本文介绍了一种利用分子信标、转盘共聚焦显微镜和开源分析软件，在活体黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）卵室中对内源性mRNA运输进行可视化、检测、分析与追踪的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
基于荧光的成像技术结合光学显微镜的发展，彻底改变了细胞生物学家开展活细胞成像研究的方式。自从早期研究将特定位置的mRNA定位与基因表达调控联系起来后，RNA检测方法已得到极大扩展。如今，通过能够检测mRNA的技术手段，结合足够快速以捕捉分子动态行为范围的显微镜系统，可以实现对mRNA动态过程的可视化观察。分子信标技术是一种基于杂交的方法，可直接在活细胞中检测内源性转录本。分子信标呈发夹结构，为内部淬灭型单核苷酸识别核酸探针，仅在与特异性靶序列杂交时才会发出荧光。当该技术与先进的荧光显微镜和高分辨率成像系统相结合时，可实现对细胞内mRNA运动的空间和时间追踪。尽管该技术是目前唯一能够检测内源性转录本的方法，但由于在为活细胞成像设计此类探针方面存在困难，细胞生物学家尚未广泛采用这一技术。一种名为 PinMol 的新软件应用程序，可实现更高效且快速地设计最适合在活细胞内有效杂交至mRNA靶区域的探针。此外，高分辨率实时图像采集以及当前开源的图像分析软件，可提供更精确的数据输出，从而更深入地评估mRNA生命周期中所涉及的动态过程的复杂性。
本文介绍了一种针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）卵室设计并递送分子信标的全面实验方案。通过转盘共聚焦显微镜，可直接且高度特异性地检测和可视化内源性母源mRNA。利用Icy软件中的目标检测与追踪功能对成像数据进行处理和分析，从而获得有关mRNA动态运动的详细信息，这些mRNA被运输并定位于卵母细胞内的特定区域。
引言
利用基于荧光的活细胞成像技术，细胞生物学研究得以在空间和时间分辨率上可视化动态事件。目前，体内 mRNA 的可视化主要通过基于RNA适配体-蛋白质相互作用、RNA适配体诱导有机染料荧光以及核酸探针退火的技术实现1,2,3。这些方法均具有高特异性、高灵敏度以及高信噪比。然而，以RNA适配体为核心的方法需要进行广泛的遗传操作，即构建转基因序列以表达含有特定人工结构元件的RNA，这些结构元件是与蛋白质或有机染料结合所必需的。例如，MS2/MCP系统需要共表达两个转基因：一个编码包含多个串联重复序列的RNA结构，该重复序列为噬菌体MS2衣壳蛋白（MCP）的结合位点；另一个则编码与MCP融合的荧光蛋白4,5。在RNA上引入此类二级结构元件，同时结合体积较大的荧光标记蛋白，引发了人们对天然RNA生物学过程可能受到干扰的担忧6。为解决这一问题并提供额外独特优势的技术是基于核酸的方法——分子信标（molecular beacons, MBs）。MBs能够实现内源性mRNA的多重检测、单核苷酸变异的区分以及与靶标mRNA快速的杂交动力学7
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方案
1. 用于活细胞成像的分子信标设计
- 使用 mfold 服务器中的“RNA form”（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）对目标RNA序列进行折叠，以预测mRNA靶标的二级结构。
- 以FASTA格式粘贴或上传目标序列，选择5%或10%的次优性（分别对应折叠自由能位于最小自由能[MFE]值5%或10%范围内的结构），并相应调整计算折叠结构的最大数量（例如，10%次优性时设置更大数值）。
注意：在设计分子信标（MBs）时包含次优二级结构，有助于识别靶标mRNA中可能比仅基于最小自由能（MFE）结构预测结果更灵活或更刚性的区域，从而提升适用于活细胞成像的MBs的整体设计质量。 - 对于长度为800个核苷酸（nt）的mRNA靶标，选择“即时任务”；对于长度在801至8,000 nt之间的mRNA，选择“批量任务”。将“ss-count”文件保存为纯文本文件。
- 以FASTA格式粘贴或上传目标序列，选择5%或10%的次优性（分别对应折叠自由能位于最小自由能[MFE]值5%或10%范围内的结构），并相应调整计算折叠结构的最大数量（例如，10%次优性时设置更大数值）。
- 将步骤1.1中获得的“ss-count”文件作为输入，结合所需参数使用 PinMol 程序（https://bratulab.wordpress.com/software/），为mRNA靶标设计多个分子信标（MBs）（参见 PinMol 程序使用教程
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结果
使用 PinMol，可以针对一个 mRNA 靶标设计多个 MBs（分子信标）图1B- C）。合成与纯化后，通过体外分析对所选分子信标（MBs）进行表征与比较。
图1：活细胞成像内源性mRNA的技术与组织示意图。（A）用于显微注射的中期Drosophila卵室示意图。显微注射针（绿色）注入针对oskar mRNA的分子信标混合物。.......
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讨论
在活体果蝇（Drosophila）卵室中对内源性 mRNA 的运输进行实时可视化，依赖于特定、高效且耐核酸酶的分子信标（MBs），而如今这些分子信标可通过 PinMol 软件轻松设计。分子信标是一种特异性探针，可靶向检测目标 mRNA 中的独特序列（优先选择无二级结构的区域），从而实现对转录本的高分辨率检测。将该技术/方案应用于其他组织或细胞类型时，唯一的限制在于分子信标向目标样本的递送效率。尽管其他方法需要对组织进行遗传改造，使其表达适配体以及与荧光蛋白融合的 RNA 结合蛋白，以实现对单个目标 mRNA 的可视化（例如 MS2/MCP 系统），但最多仅能实现两种转录本的多重检测。相比之下，分子信标技术是唯一能够在活细胞中检测内源性 mRNA 的方法，也是目前唯一允许同时可视化两种以上 mRNA 物种的技术。
MBs 可以用多种荧光基团进行标记，并且在由修饰核苷酸（如 2'-O甲基核糖核苷酸或锁核酸26,31这.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢萨尔瓦多·A·E·马拉斯（新泽西州立罗格斯大学公共卫生研究所中心）在分子信标合成、标记与纯化方面的贡献，以及丹尼尔·圣约翰斯顿（剑桥大学戈登研究所）提供oskar-MS2/MCP-GFP转基因果蝇品系。本研究工作得到了美国国家科学基金会职业奖1149738以及纽约市立大学专业人员委员会资助项目对DPB的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光分光光度计 | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | 光子计数型荧光分光光度计 |
| 石英比色皿 | Fireflysci (原 Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 镊子 | World Precision Instruments | 501985 | 细镊子对于分离单个卵室至关重要 |
| 卤碳油 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| 盖玻片 No.1 22 mm × 40 mm | VWR | 48393-048 | |
| 解剖显微镜 | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 果蝇麻醉垫 | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 转盘共聚焦显微镜 | 配备 Yokogawa CSU 10 转盘的 Leica DMI-4000B 倒置显微镜 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD 相机 | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 显微操作器 | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet 微注射仪 | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| 注射针：Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| 上样吸头：20 μL Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| 显微盖玻片 No. 1 或 1.5，22 mm × 40 mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| 干酵母 | 任意杂货店 | n/a | |
| 计算机，> 20 GB RAM | 尽管大多数计算机均可进行数据处理，但更高配置的设备可显著提升处理速度 |
参考文献
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11
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重印与许可
