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用于分析重组膜蛋白质子周转速率的微型琼脂盐桥电极

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DOI：

10.3791/58552

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2019年1月7日

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Veterinary Medicine

本文内容

摘要

在电生理学测量中，扩散电位的存在会改变电极电位，从而干扰对反转电位的精确测量。通过使用微小的琼脂盐桥，可最大限度地减小扩散电位的影响，从而实现对重组膜蛋白重建后底物周转数的更精确测定。

摘要

迄今为止，超过50%的药理学药物靶向膜蛋白的转运动力学。将膜载体蛋白重构于脂双层膜中并进行电生理表征，是一种强大但精细的方法，可用于评估其物理化学和药理学特性。底物转换数是一个独特参数，可用于比较不同膜蛋白的活性。在生电性转运过程中，被转运底物的梯度会产生膜电位，该电位与蛋白的底物转换速率直接相关。使用氯化银电极时，会引发扩散电位（也称为液接电位），从而改变电极电位，并显著干扰膜电位的精确测量。通过盐桥可将扩散电位最小化，以平衡电极电位。本文设计了一种微琼脂盐桥，以改进使用微移液管形成膜的电生理装置。将盐溶液注入微毛细移液管尖端，并加入琼脂糖进行稳定，可方便地安装至标准电极上。与标准电极相比，微盐桥电极的电极电位更加稳定。该系统的应用可稳定电极电位，从而实现对由pH梯度产生的膜电位进行更精确的测量。利用该系统，重新研究并比较了线粒体载体UCP1和UCP3的质子转换速率与早期测量结果。

引言

目前已知的药物中，多达60%以膜蛋白为靶点1。膜蛋白的电生理测量是一种强大但精细的技术，可用于分析由膜载体蛋白介导的底物生电性转运过程。通过施加恒定电压或电压梯度来调节跨膜电流，可评估载体的药理学和物理特性，例如底物对载体的激活与抑制作用以及转运动力学。其中特别值得关注的是底物转换数（turnover number），它表示单位时间内膜蛋白转运的底物分子数量。该参数在比较不同膜蛋白的动力学特性时具有重要意义。通过在膜两侧建立带电底物的浓度梯度，可产生电动势，进而推导出底物的转换数。

使用AgCl电极时，氯离子自由缓冲液的存在会产生扩散电位，从而改变电极电位，并导致电流-电压测量值发生偏移2。尽管扩散电位始终存在，但在标准电导和电容测量中其影响可忽略不计，因为这些参数要么依赖于电流-电压记录曲线的斜率（电导），要么基于单次记录的差值（电容），从而抵消了电位的影响。然而，由底物转运所产生的反向电位记录可能受到扩散电位的显著干扰。因此，为了精确测量反向电位，必须保持电极电位恒定。

可通过两种方法减小扩散电位：(i) 在存在双层膜的情况下，必须在膜的一侧增加底物浓度3,4，或 (ii) 使用盐桥平衡电极电位5。第一种方法高度依赖于测量的稳定性。膜必须在从搅拌下加入底物到溶液中底物几乎均匀分布的数分钟内保持完整。如果在此期间膜破裂，带电分子将自由交换，改变底物浓度梯度，导致测量结果不准确。后一种方法虽可平衡扩散电位，但受限于装置的尺寸。在微米尺度下将一个微小而有效的盐桥整合到电生理装置中具有挑战性6。对于后一种方法，将盐溶液填充至微毛细管尖端，并通过添加琼脂糖使其稳定，以防止盐溶液向缓冲液中扩散。

本方案描述了一种基于移液管装置7的微小琼脂盐桥的简便制备方法及其在电生理实验体系中的应用。通过调整微毛细管尖端，使其容纳含1 mol%（w/v）琼脂糖的3 M KCl溶液，并连接AgCl电极与缓冲液，从而形成盐桥。通过记录电极电位随时间的变化以及在不同pH梯度下膜电位的更精确测量，展示了微盐桥的优势。在将重组蛋白重建入脂质体的模型系统中，重新研究并比较了在相似条件下制备的线粒体载体UCP1和UCP3的周转速率，并与先前结果进行了对比3,8。

方案

1. 重组解偶联蛋白（UCPs）的制备及平面双层膜的形成

  1. 按照 Rupprecht et al.9 和 Hilse et al.10 描述的方法制备重组 UCP1 和 UCP3
  2. 按照 Beck et al.7 描述的方法在一次性塑料移液器尖端形成平面双层膜

2. 微型琼脂盐桥电极的制备

  1. 调节微毛细管移液枪头（见材料表）至适当长度。
    1. 在空枪头上标记出含缓冲液的枪头将要连接的位置，并使用游标卡尺测量微琼脂盐桥电极的长度。
      注意：微毛细管枪头必须足够长，以确保能够插入测量所用的缓冲液中。
    2. 使用锋利的刀片或刀具切割微毛细管枪头，并用乙醇和水清洁切面。
  2. 制备氯化银（AgCl）涂层电极。
    1. 剪取一段长约8 cm的银丝，并用乙醇和水清洗。
    2. 取一张砂纸，打磨银丝末端约1 cm长度的表面，该部分将与盐溶液接触。
    3. 将打磨后的末端浸入3 M KCl溶液中，使用直流电源在1.5 V条件下电化学氯化10秒。
    4. 用水清洗电极，干燥后从无涂层一侧调整AgCl电极的长度，使其尽可能深入地插入微毛细管枪头中。
      注意：本方案在此处可暂停。
  3. 制备含1% (v/v) 琼脂糖的3 M KCl盐溶液。
    1. 称取4.47 g KCl，加入20 mL水中，在烧瓶中搅拌溶解。
    2. 移除搅拌器，称取0.2 g琼脂糖，加入烧瓶中。
    3. 加热溶液至100 °C，使琼脂糖完全熔化并防止凝结。
      注意：烧瓶会非常烫，切勿徒手触摸。操作时应佩戴手套。
  4. 用琼脂糖盐溶液填充微毛细管枪头。
    ​注意：溶液温度较高，操作时应保护双手，小心避免溅出。
    1. 若琼脂糖开始凝结，需再次加热盐溶液，使琼脂糖完全熔化。
    2. 将10 µL琼脂盐溶液缓慢吸入微毛细管枪头中，操作需轻柔，避免产生气泡。
    3. 将枪头从移液器上取下，从枪头较宽的一侧插入AgCl电极，确保电极插入盐溶液中。
    4. 将电极冷却至室温，并连接至放大器。
  5. 准备用于测量的缓冲液。
    1. 称取0.710 g Na2SO4、0.195 g MES、0.121 g TRIS 和 0.023 g EGTA，加入100 mL蒸馏水至烧杯中，搅拌溶解。
    2. 使用pH电极检测缓冲液的pH值，并调节至7.32。
    3. 检查参比电极与琼脂盐桥电极是否处于电接触状态。
      1. 向塑料容器中加入1 mL缓冲液。
      2. 将参比电极和琼脂盐桥电极浸入缓冲液中，检测信号响应。若信号响应正常，则进行步骤2.7。
  6. 若信号响应异常或完全无电接触，请执行以下故障排查。
    1. 检查电极是否与盐溶液接触，必要时将电极进一步推入溶液中。
      注意：若溶液已过于粘稠，应移除微琼脂盐桥并制备新的微毛细管枪头。
    2. 检查盐溶液中是否存在气泡。若存在，则制备新的微毛细管枪头。
    3. 检查盐溶液是否与缓冲液接触。若未接触，则从枪头管端再切去约1 mm。
      注意：确保枪头仍足够长，能够插入含缓冲液的枪头中。若仍无接触，应制备新的微毛细管枪头。
    4. 若上述措施均无效，则制备新的微毛细管枪头。
  7. 储存时，将琼脂盐桥电极浸入3 M KCl溶液中。
    注意：本方案可在此处停止。若需暂停过夜，请将电极在4 °C条件下储存于3 M KCl盐溶液中。
  8. 制备含缓冲液的塑料枪头。
    注意：若电极已过夜储存，取出后需在室温下平衡30分钟。
    1. 取一微毛细管枪头，使用加热丝在窄端边缘2 cm处将管体弯曲约90度。
    2. 使用非常锋利的刀片或刀具，在弯曲处约5 mm处切断管体。
    3. 用乙醇和水清洁末端表面，并测量枪头孔径，据此计算表面面积。
    4. 用体积比为85:15 (v:v) 的正己烷:十六烷混合液涂覆枪头表面。
      1. 用移液器吸取3 µL溶剂并从枪头中移除。
      2. 等待1分钟，使枪头内残留溶剂完全挥发。
    5. 向测量枪头中加入3 µL缓冲液，并将其连接至盐桥电极上。
      注意：通过执行步骤2.5.3再次检查盐桥电极与参比电极是否处于电接触状态。
    6. 若无电接触，请检查以下情况：
      1. 检查盐桥电极是否与缓冲液接触。若未接触，可增加枪头中缓冲液体积，或制备更长的微毛细管枪头。
      2. 若存在气泡，将枪头从微盐桥电极上取下，重新填充缓冲液后再次连接至电极。

3. 重组蛋白重建膜的电学参数测量

  1. 施加一个三角波交变电压信号，最大电压 Umax = 50 mV，上升时间 ΔTramp = 50 ms，从而产生一个矩形交变电流响应。根据正向电流和负向电流的平均值（I+ 和 I-），按照以下公式计算膜的电容：
    figure-protocol-1
  2. 施加一个从 -50 mV 到 +50 mV 的电压斜坡，并记录电流。对数据拟合一条线性函数——其斜率即为电导——并计算拟合直线在横轴上的截距点。
  3. 排空塑料尖端中的溶液，并用含有较高底物浓度的缓冲液填充新的尖端。
    1. 如果在前 20–30 秒内未形成膜，则排空液体并重新填充。这可确保在膜形成过程中跨膜的浓度梯度不会发生显著变化。
    2. 膜形成后，再次执行步骤 3.1 和 3.2，以验证膜是否正确形成，并获得横轴截距点。

4. 底物转化速率的计算

注意：详见之前的研究工作3,7。

  1. 根据脂质和蛋白质的分子质量（MLipid 和 MProtein）、膜面积与单个脂质头基团的面积（AMembrane 和 ALipid），以及蛋白质与脂质的质量比（r），估算膜中蛋白质的含量。
    figure-protocol-2
  2. 计算被转运底物的能斯特电位。其中 R 为气体常数，T 为温度，z 为被转运底物的电荷数，F 为法拉第常数，c1 和 c2 为膜两侧底物的浓度。
    figure-protocol-3
  3. 从电流-电压记录中，获取在有无底物浓度梯度条件下线性拟合曲线与 x 轴交点之差所计算出的反转电位。
  4. 通过反转电位与能斯特电位的比值，计算底物电导（GSubstrate）占总膜电导（Gtotal）的比例11。
    figure-protocol-4
  5. 根据底物电导（GSubstrate）、施加的电压（U）以及底物电荷数（z），计算单位时间 ΔT 内底物的转运数 ΔNSubstrate：
    figure-protocol-5
  6. 根据单位时间内转运的底物数量与蛋白质分子数的比值，计算 turnover 速率 κ。
    figure-protocol-6

结果

为了验证扩散电位的最小化，测量了完整膜的电流-电压测量稳定性。图2A展示了存在（白色圆点）和不存在（黑色圆点）pH梯度时的代表性电流-电压记录。根据能斯特方程，pH梯度会引起电压偏移。通过数据线性拟合与x轴交点的偏移量可计算出电位变化。为测试两个电极的性能，分别分析了标准AgCl电极（图2B；白色圆点）和微型琼脂盐桥电极（图2B；黑色圆点）的x轴交点偏移情况。连续十次记录电压斜坡，并将x轴交点平均偏移量随时间的变化绘制成图。琼脂盐桥电极在测量300秒后偏移量最大仍小于5 mV，而标准电极则表现出不可预测且随机的变化，偏移量高达30 mV。

接下来，在不同的 pH 梯度下测试了两种电极（图 3A）。对于标准电极，设置了 0.35 和 1.0 的 pH 梯度（白色圆点）；对于琼脂盐桥电极，设置了 0.35、0.7 和 1.0 的 pH 梯度（黑色圆点）。电势变化通过三次独立测量进行分析。与 0.35 的 pH 梯度相比，在无微琼脂盐桥的情况下，当 pH 梯度达到 1.0 时，电压变化显著增大。根据数据的线性拟合，标准电极的函数斜率为 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH，微琼脂盐桥电极为 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH。根据能斯特方程，在 T = 32 °C 时，计算得到的理论电势变化为 60.7 mV/ΔpH。

利用微琼脂盐桥，测量并比较了线粒体UCP1和UCP3的质子周转数κ，并与先前的测量结果进行了对比（图3B）。与图3A类似，构建了ΔpH = 1.0的条件，并测定了反向电位。膜中蛋白质含量根据本方案第4节提供的公式进行估算，其中蛋白质与脂质的比例为4 µg/(mg脂质)，蛋白质和脂质的分子质量分别为33,000和750 Da，膜表面积为3.53 × 10-4 cm2，每个脂质分子所占面积为7.8 × 10-15 cm2。测得UCP1和UCP3的κ值分别为5.56 ± 0.38 s-1和4.10 ± 0.71 s-1（图3B）。

figure-results-1
图 1：带有微琼脂盐桥的电生理装置示意图。 （A）本图展示了该装置的示意图。含有琼脂盐溶液的微毛细管尖端（以橙色表示）置于电极（黑色）与含缓冲液的尖端（蓝色）之间。膜在含缓冲液尖端末端的表面形成（由箭头指示）。（B）本图展示了带有微琼脂盐桥的电生理装置实物图。箭头分别指向电极、微琼脂盐桥、参比电极以及盛有缓冲液的容器。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-2
图 2：微琼脂盐桥与标准 AgCl 电极的比较。（A）该图显示了在存在（灰色点）和不存在（白色点）pH 梯度（梯度为 1）条件下的典型电流-电压测量结果。线条代表对数据的线性拟合，据此获得电导值和横轴截距值。电压偏移通过两次记录的截距值之差来评估。 （B）该图显示了标准 AgCl 电极（白色点）与微琼脂盐桥电极（黑色点）之间膜电位随时间的变化。连续记录了十次电流-电压测量结果，绘制出由扩散电位引起的平均电压偏移随时间的变化曲线。在所有实验中，膜均由 45:45:10 mol% DOPC:DOPE:CL 构成，并掺入 15 mol% 花生四烯酸，浓度为 1.5 mg/mL。缓冲液包含 50 mM Na2SO4、10 mM MES、10 mM TRIS 和 0.6 mM EGTA，pH = 7.34，T = 32 °C。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：根据pH梯度存在下的反向电位计算的UCP1和UCP3的质子周转数。（A）该图显示了含UCP1的膜在不同pH梯度下相对于标准AgCl电极（白色圆点）和微琼脂盐桥电极（黑色圆点）的电位偏移。线条表示对数据的线性拟合。（B）该图显示了根据方案第4节中的公式，通过电压偏移与能斯特电位之比计算出的UCP1（第一组数据）和UCP3（第二组数据）的质子周转数。每组数据的第一根柱状图表示使用微琼脂盐桥电极测得的周转速率，第二根柱状图表示先前使用标准AgCl电极测得的结果。UCP1和UCP3的数值分别取自Urbankovaet al.3 和 Macher et al.8。所有测量中，膜均由45:45:10 mol% DOPC:DOPE:CL组成，并重组了15 mol% AA以及UCP1/UCP3。脂质和蛋白质的浓度分别为1.5 mg/mL和4 µg/mg脂质。缓冲液包含50 mM Na2SO4、10 mM MES、10 mM TRIS和0.6 mM EGTA，pH = 7.34，T = 32 °C。用于梯度测量的缓冲液pH通过添加TRIS提高至7.66、8.00或8.33，并在含溶液的移液管中进行调整。数值为三次独立测量的平均值±标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

采用微琼脂盐桥与电极结合的方式，可最大限度地减小其扩散电位，从而更精确地测量由pH梯度产生的膜电位。在存在不同跨膜pH梯度的情况下，当ΔpH = 0.35时，两种电极的电位偏移均处于可接受范围，与能斯特平衡电位的理论值相比接近（当ΔpH = 0.4时，ΦNernst = 23.8 mV）。然而，在更接近生理条件的pH梯度下，例如线粒体基质与膜间隙之间的pH梯度（ΔpH = 1），标准AgCl电极无法精确测量电位偏移（图3A）。而采用微琼脂盐桥连接的电极所测得的数值则与理论值更为吻合。

如果在实验过程中更换缓冲液，也可能在AgCl参比电极处产生扩散电位。由于有研究提示解偶联蛋白可转运氯离子，因此实验中采用了无氯缓冲液，并使用Tris或MES调节pH值。在氯离子浓度较低的情况下，电极电位主要取决于缓冲液中的氯离子杂质。由于缓冲液成分在实验过程中保持不变，因此只会导致一个恒定的偏移电位。然而，在测量两个电极之间的绝对电位差时，参比电极也可采用简单的琼脂盐桥系统（Ag/AgCl 3 M KCl）。

微琼脂盐桥通过平衡电极电位来抵消扩散电位。为了稳定盐溶液，加入1%（w/v）的琼脂糖以防止盐溶液与缓冲液混合。盐离子K+和Cl-在液体中具有相似的迁移率，从而平衡电极电位。为正确安装盐桥，需将琼脂盐溶液充分加热，以便无气泡地填充微毛细管尖端，并覆盖AgCl电极。在进一步使用前，必须检查盐桥电极与参比电极之间的电接触。根据盐桥使用时间的长短，盐溶液必须充分凝胶化，以防止盐溶液与缓冲液混合。当研究K+或Cl-转运蛋白时，这一点尤为关键。盐桥使用时间很短，在此时间段内琼脂糖的溶出可忽略不计。使用更高浓度的琼脂糖（最高达5%）或琼脂（3%–5%），可延长盐桥的使用时间6,12。

该方法可用于测定（i）周转速率较低的膜转运蛋白，以及（ii）线粒体内膜蛋白的转运动力学，而这些蛋白在标准膜片钳装置中难以进行研究13。该方法的精确性主要依赖于反转电位的测量，当总膜电导较低且浓度梯度较小时，所诱导的膜电位会低于记录噪声水平，从而降低测量的准确性。

利用该装置，测定了在相同条件下产生的UCP1和UCP3的转换速率。由于pH梯度较高，所获得的速率数据更为精确，且未受到微小电极电位漂移所导致的人为假象的干扰。该方法可用于进一步分析和比较在相似条件下产生的线粒体膜转运蛋白。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由奥地利研究基金（E.E.P. 项目编号 P31559-B20）资助。作者感谢 Sarah Bardakji 在小鼠 UCP1 和 UCP3 的制备及其重组为蛋白脂质体过程中提供的出色技术支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
微量移液器吸头Eppendorf5242956.003微毛细移液管吸头
99% 乙醇AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.HAAAH-5020-07025-230317
氯化钾Carl Roth GmbH + Co. Kg6781.3
直流电源VoltcraftV10/CPG 1940 -01
标准琼脂糖Carl Roth GmbH + Co. Kg3810.2
膜片钳放大器Heka
样品管Carl Roth GmbH + Co. Kg5863.1
Na2SO4Carl Roth GmbH + Co. Kg8560.3
MESCarl Roth GmbH + Co. Kg4256.2
TRISCarl Roth GmbH + Co. KgAE15.2
EGTACarl Roth GmbH + Co. Kg3054.1
己烷Sigma-Aldrich296090-100ML
十六烷Sigma-Aldrich296317-100ML
加热丝VoltcraftUSPS-2250

参考文献

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标签

UCP1 UCP3

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