利用 tap 标签纯化叶绿体转移蛋白配合物的亲和纯化

摘要

我们在这里提出了一个经过验证和测试的方案, 以纯化叶绿体蛋白进口复合物 (toc-tic 复合物) 使用 tap-tag 标签。一步亲和力隔离协议有可能应用于任何蛋白质, 并可通过质谱技术识别新的相互作用伙伴。

摘要

叶绿体的生物发生需要将数千个核编码的蛋白质导入到质体中。这些蛋白质的导入取决于外 (toc) 和内 (tic) 叶绿体膜的转移。toc 和 tic 配合物是多聚体的, 可能含有未知的成分。该领域的主要目标之一是建立完整的 toc 和 tic 组件清单。为了分离 toc-tic 复合物和鉴定新的成分, 通过添加串联亲和力纯化 (tap) 标签, 对前蛋白受体 toc159 进行了修饰, 得出 tap-toc159。tap-tag 标签是为两个连续的亲和力纯化步骤 (因此 "串联亲和力") 而设计的。这些研究中使用的 tap 标签由一个 n 端 igg 结合域组成, 该域来源于金黄色葡萄球菌蛋白 a (prota), 然后是钙调素结合肽 (cbp)。在这两个亲和力标签之间, 包括了烟草蚀刻病毒 (tev) 蛋白酶裂解位点。因此, tev 蛋白酶可用于与 igg 微珠结合后对含 toc159 复合物进行温和洗脱。在这里介绍的协议中, 省略了第二个钙素-亲和力纯化步骤。纯化方案从全细胞膜的制备和增溶开始。经威慑后, 用 igg 珠培养溶解性膜蛋白, 对含 tap-toc159 复合物进行免疫分离。在结合和广泛清洗后, 含有复合物的 tap-toc159 使用 tev 蛋白酶从 igg 珠中分离并释放, 从而去除金黄色葡萄球菌igg 结合域。西方印迹的孤立的 toc159 含有的复合物可以用来确认已知或怀疑的 toc 和 tic 蛋白的存在。更重要的是, 含有 toc159 的配合物已被成功地用于通过质谱识别 toc 和 tic 复合物的新成分。我们提出的协议有可能允许有效地分离任何膜结合蛋白复合物, 用于通过质谱技术识别尚未未知的成分。

引言

植物依靠叶绿体进行光合作用和光自养生长¹。绝大多数叶绿体蛋白被编码在细胞核中, 在细胞溶胶中合成, 并通过包膜中的 tic 和 toc 复合物导入叶绿体²。toc 复合体的核心包括 toc75 蛋白传导通道和两个受体 gtpase Toc75 和 Toc75^3,4,5。目录159是叶绿体的生物发生所必需的, 并介导光合作用相关蛋白的大量积累.tic 综合体由 tic20 蛋白传导通道以及 tic110 和 tic40^7、8组成。最近, 一个1md 蛋白移位复合物在内包膜被隔离, 并包含以前未被识别的成分⁹, 其中之一是 tic56。我们最近使用 tap-toc159 亲和力纯化协议共分离了 1个 mda 复合体中的 tic56。数据表明, "规范" toc函配合物与 1 mda 复合物¹⁰之间存在结构重叠。以前未知的组件, 如 koc1, 也被确定为新的交互伙伴的 toc 和 tic 复合体使用这里描述的 tap 方法 10,^11.

因此, tap-标记纯化是一种有效的方法, 用于分离蛋白质复合物和通过随后的质谱分析^{12 识别相互}作用的伙伴。tap 标记由两个 igg 结合重复从钙调素结合肽 (cbp) 分离的烟草蚀刻病毒 (tev) 蛋白酶裂解位点。最初的方法, 包括 igg 亲和力纯化步骤, 其次是 tev 裂解和随后的钙调联亲和层析, 允许本地纯化大型和高度纯蛋白质复合物^13,14.我们简化了程序, 并证明, 含有 toc159 的蛋白质复合物也可以有效地纯化, 只使用 igg 亲和力纯化步骤, 然后 tev 裂解^洗脱15。根据我们的经验, 钙调素亲和力步骤的遗漏导致了更高的产量, 因此可能适合于低丰度蛋白质。

总之, 我们设计了稳定的转基因a. thaliana线, 表达 tap-tocar159 在ppi2 (toc159 ko 突变体) 的背景下, 并建立了它作为一个可靠的来源, 用于纯化 toc-tic 复合物。toc-tic 复合物的隔离协议始于植物材料在无洗涤剂缓冲液中的均质化。离心后, 上清液被丢弃。含有全膜组分的颗粒使用含有洗涤剂的缓冲液溶解。经过超离心步骤, 将含有溶解性 toc-tic 配合物的上清液应用于 igg 树脂的亲和纯化。经过几个清洗步骤后, 使用含有 tev 蛋白酶的缓冲液进行洗脱, 以选择性地将 igg 结合域的下游裂解, 并温和释放含有 oc159 的原生复合物。tev 洗脱液可通过西方印迹或质谱直接分析, 以识别目录^{159 10、11、15}的相互作用伙伴。该方法也被用来识别 toc159¹⁵的翻译后修饰。在未来, 原生的含有目录159的配合物可用于使用低温电子显微镜进行结构研究。

方案

1. 拟南芥植物的制备

1. 制备1升半强度的 murashige 和 skoog (ms) 培养基, 包括1% 蔗糖的维生素, 并调整 ph 值与氢氧化钾 (koh) 5.7。在120°c 下加入0.8% 的植物琼脂和高压灭菌器20分钟。
2. 每个 petri 板 (直径14.5 厘米, 高3厘米) 倒75毫升 ms 介质, 并允许凝固1小时。
3. 将30 毫克的拟南芥种子加入1.5 ml 微泡管中, 用含有 0.05% (v/v) 的70% 乙醇进行表面消毒 5分钟, 然后用 100% (v/v) 乙醇10分钟。
4. 将种子转移到无菌滤纸上进行干燥。将灭菌种子均匀地撒在 ms 板上 (每个基因型至少需要8-10 个板), 并用手术胶带密封每个盘子。
5. 在4°c 的温度下, 在黑暗中将盘子生两天, 使种子同步发芽。转移到具有以下光循环的生长室: 8小时120μmol-2秒- 1 光,在22-20 时的16h 暗。

2. hsigg 琼脂糖珠的制备

1. 将 cnbrm 激活的琼脂糖珠 (4 克) 悬浮在 1 mm hcl 的 100 ml 中, 在室温下孵育30分钟。
2. 将琼脂糖珠转移到烧结玻璃过滤器中, 用 100 mm hcl 的100毫升真空清洗, 重复2-3 次。
   注: 将洗涤液前至4°c。
3. 将琼脂糖珠在1毫升冷 100 mm hcl 中再利用, 转移到50毫升锥形离心管中。用 100 mm hcl 的3毫升清洗烧结玻璃滤清器, 并将液体转移到同一管中。
4. 在4°c 下, 在 400xg下旋转 5分钟, 并用移液器取出上清液。
   注: 请勿将管子装饰。
5. 在耦合缓冲液的50毫升中重新拔插磁珠 (表 1);简单混合, 然后在4°c 下在400xg 下旋转5分钟。
6. 在偶联缓冲液的10毫升中溶解50毫克的冻干智人 igg (hs-igg), 轻轻混合琼脂糖珠, 在4°c 的旋转振动台中隔夜孵育。
7. 在4°c 下, 在 400xg下旋转 5分钟, 并用移液器取出上清液。
8. 用50毫升的耦合缓冲液清洗 igg 琼脂糖珠, 在 400xg下旋转 5分钟, 4°C。
9. 用50毫升的阻滞缓冲液 (表 1) 重新扫描 igg 琼脂糖珠, 在4°c 下在 400xg下旋转5分钟。重复一次。
10. 在50毫升的阻滞缓冲液中重新旋转 igg-agsregsic 珠, 在 rt 旋转混合物 2小时, 在 4°c 时旋转 400xg 5分钟。
11. 取下上清液, 在氯化钠偶联缓冲液200毫升中重新悬浮 IgG-agarose 珠 (表 1)。
12. 为了阻止任何剩余的交联 cnbr 基团, 请用 0.1 m 甘氨酸-hcl 的100毫升清洗 igg-agleads阳性珠, ph 值2.8。在4°c 下, 在 400xg下旋转 5分钟, 并取出上清液。用 0.2 m 甘氨酸-hcl 清洗, ph 2.8, 在4°c 时在 400xg下旋转 5分钟, 并去除上清液。最后, 用200毫升的超纯水清洗 igg-琼脂糖珠。
13. 用200毫升的超纯水和200毫升的 pbs 缓冲液清洗 igg 琼脂糖珠 (表 1)。
14. 将 IgG-agarose 珠在20毫升的 pbs 缓冲液中, 用 0.01% nan₃ (氮化钠) 进行再利用, 并在4°c 下储存。

3. 膜分数的分离和溶解

1. 用冷砂浆和带沙子的将10周大的幼苗在液氮中磨碎。
2. 在10克地面组织中加入20毫升的冷磨缓冲液 (表 1), 搅拌均匀, 在冰上解冻。
3. 通过两层快速过滤材料将均质体过滤到50ml 锥形离心管中。过滤前, 用研磨缓冲液浸泡快速过滤材料。
4. 在4°c 条件下, 在 1500xg处离心滤液 10分钟, 并将上清液转移到冷却的50毫升锥形离心管中, 再重复一次相同的步骤, 收集上清液。保留 "总分数" 的200μl 样品, 并存储在-80°c, 以便以后进行分析
5. 将上清液转移到冷 38.50 ml 超离心管, 并使用冷磨缓冲液顶部至 35 ml。在超离心机中以 100, 000xg 的温度在4°c 下离心 1小时.
6. 将上清液转移到50毫升锥形离心管上。保留200μl 的 "可溶性分数" 样品, 并存储在-80°c, 以便以后进行分析。
7. 在研磨缓冲液中, 使用玻璃聚四氟乙烯均质机重新悬浮绿色颗粒。在超离心机中以 100, 000xg 的温度在4小时内离心 1小时, 并丢弃上清液.
8. 使用玻璃聚四氟乙烯均质机在1x 研磨缓冲液的 18.75 ml 中重新注入绿色颗粒, 并加入 9.375 ml 的1x 研磨缓冲液。
9. 加入9.375 毫升的4倍溶解性溶液 (表 1) (包含 tx-100 洗涤剂), 在4x 的 "旋转振动台" 上给予 37.5 ml 和孵育30分钟。
10. 在超离心机中以 100, 000xg 的温度在4°c 下离心 1小时. 将上清液转移到50毫升锥形离心管上。保留上清液的200μl 样品 (未来的 "负载分数"), 并存储在-80°c, 以便以后进行分析。
11. 在 37.5 ml 的研磨缓冲液中重新弹性颗粒。将不溶性部分的样品保存在-80°c

4. 免疫沉淀

1. 在缓冲区 a 中平衡100μl 填充 igg 琼脂糖树脂 (表 1), 在4°c 时在 100xg 下旋转5分钟。
2. 在4°c 下, 取出上清液, 在100μl 的缓冲 a 中重新悬浮 igg-琼脂糖树脂。
3. 将清洗后的 igg-ags糖树脂转移到 37.5 ml 的溶解性膜中, 在4°c 的50毫升锥形离心管中, 在旋转振动台上孵育一夜。
4. 在4°c 条件下, 将 igg 琼脂糖树脂沉积 100xg 5分钟, 并用移液器去除上清液。保留200μl 样品的 "流经", 并存储在-80°c, 以便以后进行分析。
5. 在缓冲 a 的 37.5 ml 中清洗 igg-琼脂糖树脂, 在旋转振动台孵育10分钟。
6. 在4°c 下, 将 igg-琼脂糖树脂沉积在100xg 下 5分钟, 用移液器去除上清液, 在100xg、4°c、5分钟的15毫升离心管和离心机中加入5毫升研磨缓冲液 a, 保留200μl 的 "清洗 1" 样品, 存放在-80°c供以后分析。
7. 使用缓冲区 a 重复 5次5毫升清洗步骤。
8. 在没有抑制剂的情况下执行最后两个清洗步骤 (naf、蛋白酶抑制剂和 pmsf)
   注: 在此阶段不再需要抑制剂, 也无需降低成本。保留最后清洗步骤 "最终清洗 (w6)" 的200μl 样品, 并存储在-80°c, 以便以后进行分析。
9. 将 igg-琼脂糖树脂转移到具有35μm 过滤器的500μl 自旋柱上, 并用300μl 的 tev 洗脱缓冲液 (表 1) (不含 actev) 清洗珠子两次, 以进行平衡。关闭旋转列。
10. 加入300μl 的 tev 洗脱缓冲液, 其中包含50个单位 (10μl) 的 actev。在加入树脂之前, 先在管子中加入混合物。
11. 在16°c 时, 用珠子在热敏仪中培养自旋柱, 每隔 30分钟350转每分钟 2小时, 轻轻将柱倒置几次。
12. 打开旋转柱, 将其放入一个新的清洁 1.5 ml 管中, 在4°c 下以100xg 旋转 5分钟, 以收集洗脱液。
13. 干燥 (例如) 10% (v/v) 的洗脱样品 (~ 25μl) 在离心蒸发器和用于质谱或其他进一步分析。
14. 将剩余的洗脱液 (~ 275μl) 分成 11 1.5 ml 离心管 (每管 25μl), 在离心蒸发器中干燥, 并储存在-80°c。
15. 分析在整个过程中保留的样品, 以及通过标准 sds-page 进行分析, 然后进行免疫印迹。对于样品制备, 沉淀50微克的 total (t)、load (l)、fk)、洗涤 1 (w1) 和200μl 洗涤⁶(w6), 通过氯甲酸/甲醇萃取16。
16. 在沉淀样品和25μl 的洗脱干燥样品中加入10μl 的 2x sds-page 装载缓冲液 (表 1)。在95°c 的高温下, 在热块中产生涡流并煮沸10分钟。
17. 通过使用抗肿瘤抗体进行免疫印迹分析总 (t)、负载 (l)、流经 (ft)、清洗 1 (w1)、洗涤 6 (w6) 和洗脱 (e), 以确定分离过程的效率。

结果

我们在这里描述了一个方案, 用于纯化一个 tap 标记的叶绿体包膜蛋白复合物从转基因a. thaliana植物。如图 1a 所示, 表达35:ntap-tocar59 结构的植物被用来分离这个复杂体, 而表达35s:ntap 结构的植物被用来作为对照。图 1b显示了 tap-toc159 蛋白复合物纯化的详细步骤, 然后进行质谱分析, 以便识别相互作用的蛋白质。免疫印迹分析 (图 2, 右侧) 证实, 孤立的 tap-toc159 与 toc 复合体的 toc75 和 toc33 相互作用。已知磷酸化物 toc159 的叶绿体外膜激酶 koc1 也与 tap-toc159 复合物 (图 2b, 右侧) 共同分离。tic110 的存在表明, 孤立的 tap-toc159 综合体也包含 tic 综合体的组成部分。针对与蛋白质导入无关的胸状蛋白而产生的 fbn1a 抗体没有识别 tap-toc159 复合物, 表明没有污染。在阴性对照中, 免疫沉淀的 ntap 蛋白没有与任何 toc-tic 蛋白 (图 2, 左侧) 共同分离, 并证实了 tap-tocar159 纯化的特异性。

图 1.施工方案和亲和性纯化工艺.35s:ntap-toc159 结构, 编码 ntap-tocar159 在拟南芥中稳定地表达。负控制工厂表达了35s:ntap 构造, 单独编码 tap 标记。(b). 阶梯式亲和力纯化方案包括膜分离和增溶、igg 琼脂糖免疫纯化、洗涤、tev 蛋白酶裂解和洗脱。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2.目录159蛋白的串联亲和力纯化.从 ntap-toc15-pipoumothp 植物中纯化了 n-端的tap 标记的 toc159, 并将从 tap:wt 植物中纯化为阴性对照。用西方印迹法分析了总蛋白提取物 (t)、溶解膜蛋白 = 负载分数 (l)、流经 (ft)、第一和最后洗涤分数 (w1 和 w6) 以及10% 的 tev 洗脱液。用对 oc159 的抗体 (at4g02510) 对膜进行了检测, toc75 (at3g46740)、toc33 (at1g02280)、koc1 (at4g3250)、tic110 (AT1G02280) 和 fbn1a (AT4G02510)。请点击这里查看此图的较大版本.

缓冲区表
耦合缓冲器	纳赫科3 调整到 ph 8.5 调整 ph 值与 0.1 mna 2co3	100 mm
阻塞缓冲区	trit–hcl 使用 hcl 调整到 ph 值8。	100 mm
pbs 缓冲区	na2hpo4 kh2po4 Nacl 氯化钾 使用 hcl 调整为 ph 7.3。	4.3 m 1.4 mm 137 2。7
氯化钠耦合缓冲器	耦合缓冲器 Nacl	100万
2倍研磨缓冲器	Tris-HCl, ph 值7.5 与 hcl。 Nacl Naf 私营军事和安保部 植物蛋白酶抑制剂鸡尾酒	100 mm 200 mm 5米 1米 0.20
4倍溶解性解决方案	甘油 triton-x100	40% 3%
缓冲区 a	2倍研磨缓冲器 1x 研磨缓冲器 4倍溶解性解决方案	100毫升 50毫升 25毫升 25%
tev 洗脱液缓冲	Tris-HCl, ph 值8与 hcl edta, ph 值8与 hcl Nacl 甘油 triton-x100 dtt	50 mm 50万米 100 mm 10% 0.75 1米
2个 sds-page 加载缓冲区	Tris-HCl ph 值6.8 与 hcl Sds 甘油 溴酚蓝 dtt	0.1 m 4% 20% 0.20 0.2 m

表1。缓冲配方。

讨论

我们证明了单步 tap 标签纯化是一种特殊而有效的拟南芥目录-tic 复合物纯化方法。虽然 tap 标记将允许两个连续的纯化步骤 (igg-其次是 tev 蛋白酶-裂解后的钙调素亲和力纯化), 但我们相信, 在许多情况下, tev 蛋白酶裂解后的第一个亲和力步骤就足够了。我们的目标, toc159, 是低丰富和包括第二钙调素亲和力步骤过度减少蛋白质产量, 这是主要原因排除在我们目前的协议。tev 洗脱本身是一个高度特定和温和的纯化步骤, 将只释放 tap 标记的目标与相关的相互作用伙伴, 同时污染的蛋白质不具体粘附到 igg 树脂将留在那里。因此, 结合 igg 亲和力步骤, tev 洗脱的结果是一个足够有效的纯化, 我们和可能许多其他的目的。

必须注意的是, tap 标记结构在体内完全起作用。tap 标记可能对蛋白质活性、稳定性或定位有潜在的有害影响。目录159由 n 端酸性域、中央 gtp 结合域和 c-端膜域三个域组成, 它将目录159锚定在外叶绿体^{膜 2}中。为了避免对膜插入的潜在干扰, 我们将 tap 标签融合到目录159的 n 端。融合到 n-终端是一个例外, 而不是规则。许多蛋白质含有 n 端靶向信息, 因此应该通过标记在 c 端。我们保证, toc159 是在体内功能的ppi2突变体 (缺乏 toc159 的白化病突变体) 与 tap-toc159。绿色野生型表型的抢救表明, tap-toc159 是功能^{性的 15}。

净化协议被用来确定目录159的新的互动伙伴, 其中包括 koc1 和 tic56^10,11。总共约有30种蛋白质与这一复杂的蛋白质相关, 这表明新的相互作用伙伴将在不久的将来被分离和表征。虽然我们强烈推荐用于复杂纯化的 tap-tag 标记, 但我们仍想指出, 这里介绍的其他版本存在, 可能对某些应用程序非常有用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaHCO3	PanReac AppliChem	A0384
Tris	Biosolve	0020092391BS
Na2HPO4	Sigma	S7909
KH2PO4	PanReac AppliChem	A2946
NaCl	泛离子阱 AppliChem	A2942
NaF	Sigma	S1509	毒性
PMSF	PanReac AppliChem	A0999	有毒
植物蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P9599
甘油	PanReac AppliChem	A0970
Triton X100	Roche	10789704001
甘氨酸	PanReac AppliChem	A1067
EDTA	Carl Roth	8043
二硫苏糖醇 （DTT）	PanReac AppliChem	A1101
SDS	PanReac AppliChem	A0675
溴酚蓝	Sigma	B0126
HCl	VWR	20252-290	腐蚀性
蔗糖	PanReac AppliChem	A3935
Murashige 和 Skoog 培养基，含维生素	Duchefa Biochemie	M0222
植物琼脂	Duchefa Biochemie	P1003
培养皿	Greiner Bio-one	639102
1.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72.706
乙醇	Fisher 化学	E/0600DF/15
滤纸	Whatman	10311804
手术胶带	3M	1530-1
CNBr 活化琼脂糖珠（琼脂糖凝胶 4B）	GE Healthcare	17-0430-01
烧结玻璃过滤器	DURAN	2515703
离心管 50 mL	TPP	91050
纯化免疫球蛋白 G （HsIgG）	MP 生物医学	855908
旋转摇床	IKA	4016000
NaN3 （叠氮化钠）	Sigma	71290	有毒
快速过滤材料 （Miracloth）	Merk-Millipore	475855
Ultracentrifube XNP-80	贝克曼库尔特	A99839
转子 SW 32 Ti	贝克曼库尔特	369650
超速离心管	贝克曼库尔特	326823
玻璃特氟龙均质器 （Potter）	惠顿	357426
旋转柱 （Mobicol）	Mo Bi Tec	M1003
过滤器 35µm 代表 离心柱 （Mobicol）	Mo Bi Tec	M513515
AcTEV	Invitrogen	12575-015
离心蒸发器 （Speed Vac）	Eppendorf	5305000100
FBN1A（PGL35） 抗体	AgriSera	AS06 116	RRID：AB_2247012
Sand， Fontainebleau	VWR	27460.295