pDNA)和小干扰RNA(siRNA)在内的基因药物的开发依赖于药物输送系统(DDS)2的稳定性和效率。在所有DDS中,阳离子聚合物载体具有稳定性好、免疫原性低、易制制剂和改性等优点,使阳离子聚合物载体具有广阔的应用前景。为了在生物医学中的实际应用,研究人员必须找到一种高效、低毒性、具有良好的靶向能力的阳离子聚合物载体。在所有聚合物载体中,块共聚物是使用最广泛的药物输送系统之一。块共聚物被深入研究,因为它们的自组装特性和在药物输送中形成云母、微球和纳米粒子的能力5。块共聚物可以通过活聚合或点击化学方法合成。

1956年,Szwarc等人提出了活聚合的课题,将其定义为无链断裂反应的6,7。从那时起,已经开发出多种技术,用这种方法合成聚合物;因此,活聚合被认为是聚合物科学的一个里程碑。活聚合可分为活阴离子聚合、活阳离子聚合和可逆失活基聚合(RDRP)9。活阴离子/阳离子聚合具有有限的应用范围,由于其严格的反应条件10。受控/活基聚合(CRP)反应条件温和,处置方便,产量好,是近年来的主要研究重点。在CRP中,活性传播链可逆钝化为休眠链,以降低自由基的浓度,避免传播链基的双分子反应。只有当非活性休眠传播链可逆地动画化为链基时,添加聚合才能继续。可逆添加-裂变链转移(RAFT)聚合作为最有前途的活基聚合形式之一,是一种适用于分子量和结构可控、分子量窄的块状聚合物的屈服方法。分布,并携带功能组12。成功进行RAFT聚合的关键是链转移剂(通常是二硫酯)的作用,后者具有非常高的链传递常数。

本文设计了一种RAFT聚合法,制备BNHEMA-b-APMA块状聚合物,以4,4'-亚索比(4-青黄酸)(ACVA)作为起始剂,4-氰化二苯甲酸二硫苯甲酸(CTP)作为链转移剂。RAFT聚合被两次用于将BNHEMA引入阳离子聚合物载体。随后,用甲胺磷和甲胺酰胺试剂1-酰胺盐酸基苯甲酸酯对APMA链中的胺组进行了修饰。利用关尼酰胺试剂和甲酰胺聚合物骨架结构的正电荷,提高了所得块状聚合物载体的细胞吸收效率。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BNHEMA聚合物(PBNHEMA)的合成

  1. 将1.87克N、N-之二(2-羟乙酰)甲酰胺(BNHEMA)溶解在聚合瓶中1mL的蒸馏水中。
    注:聚合瓶是一个圆底烧瓶,带有橡胶塞和磁搅拌器。
  2. 在 5 mL 烧杯中溶解 0.03 g 的 4-氰化二苯甲酸二硫苯甲酸 (CTP) 和 0.02 g 的 4,4' - 亚祖酸 (4-青酸 ) (ACVA) 中 0.5 mL 的 1,4-二恶烷。然后,将 CTP 和 ACVA 溶液从步骤 1.1 添加到聚合瓶中。
  3. 通过三个冷冻泵-解冻循环,用氮气通风聚合瓶中的反应系统。
    1. 具体来说,使用冷凝水陷阱将聚合瓶中的溶液冷冻,将聚合瓶固定在铁支架上,并通过用针(#9针,内径0.65 mm)的导管将氮吸尘并注入反应混合物中,外径 0.9 mm)。密封聚合瓶并在室温下解冻溶液30分钟。
    2. 重复冷冻泵-解冻循环三次。
  4. 将聚合瓶放入70°C油浴中,让溶液在氮气下反应24小时。
  5. 在 0°C 下冷却聚合瓶并打开橡胶塞以终止聚合过程。
  6. 在-20°C冰箱中预冷却丙酮2小时,然后将其与步骤1.5的反应溶液以50:1(v/v)混合。之后,在8,200 x g的离心机10分钟,以去除丙酮并收集沉淀物。
  7. 为了纯化合成的PBNHEMA,将收集的沉淀物溶解在2 mL的纯水中,然后将其与100 mL的预冷却丙酮混合,比例为1:50(v/v)。将溶液在8,200 x g下离心10分钟,并收集沉淀物。重复此过程三次。
  8. 使用 50°C 真空干燥器干燥生产的 PBNHEMA。干燥后,用平衡量粉末。根据公式 1计算收益率。
    figure-protocol-1(1)
    注:在本实验中,所得的收益率为77.2%。

2. BNHEMA-b-APMA聚合物(BA)的合成

  1. 在10 mL烧杯中将0.96克N-(3-氨基丙基)盐酸甲酰胺(APMA)和0.93克PBNHEMA溶解在5mL蒸馏水中。
  2. 将0.01克4,4'-阿佐比斯(4-青黄酸)(ACVA)溶解在0.5 mL的1,4-二恶烷中,并与APMA-PBNHEMA溶液混合,从2.1部分。
  3. 将混合物转移到聚合瓶中,用干氮通风1小时。
  4. 将聚合瓶放入70°C油浴中,让它在氮气下反应24小时。
  5. 在 0°C 下冷却聚合瓶并打开橡胶塞以终止聚合过程。
  6. 将溶液从步骤1.6转移到冷却丙酮,然后在8,200 x g下离心溶液10分钟,以沉淀BA。
  7. 将BA溶解在2 mL的蒸馏水中,并将聚合物沉淀在冰镇丙酮中。重复三次。
  8. 在 50°C 真空干燥器中干燥生产的 BA,并称重获得的粉末。根据公式 2计算收益率。
    figure-protocol-2
    注:在本实验中,产量计算为82.0%。

3. 通过宁海林法测定BA共聚物中APMA的摩尔百分比

注:分光光度测定用于确定多组分氨基酸的含量。其原理是宁海碱和氨基酸的颜色反应,其中吸收度与氨基酸含量有一定的相关性13,14。

  1. 在125 mL的沸腾蒸馏水中溶解5克尼西林。此外,在250mL的温蒸水中溶解5克维生素C。在磁性搅拌下,将250 mL的维生素C溶液滴滴加入宁海林溶液中。继续搅拌15分钟,然后在4°C冰箱中冷却反应溶液。
  2. 使用布赫纳漏斗将溶液从冰箱中拿出来,通过吸滤,以获得减少的尼希德林。收集沉淀物并将其保存在五氧化二磷脱水机中。
  3. 在10 mL的乙二醇单甲基醚中溶解85毫克的宁海丁和15毫克的减少的宁海丁,以制备宁海碱着色溶液。
    注:宁黄碱着色溶液可与APMA中的β-氨基反应,形成具有结构的紫罗兰化合物,如先前研究15所述。
  4. 稀释1 mL的0,1,10,100,100,1000mg/mL APMA单体溶液与1 mL的醋酸缓冲液(2 M,pH 5.4),然后分别加入1mL的宁水林着色溶液。
  5. 在沸水中加热混合物15分钟,然后用自来水冷却。让溶液坐5-10分钟,用3 mL的60%乙醇稀释,并彻底混合。使用分光光度计测量 570 nm 处的吸收率,并绘制标准曲线(公式 3)。
    figure-protocol-3
    注: 公式 3 源自 570 nm 时吸收的线性拟合与 APMA 浓度的线性拟合。
  6. 在1mL蒸馏水中溶解0.01克BA;加入1 mL的醋酸缓冲液(2 M,pH 5.4)和1 mL的宁海碱着色溶液。根据 570 nm 处的吸光度计算 APMA 的摩尔含量。
    figure-protocol-4
    figure-protocol-5(5)
    figure-protocol-6
    注:计算公式如下(公式3-6)。

4. 合成蛋氨酸嫁接BA聚合物(mBA)

  1. 在回收瓶中将8.9毫克的Fomc-Methionine溶解在5mL的DMSO中。
  2. 在回收瓶中加入6.92毫克的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)盐酸甲二酰甲酰甲酸酯(EDCl)和4.86毫克1-羟基苯甲酸酯(HOBT),并在0°C下反应0.5小时。
  3. 将2.59克的BA溶解在5mL的DMSO溶液中,然后加入50μL的三甲基胺;将溶液滴滴添加到回收瓶中(步骤 4.2),让溶液在室温下反应 0.5 小时。
  4. 在步骤 4.3 中使用透析袋 (MWCO 10 kDa) 在 2 L 烧杯中去除 DMSO 和三甲基胺,在步骤 4.3 中去除 DMSO 和三甲基胺,为期 24 小时;每 6 小时更换一次去离子水。
  5. 根据公式7,冻结干燥获得的mBA并称重以计算收益率。
    figure-protocol-7
    注:在这种情况下,收益率确定为 71%。
  6. 通过测量570 nm 的吸收度来量化含有 mBA 的 NH 2,以计算嫁接的蛋氨酸量。根据公式8计算蛋氨酸的摩尔含量。
    figure-protocol-8

5. 合成瓜尼丁宁和蛋氨酸结合BNHEMA-b-APMA聚合物(mBG)

注:合成了三种不同的mBA1、mBA2和mBA3共聚物。在以下步骤中,mBA3 共聚物用作示例。

  1. 将含有60μmol的氨基组溶解在5 mL的纯水中。
    注: Amino 组内容使用步骤 3.5 中所述的宁海德鲁林方法进行量化。
  2. 在mBA溶液中溶解40.6毫克(300μmol)的关尼酰胺试剂1-酰胺盐酸。
  3. 使用碳酸钠的饱和溶液将pHH调节至9.0,并在室温下稳定24小时。
  4. 使用烧杯中的透析袋(MWCO 10 kDa,2 L)用去离子水对 mBG 产品进行透析,并将其以冷冻干燥粉末的形式保存。
    通过公式8计算,收益率为85%。
    figure-protocol-9(8)
  5. 在NMR管中溶解D2O中的mBG粉末,并使用1H核磁共振光谱(1H NMR)16进行表征。

6. mBG/pDNA聚丛的制备和表征

  1. 将50μg的pDNA溶解在50μL的RNase/无DNase水中。
  2. 在1mL无RNase/DNase水中溶解1毫克mBG共聚物。
  3. 根据不同的进给比,即不同的N/P比率(1:1、4:1、8:1、16:1和32:1),将mBG共聚物溶液直接添加到pDNA溶液中。
    注:N/P比定义为聚合物中瓜尼丁组和pDNA中磷酸盐组的摩尔比,即聚合物中GPMA链的摩尔比和pDNA中的单核苷酸。N/P比是根据mBG中氨氮(N)和pDNA中磷酸基(P)的分子量计算的。
  4. 将溶液与涡旋混合器混合,使其在室温下站立 30 分钟。之后,在磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)中分散混合物,并在4°C保存获得的mBG/pDNA聚丛体,用于后续实验。
    注:使用动态光散射(DLS)17检测mBG和复合物的平均颗粒大小和Zeta电位。
  5. 在DLS和Zeta电位样品细胞中用1mL的PBS(pH 7.4)稀释10μL的mBG/pDNA多聚体溶液。
    注:粒子大小和Zeta电位检测进行了三次,并平均采集了三个值。

7. mBG/pDNA聚体电泳缓速实验

注:进行了电泳减速实验,以确定最小充注比。

  1. 以五组具有不同 N/P 比率(1:1、4:1、8:1、16:1 和 32:1)的 mBG/pDNA 聚丛体为例,其中包含 50 μg 的 pDNA 。
  2. 将 6 倍加载缓冲液添加到 mBG/pDNA 多丛样品中,最终浓度为 1 倍。
  3. 将溶液加入1.5%的甘蔗糖凝胶中,在90mV下运行15分钟,使用pDNA作为对照。
  4. 使用凝胶成像仪拍摄凝胶照片。

8. mBG/pDNA多丛细胞毒性

  1. 种子MCF-7细胞以每孔104

  5. figure-protocol-10


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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

根据表1所示的聚合目标程度喂食BNHEMA;mBG的合成过程如图1所示。 首先,利用四环烷酸二硫二甲苯二甲酸作为链转移剂,在水二恶烷系统中采用可逆添加-碎片链转移(RAFT)方法制备BNHEMA同质聚酯。其次,PBNHEMA作为链转移剂,制备BNHEMA-b-APMA块聚合物。APMA单体根据表1所示的聚合目标程度进行喂食。进行了凝胶渗透色谱(GPC),以检测不同进给比的BA分子量(表1)。通过宁西林法(表1)检测出不同进给率的BAAPMA链的实际摩尔含量。根据我们早先的研究5,我们在本研究中使用了mBG3,因为它的APMA含量最高。最后,将蛋氨酸移植到APMA链中,将残留胺组完全隔离,以制备mBG。图 2是 mBG 的1H NMR 数据。mBG/pDNA聚丛的平均颗粒大小和Zeta电位分别为124...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究介绍了一系列BNHEMA-b-APMA块状聚合物阳离子基因载体。这些块状聚合物是通过可逆的添加-碎片链转移(RAFT)方法合成的。引入亲水段BNHEMA以提高溶解度。对美氨酸和瓜尼丁组进行了改造,以提高靶能力和转染效率5.MBG共聚物中的APMA链含量增加,核化减少了mBG/pDNA聚体颗粒尺寸。颗粒大小和表面电位使复合物易于穿过细胞膜,适用于转染。实验的关键在于严格控制BNHEMA单体和CTP的摩尔比为45:1,CTP和ACVA的摩尔比为2:1,温度控制在70°C。在净化过程中,预冷却丙酮和聚合物溶液的体积比必须高于50:1。

相同的 N/P 值,随着 APMA 链比例的增加,mBG/pDNA 聚体粒径减小。这些结果表明,APMA链含量增加,结节能减小颗粒大小。颗粒大小和表面电位使复合物易于在细胞膜中传输,适用于转染。利用凝胶电泳来研究复合与N/P比的关系,结果表明最小N/P为4。本研究将为阳离子基因载体的进一步研究提供有价值的基础数据。然而,BNHEMA-b-APMA不易降解,其体内代谢过程不够清晰。因此,...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者证明,对于本文中讨论的材料,与任何财务组织没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究得到了国家重点研究发展计划(2016YFC0905900号)、国家自然科学基金(第81801827号、81872365号)、江苏省基础研究计划(自然科学基金,No.BK20181086)和江苏省肿瘤医院科研基金(No.ZK201605)。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-羟基苯并三唑Macklin Biochemical Co.， Ltd，中国H810970≥97.0%
1,4-二氧六环药集团化学试剂有限公司，中国10008918AR
1-氨基吡唑盐有限公司A10793598%
1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐阿拉丁有限公司，中国E106172AR
4,4'-偶氮二（4-氰氰基）阿拉丁有限公司，中国A106307分析试剂（AR）
4-氰基-4-（苯碳硫基硫代）戊酸阿拉丁有限公司C132316>97%（HPLC）
乙酸盐国药集团化学试剂有限公司81014818AR
丙酮国药集团化学试剂有限公司10000418AR
琼脂糖阿拉丁有限公司A118881高分辨率
抗坏血酸阿拉丁有限公司，中国A103533AR
DMSOAladdin Co.， Ltd.，中国D103272AR
乙二醇阿拉丁有限公司，中国E103319AR
N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐阿拉丁有限公司，中国N129096≥98.0%（HPLC）
N，N-双（2-羟乙基）甲基丙烯酰胺ZaiQi Bio-Tech Co.，Ltd， 中国CF259748≥98.0%（HPLC）
茚三酮阿拉丁有限公司，中国N105629
AR PBS 缓冲液阿拉丁有限公司，中国P196986pH 7.4
质粒 DNABIOGOT 有限公司，中国pDNA-EGFPpDNA-EGFP
质粒DNA BIOGOT 有限公司，中国PdnapDNA
碳酸钠十水合Aladdin Co.， Ltd.，中国S112589AR
三甲胺阿拉丁有限公司，中国T103285AR
国酸盐阿拉丁酸盐酸盐物

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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