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方法文章

肾小球的分离与 体内 肾小球细胞表面蛋白标记

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DOI：

10.3791/58542

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2019年1月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用生物素对小鼠肾小球细胞表面蛋白进行体内标记的实验方案。该方案包含小鼠肾脏灌注、肾小球分离以及目标蛋白内源性免疫沉淀的操作方法。

摘要

蛋白尿是由于肾小球滤过屏障的破坏所致，该屏障由有孔内皮细胞、肾小球基底膜以及具有裂孔隔膜的足细胞构成。肾小球滤过屏障的精细结构，尤其是裂孔隔膜，依赖于多种细胞表面蛋白之间的相互作用。迄今为止，对这些细胞表面蛋白的研究主要局限于 体外 研究或组织学分析。本文中，我们介绍一种小鼠模型 体内 生物素化标记方法，可实现对生理及病理生理条件下肾小球细胞表面蛋白的研究。本实验方案包含小鼠肾脏灌注、肾小球分离以及目标蛋白的内源性免疫沉淀操作步骤。利用该新型方法可便捷地对肾小球细胞表面蛋白丰度进行半定量分析，所有可被生物素灌注标记并进行免疫沉淀的蛋白均可被研究。此外，无论是否进行生物素化标记，肾小球的分离均能够进一步用于肾小球RNA和蛋白质分析，以及原代肾小球细胞培养。即， 原代足细胞培养

引言

蛋白尿是肾小球损伤的标志，通常伴随肾小球滤过屏障的破坏1。肾小球滤过屏障由有孔内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞组成。肾小球滤过屏障的精细分子结构具有高度动态性，在健康和疾病状态下的肾脏中均存在细胞表面蛋白的转运过程2,3,4,5,6。已有研究表明，细胞表面蛋白的内吞作用对足细胞的存活至关重要7。肾病蛋白（nephrin）和足细胞凸蛋白（podocalyxin）是表达于足细胞上的跨膜蛋白。肾病蛋白是肾小球裂孔隔膜的结构主干，而足细胞凸蛋白是一种唾液酸糖蛋白，覆盖在足细胞的次级足突表面8,9,10。既往研究已证实肾病蛋白和足细胞凸蛋白均存在内吞转运过程3,11,12,13,14。

据我们所知，目前文献中尚未描述肾小球内皮细胞中细胞表面蛋白的内吞作用。然而，内皮细胞总体上表达各种类型内吞作用所需的所有必要蛋白即， 网格蛋白依赖性、脂筏依赖性内吞作用15,16因此，可利用该方法通过检测血管内皮（VE）-cadherin和细胞间黏附分子（ICAM-2）在肾小球内皮细胞表面的表达，研究内皮细胞表面蛋白的转运过程。17.

遗憾的是，目前尚无准确的 体外 用于研究细胞表面蛋白质转运的精细三层肾小球滤过模型。该方法的目标是研究肾小球蛋白质的转运过程 体内此外，本方案还包含如何分离肾小球的信息，从而实现对肾小球RNA、蛋白质或细胞的进一步分析。不同的研究团队已报道过类似的肾小球分离技术。18,19.

此前，我们及其他研究者曾采用 离体 通过生物素化标记肾小球细胞表面蛋白2,3,4,20,21然而，在此 离体 方法，分离的肾小球暴露于机械应力下，这可能影响胞吞运输。或者，文献中已广泛采用免疫荧光标记肾小球细胞表面蛋白2,20,22然而，该方法每张载玻片只能分析少量蛋白质，且免疫荧光图像的定量分析通常较为困难。

这种新型的体内方法为准确研究健康与病变肾脏中肾小球细胞表面蛋白的丰度及转运提供了可靠的工具，可作为免疫荧光检测的补充手段。

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方案

小鼠由本地动物饲养设施自行繁育，或从法国Janvier Labs公司获得。研究工作严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（NIH出版物第85-23号，1996年修订版）中规定的指导原则进行。所有动物实验均按照相关机构批准的程序执行（德国州政府LANUV批准编号：AZ:84-02.04.2016.A435）。

1. 仪器、溶液和设备的准备

  1. 配制 1 L 磷酸盐缓冲液，其中添加 1 mM 氯化镁（MgCl₂）2）和 0.1 mM 氯化钙（CaCl2)（外周血干细胞悬液，PBSCM）并通过无菌滤器过滤。
  2. 每只小鼠准备 5 mL 无菌 PBSCM 用于灌注，并置于冰上。
  3. 为每只小鼠准备 5 mL 无菌 PBSCM，其中添加 0.5 mg/mL 生物素。
  4. 为每只小鼠准备 5 mL 无菌 PBSCM，并加入 0.8 x 108 磁珠（例如，200 µL 的 4 x 108 每毫升溶液中的磁珠数量（无需预处理），用于肾小球栓塞。在细胞培养操作台中配制该溶液，以保持磁珠原管的无菌状态。将此溶液置于冰上。
  5. 将甘氨酸加入PBSCM中，配制成终浓度为100 mM的淬灭溶液（每只小鼠5 mL），置于冰上保存。
  6. 配制胶原酶溶液（在无菌PBSCM中加入0.378 U/mL胶原酶A）。每只小鼠取1 mL胶原酶溶液加入2 mL离心管中，置于冰上。
  7. 用于洗涤，取无菌的PBSCM（见步骤1.1）置于50 mL离心管中，并置于冰上。
  8. 灌注时，使用流速为 2.0 mL/min 的注射泵。
  9. 准备一支10 mL注射器，安装21G针头。将针头尖端插入一段20–30 cm长的导管（内径，ID = 0.58 mm）中。将该导管（ID 0.58 mm）连接一段10 cm长的短导管（内径，ID = 0.28 mm），并将较细导管的末端斜向剪切，以便于插入小鼠主动脉。
  10. 手术中进行结扎操作时，每只小鼠准备三段5-7 cm长的丝线（4-0至6-0）。
  11. 手术过程中，准备3把手术钳、2把手术剪、2把镊子、2把精细镊子、1把精细剪刀和棉签。准备麻醉剂（例如， 腹腔注射麻醉剂，剂量为氯胺酮 100 mg/kg 体重和赛拉嗪 5 mg/kg 体重。
  12. 分离两个肾脏的肾小球时，使用一个100 µm细胞筛、两个50 ml离心管和一个磁力捕获装置。
  13. 配制 CHAPS 裂解缓冲液：20 mM 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐（CHAPS）；20 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），pH 7.5；50 mM 氯化钠（NaCl）；50 mM 氟化钠（NaF）；15 mM Na4P2O7；0.1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）pH 8.0；2 mM 正钒酸钠；以及 2 mM 三磷酸腺苷（ATP）。
  14. 将离心机预冷至 4 °C。

2. 显微镜下的手术操作

  1. 麻醉小鼠（例如， 使用氯胺酮/赛拉嗪腹腔注射（见步骤1.11），通过脚趾夹捏试验确认麻醉效果。
  2. 用70%异丙醇对小鼠腹侧进行消毒。
  3. 从骨盆至胸骨沿中线切开皮肤，用镊子将皮肤从腹壁筋膜上剥离。使用手术剪在腹部中段两侧的皮肤上进行剪切。
  4. 更换手术器械。使用手术剪和镊子，从剑突沿中线切至膀胱，穿过腹肌层，并将腹腔分为四个象限。用两把手术钳分别夹住上方两个象限的组织，将其固定于小鼠颈部方向。
    注意：此时腹腔已打开。
  5. 用无菌棉签将内脏器官移开，用精细剪刀剪断肝膈韧带。
  6. 用两把精细镊子在肾动脉近端、肾上腺水平的主动脉处，使用4-0至6-0丝线进行结扎。 用镊子收紧近端主动脉结扎线以阻断血流。
  7. 用精细的手术镊子分离腹主动脉远端的筋膜、脂肪及其他组织，并在肾动脉 cranial 侧的肝/肠系膜动脉处做好结扎准备。
  8. 在肾动脉远端的主动脉处用4-0至6-0丝线进行结扎，并在分叉水平夹闭下腔静脉和主动脉。
  9. 在肾动脉远端的主动脉上剪一个小孔，孔径为主动脉直径的一半。将导管插入主动脉，并用预先准备好的结扎线固定。
    注意：避免灌注系统中产生气泡，以防发生空气栓塞。
  10. 以 2 mL/min 的流速开始用冰冻的 PBSCM 进行灌注。
  11. 用精细手术剪在肾动脉水平处的肾静脉上剪开一个小孔，并收紧肝动脉和肠系膜动脉周围的结扎线。
    注意：开始灌注后，肾脏应变为苍白。

3. 体内 生物素化

  1. 将注射器更换为含0.5 mg/mL生物素的冰冻PBSCM（无气泡），用于表面标记，并以2 mL/min的流速灌注5 mL至肾脏。
    注意：混合PBSCM溶液（例如， 轻轻翻转50 mL离心管以避免溶液中产生气泡。抽吸注射器内溶液后，排出注射器中任何气泡或空气。在注射器上使用额外的套管针（21G），以填充与导管系统相连的套管内的空间。最后，将注射器插入带有导管的套管针中，确保无气泡存在。
  2. 将注射器更换为预冷的含100 mM甘氨酸的冰冻PBSCM，以终止肾小球反应，并以2 mL/min的流速灌注5 mL。
  3. 将注射器更换为无气泡的、含200 μL磁珠/mL的冰冻PBSCM，并以2 mL/min的速度灌注肾脏。
    注意：在肾脏表面，可见被棕色磁珠栓塞的肾小球。

4. 从两个肾脏中分离肾小球

  1. 在肾门处切除肾脏并剥离包膜。将肾脏置于含有15 mL PBSCM的10 cm细胞培养皿中，冰上保存。 肾脏取材后，在麻醉条件下通过颈椎脱位处死小鼠。手术及灌注过程持续约20–22分钟。
  2. 使用新的双刃刀片将肾脏切成尽可能小的碎片。将组织转移至2 mL离心管中，加入1 mL胶原酶A（见步骤1.6），在37 °C下消化30分钟。消化前后均用剪去尖端的1000 μL移液枪头轻轻混匀。
  3. 用冰冷的PBSCM冲洗消化后的组织，通过100 μm细胞筛网过滤。用细胞刮轻轻研磨残余组织使其通过筛网，随后用冰冷的PBSCM冲洗，最终体积达50 mL。
  4. 将细胞悬液在4 °C下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，在旋涡振荡器上用略少于1.5 mL的冰冷PBSCM重悬沉淀。随后，将肾小球悬液转移至新的2 mL离心管中。

5. 洗涤

  1. 使用磁力架将肾小球吸附至管的一侧。等待1分钟，直至肾小球完全移向磁铁一侧。
  2. 当2 mL离心管仍置于磁力架中时，用1000 μL移液器吸除上清液。在第一次和第二次洗涤步骤中（见步骤5.3），管内需保留250 μL上清液，以避免肾小球丢失。此操作应迅速完成，防止肾小管结构沉降至管底。
    注意：否则洗涤过程所需时间将延长。
  3. 将2 mL离心管从磁力架中取出，加入1 mL PBSCM，反复吹打混匀（非常重要），然后涡旋振荡。
  4. 将离心管重新放回磁力架中，并从步骤5.2开始重复操作。
  5. 重复洗涤步骤，直至肾小球纯度达到90%。为此，取代表性上清液样品，在显微镜下（40–100倍）进行观察。
    注意：肾小球呈含有棕色磁珠的圆形结构；细长结构为肾小管碎片；游离的磁珠呈棕色圆形小点；细胞碎片可能表现为块状结构。
  6. 若纯度达标，可通过将肾小球溶解于1 mL PBSCM中估算其数量。混匀后取10 μL样品，在显微镜下计数肾小球数量，并按以下公式计算最终肾小球总数：肾小球总数 = 10 μL样品中肾小球数 × 100。
  7. 成功的肾小球分离可获得10,000–40,000个肾小球。

6. 蛋白质提取与免疫沉淀（IP）

  1. 在 4 °C 条件下以 6800 × g 离心 5 分钟收集肾小球。使用磁力架去除上清液，并将沉淀重悬于预冷的裂解缓冲液中（例如，30,000 个肾小球溶于 300 μL；含 CHAPS，参见步骤 1.11）。使用组织匀浆器在最高速度下匀浆 30 秒，然后在冰上裂解 30 分钟。
  2. 在 4 °C 条件下以 15,000 × g 离心 30 分钟，去除不溶性物质。将含有细胞裂解物的上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，弃去沉淀。
  3. 根据制造商说明书，采用基于二辛可宁酸（BCA）的方法测定上清液的蛋白浓度。成功裂解 30,000 个肾小球通常可获得 700–1,000 µg/mL 的肾小球蛋白量。用裂解缓冲液调整至各组蛋白含量相等。
  4. 取总体积的 10% 作为肾小球裂解物样品，加入 2× Laemmli 缓冲液和二硫苏糖醇（DTT），于 95 °C 孵育 5 分钟。
  5. 进行免疫沉淀（IP）时，将剩余裂解物与链霉亲和素琼脂糖微珠在 4 °C 下于旋转摇床上孵育过夜。
  6. 在 4 °C 条件下以 1000 × g 离心 3 分钟收集琼脂糖微珠，弃去上清液，加入 800 μL 裂解缓冲液以洗去非特异性结合的蛋白质。
  7. 重复洗涤 3 次，并彻底弃去每次的上清液。
  8. 加入 30 μL 2× Laemmli 缓冲液和 DTT，在 95 °C 孵育 5 分钟。
  9. 将裂解物和 IP 样品上样至 10% SDS 凝胶，先以 70 V 电泳 30 分钟，随后以每块凝胶 20 mA 持续 1.5 小时。之后，在硝酸纤维素膜上以 200 mA 转膜 2 小时。
  10. 用含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的洗涤缓冲液在 4 °C 下封闭硝酸纤维素膜过夜。
  11. 在 4 °C 下与目标一抗孵育过夜。在摇床上用洗涤缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后在室温下与 HRP 标记的二抗孵育 1 小时。重复洗涤步骤。
  12. 使用超敏化学发光试剂结合 CCD 相机对膜上的裂解物及免疫沉淀产物进行显影检测。

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结果

为了准确分离肾小球，必须首先用PBSCM灌注小鼠肾脏。PBSCM灌注后，肾脏会变为苍白（图1A）。磁珠栓塞的肾小球在肾脏表面呈现为棕色斑点（图1B）。使用磁力捕获器分离肾小球时，可能会混有肾小管污染（图1C）。在对肾小球进行进一步分析前，需通过更彻底的洗涤使肾小球纯度达到> 95%（图1D）。

体内 生物素化依赖于用生物素标记细胞表面蛋白的能力。为研究这一点，对小鼠肾脏灌注PBSCM或非细胞膜通透性生物素。如图所示 图...

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讨论

所介绍的方法能够成功分离肾小球，用于研究肾小球的RNA或蛋白质。此外，还可利用分离得到的肾小球建立原代肾小球细胞培养。若在肾小球分离前应用生物素标记，则可实现对肾小球细胞表面蛋白的标记。该方法可 体内 可以研究肾小球细胞表面蛋白质的转运，并能够对蛋白质丰度进行半定量分析。成功检测肾小球细胞表面蛋白质丰度的最关键步骤包括：1）熟练掌握小鼠手术操作技术，尤其是主动脉插管；2）注射器连接时需排除气泡，以避免肾小球发生空气栓塞；3）自使用PBSCM开始灌注后，全程操作需在冰上低温条件下进行。

该技术要求操作者具备熟练的小鼠手术经验。主动脉插管尤为关键，因为血管解剖不当会阻碍肾脏的灌注。主动脉切口应足够大（约为血管直径的50%），以留出足够的空间插入导管。若将导管斜向剪切，插入主动脉时会更加顺利。除了精细的解剖操作外，插入的导管应在主动脉内放置到较高位置，以免阻塞肾动脉。否则，肾动脉将无法被生物素和磁珠有效灌注。

生物素是一种小分子维生素，可高亲和力地结合链霉亲和素蛋白。由于其分子量小（244 Da），生物素不会改变偶...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Blanka Duvnjak 提供出色的技术支持。本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，www.dfg.de）资助，项目编号为 M.W. 的 WO1811/2-1 和 I.Q. 的 QU280/3-1。资助方在研究设计、数据收集、数据分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Motic SMZ168 BLMoticSMZ168BL用于小鼠手术的显微镜
KL1500LCD普尔赫和洛伦兹显微镜技术150500小鼠手术用光源
隆朋（赛拉嗪）2%拜耳PZN:01320422麻醉
显微组织剪布劳恩，埃斯库拉普FD100R精细剪刀，用于剪切主动脉
Durotip 精细剪刀Braun，AesculapBC210R用于腹部切口
解剖镊布劳恩，埃斯库拉普BD215R在打开腹腔之前进行手术
PräparierklemmeAesculapBJ008R用于手术 
SeraflexSerag WiessnerIC108000丝线
氯胺酮 10%Medistar麻醉
隆朋（赛拉嗪）2%拜耳麻醉
细孔聚乙烯管，内径 0.28 mm，外径 0.61 mmPortex800/100/100导管
内径0.58 mm、外径0.96 mm的细孔聚乙烯管Portex800/100/200导管
Harvard 仪器 11 Plus哈佛仪器公司70-2209注射泵
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin赛默飞世尔科技21335生物素
Dynabeads 未接触小鼠 T 细胞Invitrogen11413D栓塞肾小球
胶原酶A罗氏10103578001消化肾脏组织
DynaMag-2Invitrogen123.21D磁力捕获器
100µm细胞染色仪Greiner-bio542000用于肾小球分离
Axiovert 40 CFLZeiss暂无以确认肾小球纯度
TissueRuptorQuiagen9002755组织匀浆机
CHAPSSigma-AldrichC3023用于裂解缓冲液
Tris-HClSigma-AldrichT5941用于裂解缓冲液
NaClVWR 化学品27810295用于裂解缓冲液
NaFSigma-Aldrich201154用于裂解缓冲液
EDTASigma-AldrichE5134用于裂解缓冲液
ATPSigma-Aldrich34369-07-8用于裂解缓冲液
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒赛默飞世尔科技23225遵循制造商的说明
nephrin 抗体祖细胞GP-N2用于蛋白质印迹
多克隆山羊抗足细胞黏蛋白抗体R&D SystemsAF15556-SP用于蛋白质印迹分析
链霉亲和素琼脂糖树脂赛默飞世尔科技20347用于免疫沉淀
Protein A Sepharose CL-4BGE Healthcare17096303用于免疫沉淀
多克隆兔抗p57抗体SCBTsc-8298用于免疫组织化学
小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体，克隆株 AC-74Sigma-AldrichA2228Western blot 上样对照
兔抗p44/42细胞信号转导4695用于蛋白质印迹分析
Pierce 高灵敏度链霉亲和素-HRP赛默飞世尔科技21130用于蛋白质印迹分析
多克隆小鼠ICAM-2抗体R&D SystemsAF774用于蛋白质印迹分析
多克隆小鼠抗VE-钙黏蛋白R&D SystemsAF1002用于蛋白质印迹分析

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