利用离体灌注大鼠小肠研究肠道激素分泌的机制

摘要

本文介绍了一种用于研究肠道激素分泌和肠吸收分子机制的强大且具有生理相关性的模型——离体灌注大鼠小肠。

摘要

肠道是人体最大的内分泌器官，可产生超过15种不同的肽类激素，这些激素调控食欲和摄食行为、消化过程、营养物质的吸收与分布，以及餐后血糖波动。理解调控肠道激素分泌的分子机制，对于阐明并转化肠道激素生理学具有重要意义。传统上，肠道激素分泌的机制研究通常采用体内实验（在实验动物或人体中进行）或利用分泌肠道激素的原代黏膜细胞培养物或细胞系。本文介绍一种离体灌流大鼠小肠模型，作为研究肠道激素分泌的替代方法。该模型的优点在于其依赖完整的肠道组织，因此能够重现体内研究中大多数与激素分泌相关的生理重要参数，包括黏膜极性、旁分泌相互作用以及灌流/刺激暴露的路径。此外，与体内实验不同，离体灌流大鼠小肠模型可实现近乎完全的实验控制，并能直接评估激素分泌情况。与体外研究相比，该模型可同时研究分泌的强度和动态变化，从而回答一些关键问题，例如：哪些刺激可引发不同肠道激素的分泌？分泌是由肠道的腔侧还是血管侧所触发？并可深入分析介导分泌反应的分子感受器。此外，该制备模型也是研究肠道吸收的有力工具，可用于详细探究肠道吸收的动力学过程及相关转运蛋白的作用机制。

引言

肠道是人体最大的内分泌器官，可产生超过15种不同的肽类激素，这些激素调控营养物质的吸收与分布、肠道生长，并调节食欲¹。因此，肠道激素参与多种基本生理过程，了解这些激素的分泌模式及其分泌调控的分子机制，对于深入理解基本生理功能以及探讨肠道激素作用的转化医学意义至关重要。然而，如何研究肠道激素分泌背后的分子感知机制？通常，激素分泌可在完整生物体（人类或实验动物）、离体肠道组织、分泌肠道激素的原代细胞培养或永生化细胞系中进行研究^2,3,4,5,6。我们首选的模型是离体灌流大鼠小肠，这是一种具有生理相关性的模型，能够以最佳的时间分辨率详细研究肠道激素的分泌（分泌速率可精确至秒级），且研究结果很可能适用于体内情况⁷。本文将提供该实验操作的详细方案，但首先我们将讨论其他研究肠道激素分泌的方法，并比较这些模型与离体灌流大鼠小肠模型相比的优势与局限性。

如果希望确定某种特定化合物是否调控某些肠道激素的分泌，最终目标应是开展人体研究。因此，若某种化合物在啮齿类动物（体内实验或灌....

方案

所有研究均获得丹麦动物实验监察局（2013-15-2934-00833）和当地伦理委员会的许可，并遵循丹麦动物实验立法（1987年）和美国国立卫生研究院（出版号85-23）的指导方针进行。

1. 实验动物

1. 取雄性Wistar大鼠（250 g），每笼饲养2只，自由摄食标准饲料和饮水，维持12小时光照/12小时黑暗循环。 本实验动物设施使用未经处理的水和Altrromin啮齿类动物饲料（1319 FORTI，Brogaarden，Lynge，丹麦）。 
   注意：动物至少应适应环境一周。

2. 术前准备

1. 配制灌流缓冲液：Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液，添加 0.1% BSA（V 型组分）、5% 右旋糖酐 T-70、3.5 mmol/L 葡萄糖、 以及 5 mmol/L 丙酮酸、延胡索酸和谷氨酸（如需要）；pH 值调至 7.4。
2. 通过适当孔径的滤器过滤，制备足量的灌流缓冲液，并逐滴加入 5 M HCl 将 pH 值调节至约 7.5。
3. 如需要，于实验当天将 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）直接加入缓冲液中，使其终浓度为 10 µM。
   注意： IBMX 是一种磷酸二酯酶抑制剂，可....

结果

确定某一特定刺激是否引起目标肠道激素分泌的能力依赖于稳定的基线分泌水平。此外，若未观察到对刺激的反应，则必须观察到阳性对照引起的显著分泌反应，以排除测试刺激无反应的情况并非源于组织整体反应能力的丧失。图2A和2B展示了一组高质量的数据示例；图中显示了离体灌注大鼠小肠在1分钟间隔下的GLP-1分泌情况（均值±标准误）。在基础状态下，分泌水平稳定；无论是在给予测试刺激（胰岛素）之前还是之后，且对阳性对照（铃蟾肽（BBS））表现出明显的分泌反应。此外，基础状态下的平均GLP-1分泌水平（分别在胰岛素或BBS给药前的基线期），以及胰岛素和BBS刺激期间的平均分泌水平，均以柱状图形式展示（均值±标准误）。通过单因素重复测量方差分析对分泌数据进行统计学显著性检验。综合这些数据可以得出结论：经动脉注射胰岛素不会刺激离体灌注大鼠小肠分泌GLP-1。

讨论

离体灌注大鼠小肠是一种强大的研究工具，可深入研究肠道激素分泌的动力学及其分子机制。使用该模型成功获取数据最关键的步骤是手术操作。对肠道的任何操作不可避免地会对肠组织造成一定程度的损伤，因此应将操作降至绝对最小程度。更为重要的是操作速度，尤其是肠系膜动脉插管的时间。我们的经验是，在血管上切开小孔后几分钟内，必须成功完成导管插入并启动灌注。导管的放置是整个手术中最具挑战性的部分，由于肠系膜动脉管径细小以及门静脉管壁较薄，该步骤较为复杂，需要一定练习才能掌握。然而，静脉导管的插入速度不像肠系膜动脉插管那样紧迫，因为此时肠道已开始灌注并维持存活状态。下一步关键环节是开展实验。若手术成功，灌注的肠道通常可保持良好状态并具有反应性，持续时间可达3小时，灌注压力和流出量在整个实验过程中通常保持稳定。此阶段实验成功最重要的因素是避免气泡进入系统，因为气泡会导致空气栓塞，从而立即降低甚至完全阻断灌注流出量。由于灌注缓冲液含有BSA，并通过气体平衡以确保向灌注肠道提供充足的氧气，因此很难完全避免气泡的形成。然而，气泡应被系统中的气泡捕获装置截留，但该装置会随时间逐渐排空（气泡越多，排空越快），因此必须密切观察气泡捕获装置，并在需要时及时补充灌注缓冲液。同时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
灌流缓冲液用化学品
牛血清白蛋白（BSA）	Merck	1.12018.0500
二水氯化钙（CaCl2 × 2 H2O）	Merck	102382
右旋糖酐70	Pharmacosmos	40014
反丁烯二酸二钠盐（C4H2Na2O4）	Sigma Aldrich	F9642
葡萄糖（C6H12O6）	Merck	108342
七水硫酸镁（MgSO4）	Merck	105886
氯化钾（KCl）	Merck	104936
磷酸二氢钾（KH2PO4）	Merck	104873
丙酮酸钠盐（C3H3NaO4）	Merck	106619
碳酸氢钠（NaHCO3）	Merck
氯化钠（NaCl）	Merck	106404
一水合L-谷氨酸钠（C5H8NNaO4 × H2O）	Merck	106445
名称	公司	货号	备注
灌流设备
通用灌流系统	Harvard Bioscience, Inc.	732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834	Harvard Bioscience, Inc.
四通道滚柱泵	Harvard Bioscience, Inc.	730100
Windkessel	Harvard Bioscience, Inc.	732068
恒温循环器，浴槽容积3L，230V/50Hz	Harvard Bioscience, Inc.	730125
三脚架加热手术台，型号873	Harvard Bioscience, Inc.	733776
带篮式导管，外径=2.0 mm，内径=1.0 mm	Harvard Bioscience, Inc.	733313