本研究通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）方法制备了甲硫氨酸功能化的生物相容性嵌段共聚物（mBG），并考察了所得mBG与质粒DNA的复合能力及其转染效率。RAFT方法在聚合含有特殊官能团的单体方面具有显著优势。
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方法文章
用于靶向质粒DNA递送的甲硫氨酸功能化生物相容性嵌段共聚物
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合结合了自由基聚合与活性聚合的优点。本研究介绍了通过RAFT聚合制备蛋氨酸功能化生物相容性嵌段共聚物的方法。首先， N,N-二(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺-b-N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺（BNHEMA-b-APMA，BA）通过RAFT聚合反应合成，以4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)（ACVA）作为引发剂，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯（CTP）作为链转移剂。随后， N,N-双(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺-b-N-(3-胍丙基)甲基丙烯酰胺（甲硫氨酸接枝的BNHEMA）b通过在APMA中引入甲硫氨酸和胍基对胺基进行修饰，制备了-GPMA, mBG。为进行比较，合成了三种类型的嵌段聚合物mBG1、mBG2和mBG3。采用茚三酮反应定量测定APMA含量；mBG1、mBG2和mBG3中APMA含量分别为21%、37%和52%。凝胶渗透色谱（GPC）结果显示，BA共聚物的分子量分别为16,200（BA1）、20,900（BA2）和27,200（BA3）g/mol。同时研究了所得嵌段共聚物基因载体与质粒DNA（pDNA）的复合能力。当pDNA分别与mBG1、mBG2、mBG3完全复合时，电荷比（N/P）分别为8、16和4。当mBG/pDNA聚集体的N/P比大于1时，mBG的Zeta电位呈正值。在N/P比为16至32范围内，mBG/pDNA聚集体的平均粒径为100–200 nm。总体而言，本研究展示了一种简单且便捷的嵌段共聚物载体合成方案。
引言
近年来，基因治疗作为一种将核酸作为药物递送以治疗各类疾病的方法已逐渐兴起1。质粒DNA（pDNA）和小干扰RNA（siRNA）等基因药物的开发依赖于药物递送系统（DDS）的稳定性和效率2。在所有DDS中，阳离子聚合物载体具有稳定性好、免疫原性低以及制备和修饰简便等优势，因而展现出广阔的应用前景3,4。在生物医学的实际应用中，研究人员必须寻找具有高效性、低毒性且具有良好靶向能力的阳离子聚合物载体5。在所有聚合物载体中，嵌段共聚物是最广泛应用的药物递送系统之一。由于嵌段共聚物具有自组装特性，能够形成胶束、微球和纳米粒子，因此在药物递送领域受到广泛研究5。嵌段共聚物可通过活性聚合或点击化学方法合成。
1956年，Szwarc 等人提出了活性聚合的概念，将其定义为不发生链断裂反应的聚合过程6,7。自那时以来，已发展出多种利用该方法合成聚合物的技术，因此活性聚合被视为高分子科学的一个里程碑8。活性聚合可分为活性阴离子聚合、活性阳离子聚合和可逆去活化自由基聚合（RDRP）9。由于反应条件苛刻，活性阴离子/阳离子聚合的应用范围有限10。相比之下，可控/活性自由基聚合（CRP）具有反应条件温和、操作简便、产率高等优点，近年来已成为研究热点11。在CRP中，活性增长链可逆地被钝化为休眠链，以降低自由基浓度，避免增长链自由基之间的双分子反应。只有当非活性的休眠增长链可逆地重新活化为自由基时，加成聚合才能继续进行。作为最具前景的活性自由基聚合形式之一，可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合是一种能够制备具有可控分子量和结构、窄分子量分布并携带功能基团的嵌段聚合物的方法12。成功实施RAFT聚合的关键在于链转移剂的作用，通常使用二硫代酯类化合物，因其具有很高的链转移常数。
本文设计了一种可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合方法，以4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)（ACVA）为引发剂，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯（CTP）为链转移剂，制备BNHEMA-b-APMA嵌段聚合物。通过两次RAFT聚合将BNHEMA引入阳离子聚合物载体中。随后，APMA链中的氨基分别用甲硫氨酸和胍基化试剂盐酸脒基吡唑进行修饰。利用胍基化试剂所带正电荷及甲基丙烯酰胺聚合物骨架结构的特性，提高了所得嵌段聚合物载体的细胞摄取效率。
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方案
1. BNHEMA 聚合物（PBNHEMA）的合成
- 在聚合瓶中，将 1.87 g 的 N, N-双(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺 (BNHEMA) 溶解于 1 mL 蒸馏水中。
注：聚合瓶是一种带有橡胶塞和磁力搅拌子的圆底烧瓶。 - 在 5 mL 烧杯中，将 0.03 g 的 4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯 (CTP) 和 0.02 g 的 4,4’-偶氮二(4-氰基戊酸) (ACVA) 溶解于 0.5 mL 的 1,4-二氧六环中。然后，将 CTP 和 ACVA 溶液加入第 1.1 步的聚合瓶中。
- 通过三次冷冻-抽气-解冻循环，用氮气对聚合瓶中的反应体系进行排气处理。
- 具体操作如下：使用冷凝阱将聚合瓶中的溶液冷冻，将聚合瓶固定在铁架台上，通过带有针头的导管（#9 针头，内径 0.65 mm，外径 0.9 mm）对反应混合物进行抽真空并通入氮气。密封聚合瓶后，在室温下解冻溶液 30 分钟。
- 重复冷冻-抽气-解冻循环三次。
- 将聚合瓶放入 70 °C 的油浴中，在氮气氛围下反应 24 小时。
- 将聚合瓶在 0 °C 下冷却，打开橡胶塞以终止聚合反应。
- 将丙酮在 -20 °C 冰箱中预冷 2 小时，然后按 50:1 (v/v) 的比例与第 1.5 步的反应溶液混合。随后，在 8,200 × g 条件下离心 10 分钟，去除丙酮并收集沉淀物。
- 为了纯化合成的 PBNHEMA，将收集的沉淀物溶解于 2 mL 纯水中，再按 1:50 (v/v) 的比例与预冷的丙酮混合。在 8,200 × g 条件下离心 10 分钟，收集沉淀物。重复该过程三次。
- 使用 50 °C 的真空干燥器干燥所得的 PBNHEMA。干燥后，用天平称量粉末质量，并根据公式 1计算产率。
(1)
注：本实验中获得的产率为 77.2%。
2. BNHEMA-b-APMA 聚合物（BA）的合成
- 溶解 0.96 g 的 N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐（APMA）和0.93 g PBNHEMA 溶于5 mL蒸馏水中，置于10 mL烧杯中。
- 将0.01 g的4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)（ACVA）溶解于0.5 mL 1,4-二氧六环中，并与2.1部分的APMA-PBNHEMA溶液混合。
- 将混合物转移至聚合瓶中，并用干燥氮气通风1小时。
- 将聚合瓶放入 70 °C 油浴中在氮气氛围下反应24小时。
- 将聚合瓶置于冷藏环境中 0 °C 打开橡胶塞以终止聚合反应。
- 将溶液转移至步骤1.6中的预冷丙酮中，然后在8,200 x g 10分钟以沉淀BA。
- 将BA溶解于2 mL蒸馏水中，并在预冷的丙酮中沉淀聚合物，重复三次。
- 干燥所制备的 BA 50 °C 真空干燥并称量所得粉末。根据以下公式计算产率： 公式 2.
注意：本实验中，产率计算为82.0%。
3. 通过茚三酮法测定BA共聚物中APMA的摩尔百分比
注意：分光光度法用于测定多种氨基酸组分的含量。其原理是氨基酸与茚三酮发生显色反应，其吸光度在一定程度上与氨基酸含量相关13,14。
- 将5 g水合茚三酮溶解于125 mL沸蒸馏水中。同时，将5 g维生素C溶解于250 mL温热蒸馏水中。在磁力搅拌下，将250 mL维生素C溶液逐滴加入茚三酮溶液中。继续搅拌15分钟，然后将反应液置于4 °C冰箱中冷却。
- 将溶液从冰箱中取出，使用布氏漏斗抽滤，得到还原型茚三酮。收集沉淀物，并将其保存在五氧化二磷干燥器中。
- 将85 mg茚三酮和15 mg还原型茚三酮溶解于10 mL乙二醇单甲醚中，配制茚三酮显色液。
注：茚三酮显色液可与APMA中的α-氨基反应，生成一种紫色化合物，其结构如先前研究中所述15。 - 分别用1 mL乙酸盐缓冲液（2 M，pH 5.4）稀释1 mL浓度为0、1、10、100、1,000 mg/mL的APMA单体溶液，然后各自加入1 mL茚三酮显色液。
- 将各混合液在沸水浴中加热15分钟，随后用流水冷却。静置5–10分钟后，加入3 mL 60%乙醇稀释并充分混匀。使用分光光度计在570 nm处测定吸光度，并绘制标准曲线（公式3）。
注：公式3是根据570 nm吸光度与APMA浓度之间的线性拟合得出的。 - 将0.01 g BA溶解于1 mL蒸馏水中；加入1 mL乙酸盐缓冲液（2 M，pH 5.4）和1 mL茚三酮显色液。根据570 nm处的吸光度计算APMA的摩尔含量。
(5)
注：计算公式如下（公式3–6）。
4. 甲硫氨酸接枝BA聚合物（mBA）的合成
- 在回收烧瓶中，将 8.9 mg Fomc-甲硫氨酸溶于 5 mL DMSO 中。
- 向回收烧瓶中加入 6.92 mg 盐酸 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDCl）和 4.86 mg 羟基苯并三唑（HOBT），在 0 °C 下反应 0.5 小时。
- 将 2.59 g BA 溶于 5 mL DMSO 溶液中，然后加入 50 μL 三甲胺；将此溶液逐滴加入回收烧瓶（步骤 4.2）中，在室温下反应 0.5 小时。
- 使用透析袋（截留分子量 10 kDa）在 2 L 烧杯中对步骤 4.3 中的 BA 溶液进行透析，以去除 DMSO 和三甲胺，透析时间为 24 小时；每 6 小时更换一次去离子水。
- 将获得的 mBA 冷冻干燥，称重后根据 公式 7 计算产率。
注意：本实验中，产率为 71%。 - 通过测定 570 nm 处的吸光度，定量含 NH2 的 mBA，以计算接枝甲硫氨酸的量。根据 公式 8 计算甲硫氨酸的摩尔含量。
5. 胍基化和甲硫氨酸偶联的BNHEMA-b-APMA聚合物（mBG）的合成
注意：合成了三种不同的 mBA1、mBA2 和 mBA3 共聚物。以下步骤以 mBA3 共聚物为例进行说明。
- 将含有 60 μmol 氨基的 mBA3 溶解于 5 mL 纯水中。
注意：氨基含量采用第 3.5 步所述的茚三酮法进行定量。 - 将 40.6 mg（300 μmol）胍基化试剂 1-氨基地唑盐酸盐溶解于 mBA 溶液中。
- 用饱和碳酸钠溶液调节 pH 至 9.0，并在室温下稳定反应 24 小时。
- 使用透析袋（截留分子量 10 kDa，2 L）在烧杯中用去离子水对 mBG 产物进行透析，并将其保存为冻干粉末形式。
通过公式 8计算得产物收率为 85%。
(8) - 将 mBG 粉末溶解于核磁管中的 D2O 中，并采用1H 核磁共振波谱法（1H NMR）进行表征16。
6. mBG/pDNA 复合物的制备与表征
- 将50 μg pDNA溶解于50 μL无RNase/DNase的水中。
- 将1 mg mBG共聚物溶解于1 mL无RNase/DNase的水中。
- 根据不同的投料比（即不同的N/P比，分别为1:1、4:1、8:1、16:1和32:1），将mBG共聚物溶液直接加入pDNA溶液中。
注意：N/P比定义为聚合物中胍基的氮原子与pDNA中磷酸基团的摩尔比，即聚合物中GPMA链段与pDNA中单核苷酸的摩尔比。N/P比根据mBG中氨基氮（N）和pDNA中磷酸基团（P）的分子量计算得出。 - 使用涡旋混合器混合溶液，并在室温下静置30分钟。随后将混合物分散于磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，并将所得的mBG/pDNA复合物在4 °C保存，用于后续实验。
注意：采用动态光散射法（DLS）检测mBG及其复合物的平均粒径和Zeta电位17。 - 在DLS和Zeta电位样品池中，用1 mL PBS（pH 7.4）稀释10 μL mBG/pDNA复合物溶液。
注意：粒径和Zeta电位检测重复三次，取三次测量结果的平均值。
7. mBG/pDNA 复合物的电泳滞留实验
注意：通过电泳迁移阻滞实验确定最小电荷比。
- 取五组不同N/P比（1:1、4:1、8:1、16:1和32:1）的mBG/pDNA复合物，每组含50 μg pDNA。
- 向mBG/pDNA复合物样品中加入6x上样缓冲液，使其终浓度为1x。
- 将溶液加入1.5%琼脂糖凝胶中，以pDNA作为对照，在90 mV电压下电泳15分钟。
- 使用凝胶成像系统拍摄凝胶图像。
8. mBG/pDNA 复合物的细胞毒性
- 以每孔 104 个细胞的密度将 MCF-7 细胞接种至 96 孔板中。随后，在含 5% CO2 的湿润环境中，于 37 °C 培养箱中使用 DMEM 培养基（含 10% FBS 和 1% 抗生素）培养 12 小时。
- 将培养基更换为不含抗生素的 DMEM 培养基，其中含有 10% 胎牛血清（FBS）以及不同电荷比（N/P 4、8、16 和 32，n=6）的 mBG/pDNA 多聚复合物，继续培养 6 小时，以加入等体积 PBS 溶液的细胞作为对照组。随后，更换为 150 μL 新鲜的 1640 培养基，继续培养 24 小时。
- 向 96 孔板中每孔加入 5 mg/mL 的 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液 20 μL，继续培养 4 小时。
- 吸除孔内溶液，每孔加入 150 μL DMSO，振荡 96 孔板 30 秒。
- 使用酶标仪在 490 nm 处测定光密度（OD），以反映细胞活力。根据 公式 9 计算细胞活力百分比。
细胞活力 % =
(9)
9. mBG/GFP-pDNA 复合物的转染效率
- 将含有报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的质粒DNA（GFP-pDNA）50 μg溶解于50 μL无RNase/DNase的水中。然后将1 mg mBG共聚物溶解于1 mL无RNase/DNase的水中。将pDNA与mBG溶液按氮磷电荷比（N/P）分别为1:1、4:1、8:1、16:1和32:1混合，室温孵育30分钟。使用超声波（30秒）分散mBG/GFP-pDNA多聚复合物溶液，并于4 °C保存以用于后续实验。
注：N/P比值根据mBG中的氨基氮（N）与pDNA中磷酸基团（P）的分子量计算得出。 - 以每孔2 × 105个细胞的密度将MCF-7细胞接种于6孔板中，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养12小时。
- 更换培养基为含有不同N/P比值（4、8、16和32）的mBG/GFP-pDNA多聚复合物的新鲜培养基，作用6小时。
- 更换为2 mL新鲜RPMI1640培养基，继续培养48小时。
- 收集细胞，使用流式细胞仪检测绿色荧光。
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结果
根据表1所示的目标聚合度加入BNHEMA；mBG的合成步骤如图1所示。首先，在水-二氧六环体系中，以4-氰基戊酸二硫代苯甲酸酯为链转移剂，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）法合成BNHEMA均聚物。其次，将PBNHEMA作为链转移剂，用于制备BNHEMA-b-APMA嵌段共聚物。APMA单体的加入量依据表1所示的目标聚合度确定。采用凝胶渗透色谱法（GPC）检测不同投料比下BA的分子量（表1）。通过茚三酮法测定不同投料比BA中APMA链的实际摩尔含量（表1）。根据我们先前的研究5，本研究选用mBG3，因其APMA含量最高。最后，将甲硫氨酸接枝到APMA链上，并将剩余的氨基完全胍基化，从而制备得到mBG。图2为mBG的1H NMR数据。在N/P比为16时，mBG/pDNA聚集体的平均粒径和Zeta电位...
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讨论
本研究介绍了一系列BNHEMA-b-APMA嵌段聚合物阳离子基因载体。这些嵌段聚合物通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）方法合成。引入亲水性片段BNHEMA以提高溶解性。通过修饰甲硫氨酸和胍基以增强靶向能力与转染效率5。APMA链段含量的增加以及mBG共聚物中的胍基化作用降低了mBG/pDNA聚集体的粒径。该复合物的粒径和表面电位使其易于穿越细胞膜，适用于基因转染。实验的关键点在于严格控制BNHEMA单体与CTP的摩尔比为45:1，CTP与ACVA的摩尔比为2:1，反应温度为70 °C。在纯化过程中，预冷丙酮与聚合物溶液的体积比必须高于50:1。
在相同的N/P值下，随着APMA链比例的增加，mBG/pDNA复合物的粒径减小。这些结果表明，增加APMA链含量以及胍基化能够降低复合物的粒径。粒径和表面电位使该复合物易于穿越细胞膜，适用于转染。采用凝胶电泳研究了复合物形成与N/P比之间的关系，数据显示最小N/P比为4。本研究将为阳离子基因载体的进一步研究提供有价值的基礎数据。然而， BNHEMA-b-APMA不...
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披露
作者声明，本文所讨论的内容与任何金融机构均不存在利益冲突。
致谢
本研究得到中国国家重点研发计划（编号：2016YFC0905900）、国家自然科学基金（编号：81801827、81872365）、江苏省基础研究计划（自然科学基金，编号：BK20181086）以及江苏省肿瘤医院科研基金（编号：ZK201605）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-羟基苯并三唑 | Macklin Biochemical Co., Ltd,中国 | H810970 | ≥97.0% |
| 1,4-二氧六环 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10008918 | AR |
| 1-氨基脒基吡唑盐酸盐 | 阿拉丁有限公司，中国 | A107935 | 98% |
| 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 | 阿拉丁有限公司，中国 | E106172 | AR |
| 4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸) | 阿拉丁有限公司，中国 | A106307 | 分析纯（AR） |
| 4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫代)戊酸 | 阿拉丁有限公司，中国 | C132316 | >97%(HPLC) |
| 乙酸盐 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 81014818 | AR |
| 丙酮 | 国药集团化学试剂有限公司，中国 | 10000418 | AR |
| 琼脂糖 | 阿拉丁有限公司，中国 | A118881 | 高分辨率 |
| 抗坏血酸 | 阿拉丁有限公司，中国 | A103533 | AR |
| DMSO | 阿拉丁有限公司，中国 | D103272 | AR |
| 乙二醇 | 阿拉丁有限公司，中国 | E103319 | AR |
| N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐 | 阿拉丁有限公司，中国 | N129096 | ≥98.0%(HPLC) |
| N,N-双(2-羟乙基)甲基丙烯酰胺 | 载琪生物科技有限公司，中国 | CF259748 | ≥98.0%(HPLC) |
| 茚三酮 | 阿拉丁有限公司，中国 | N105629 | AR |
| PBS缓冲液 | 阿拉丁有限公司，中国 | P196986 | pH 7.4 |
| 质粒DNA | 百奥格有限公司，中国 | pDNA-EGFP | pDNA-EGFP |
| 质粒DNA | 百奥格有限公司，中国 | Pdna | pDNA |
| 十水合碳酸钠 | 阿拉丁有限公司，中国 | S112589 | AR |
| 三甲胺 | 阿拉丁有限公司，中国 | T103285 | AR |
参考文献
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重印与许可
