本文介绍了一种利用生物素对小鼠肾小球细胞表面蛋白进行体内标记的实验方案。该方案包含小鼠肾脏灌注、肾小球分离以及目标蛋白内源性免疫沉淀的操作方法。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白尿是由于肾小球滤过屏障的破坏所致，该屏障由有孔内皮细胞、肾小球基底膜以及具有裂孔隔膜的足细胞构成。肾小球滤过屏障的精细结构，尤其是裂孔隔膜，依赖于多种细胞表面蛋白之间的相互作用。迄今为止，对这些细胞表面蛋白的研究主要局限于 体外 研究或组织学分析。本文中，我们介绍一种小鼠模型 体内 生物素化标记方法，可实现对生理及病理生理条件下肾小球细胞表面蛋白的研究。本实验方案包含小鼠肾脏灌注、肾小球分离以及目标蛋白的内源性免疫沉淀操作步骤。利用该新型方法可便捷地对肾小球细胞表面蛋白丰度进行半定量分析，所有可被生物素灌注标记并进行免疫沉淀的蛋白均可被研究。此外，无论是否进行生物素化标记，肾小球的分离均能够进一步用于肾小球RNA和蛋白质分析，以及原代肾小球细胞培养。即， 原代足细胞培养
引言
蛋白尿是肾小球损伤的标志，通常伴随肾小球滤过屏障的破坏1。肾小球滤过屏障由有孔内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞组成。肾小球滤过屏障的精细分子结构具有高度动态性，在健康和疾病状态下的肾脏中均存在细胞表面蛋白的转运过程2,3,4,5,6。已有研究表明，细胞表面蛋白的内吞作用对足细胞的存活至关重要7。肾病蛋白（nephrin）和足细胞凸蛋白（podocalyxin）是表达于足细胞上的跨膜蛋白。肾病蛋白是肾小球裂孔隔膜的结构主干，而足细胞凸蛋白是一种唾液酸糖蛋白，覆盖在足细胞的次级足突表面8,9,10。既往研究已证实肾病蛋白和足细胞凸蛋白均存在内吞转运过程3,11,1....
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方案
小鼠由本地动物饲养设施自行繁育，或从法国Janvier Labs公司获得。研究工作严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（NIH出版物第85-23号，1996年修订版）中规定的指导原则进行。所有动物实验均按照相关机构批准的程序执行（德国州政府LANUV批准编号：AZ:84-02.04.2016.A435）。
1. 仪器、溶液和设备的准备
- 配制 1 L 磷酸盐缓冲液，其中添加 1 mM 氯化镁（MgCl₂）2）和 0.1 mM 氯化钙（CaCl2)（外周血干细胞悬液，PBSCM）并通过无菌滤器过滤。
- 每只小鼠准备 5 mL 无菌 PBSCM 用于灌注，并置于冰上。
- 为每只小鼠准备 5 mL 无菌 PBSCM，其中添加 0.5 mg/mL 生物素。
- 为每只小鼠准备 5 mL 无菌 PBSCM，并加入 0.8 x 108 磁珠（例如，200 µL 的 4 x 108 每毫升溶液中的磁珠数量（无需预处理），用于肾小球栓塞。在细胞培养操作台中配制该溶液，以保持磁珠原管的无菌状态。将此溶液置于冰上。
- 将甘氨酸加入PBSCM中，配制成终浓度为100 mM的淬灭溶液（每只小鼠5 mL），置于冰上保存。
- 配制胶原酶溶液（在无菌PBSCM中加入0.378 ....
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结果
为了准确分离肾小球，必须首先用PBSCM灌注小鼠肾脏。PBSCM灌注后，肾脏会变为苍白（图1A）。磁珠栓塞的肾小球在肾脏表面呈现为棕色斑点（图1B）。使用磁力捕获器分离肾小球时，可能会混有肾小管污染（图1C）。在对肾小球进行进一步分析前，需通过更彻底的洗涤使肾小球纯度达到> 95%（图1D）。
体内 生物素化依赖于用生物素标记细胞表面蛋白的能力。为研究这一点，对小鼠肾脏灌注PBSCM或非细胞膜通透性生物素。如图所示 图.......
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讨论
所介绍的方法能够成功分离肾小球，用于研究肾小球的RNA或蛋白质。此外，还可利用分离得到的肾小球建立原代肾小球细胞培养。若在肾小球分离前应用生物素标记，则可实现对肾小球细胞表面蛋白的标记。该方法可 体内 可以研究肾小球细胞表面蛋白质的转运，并能够对蛋白质丰度进行半定量分析。成功检测肾小球细胞表面蛋白质丰度的最关键步骤包括：1）熟练掌握小鼠手术操作技术，尤其是主动脉插管；2）注射器连接时需排除气泡，以避免肾小球发生空气栓塞；3）自使用PBSCM开始灌注后，全程操作需在冰上低温条件下进行。
该技术要求操作者具备熟练的小鼠手术经验。主动脉插管尤为关键，因为血管解剖不当会阻碍肾脏的灌注。主动脉切口应足够大（约为血管直径的50%），以留出足够的空间插入导管。若将导管斜向剪切，插入主动脉时会更加顺利。除了精细的解剖操作外，插入的导管应在主动脉内放置到较高位置，以免阻塞肾动脉。否则，肾动脉将无法被生物素和磁珠有效灌注。
生物素是一种小分子维生素，可高亲和力地结合链霉亲和素蛋白。由于其分子量小（244 Da），生物素不会改变偶.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Blanka Duvnjak 提供出色的技术支持。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，www.dfg.de）资助，项目编号为 M.W. 的 WO1811/2-1 和 I.Q. 的 QU280/3-1。资助方在研究设计、数据收集、数据分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | 用于小鼠手术的显微镜 |
| KL1500LCD | 普尔赫和洛伦兹显微镜技术 | 150500 | 小鼠手术用光源 |
| 隆朋（赛拉嗪）2% | 拜耳 | PZN:01320422 | 麻醉 |
| 显微组织剪 | 布劳恩，埃斯库拉普 | FD100R | 精细剪刀，用于剪切主动脉 |
| Durotip 精细剪刀 | Braun，Aesculap | BC210R | 用于腹部切口 |
| 解剖镊 | 布劳恩，埃斯库拉普 | BD215R | 在打开腹腔之前进行手术 |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | 用于手术 |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | 丝线 |
| 氯胺酮 10% | Medistar | 麻醉 | |
| 隆朋（赛拉嗪）2% | 拜耳 | 麻醉 | |
| 细孔聚乙烯管，内径 0.28 mm，外径 0.61 mm | Portex | 800/100/100 | 导管 |
| 内径0.58 mm、外径0.96 mm的细孔聚乙烯管 | Portex | 800/100/200 | 导管 |
| Harvard 仪器 11 Plus | 哈佛仪器公司 | 70-2209 | 注射泵 |
| EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin | 赛默飞世尔科技 | 21335 | 生物素 |
| Dynabeads 未接触小鼠 T 细胞 | Invitrogen | 11413D | 栓塞肾小球 |
| 胶原酶A | 罗氏 | 10103578001 | 消化肾脏组织 |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 123.21D | 磁力捕获器 |
| 100µm细胞染色仪 | Greiner-bio | 542000 | 用于肾小球分离 |
| Axiovert 40 CFL | Zeiss | 暂无 | 以确认肾小球纯度 |
| TissueRuptor | Quiagen | 9002755 | 组织匀浆机 |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | 用于裂解缓冲液 |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | 用于裂解缓冲液 |
| NaCl | VWR 化学品 | 27810295 | 用于裂解缓冲液 |
| NaF | Sigma-Aldrich | 201154 | 用于裂解缓冲液 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | 用于裂解缓冲液 |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | 用于裂解缓冲液 |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23225 | 遵循制造商的说明 |
| nephrin 抗体 | 祖细胞 | GP-N2 | 用于蛋白质印迹 |
| 多克隆山羊抗足细胞黏蛋白抗体 | R&D Systems | AF15556-SP | 用于蛋白质印迹分析 |
| 链霉亲和素琼脂糖树脂 | 赛默飞世尔科技 | 20347 | 用于免疫沉淀 |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17096303 | 用于免疫沉淀 |
| 多克隆兔抗p57抗体 | SCBT | sc-8298 | 用于免疫组织化学 |
| 小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体，克隆株 AC-74 | Sigma-Aldrich | A2228 | Western blot 上样对照 |
| 兔抗p44/42 | 细胞信号转导 | 4695 | 用于蛋白质印迹分析 |
| Pierce 高灵敏度链霉亲和素-HRP | 赛默飞世尔科技 | 21130 | 用于蛋白质印迹分析 |
| 多克隆小鼠ICAM-2抗体 | R&D Systems | AF774 | 用于蛋白质印迹分析 |
| 多克隆小鼠抗VE-钙黏蛋白 | R&D Systems | AF1002 | 用于蛋白质印迹分析 |
参考文献
- Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin en....
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重印与许可
