我们介绍一种专门设计的简便方案，用于获得精确且可控浓度的七氟烷或异氟烷 体外 为了增进对肺上皮损伤机制的理解，并测试针对急性呼吸窘迫综合征的新型治疗方法。
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摘要
摘要
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种以弥漫性肺泡损伤、肺泡液体清除功能受损以及严重炎症为特征的综合征。在重症监护病房（ICU）患者中使用卤代麻醉剂（如七氟烷或异氟烷）进行镇静，可改善气体交换，减轻肺泡水肿，并缓解ARDS期间的炎症反应。然而，目前尚缺乏关于在ICU中使用吸入性麻醉剂进行持续镇静以治疗或预防肺损伤的临床数据。为了研究卤代麻醉剂在“生理”条件下对肺泡上皮细胞的影响，我们描述了一种简便的系统，可在气液界面培养细胞，并将其暴露于卤代麻醉剂中，从而精确控制这些药物在“气体”中的比例及其在“培养基”中的浓度。我们设计了一个密封的密闭腔室，将含有人肺泡上皮永生化细胞的培养板置于其中，并通过麻醉机回路提供的持续气流，精确控制七氟烷或异氟烷的吸入浓度。细胞分别暴露于4%七氟烷和1%异氟烷中，持续24小时。采用气体质谱法检测培养基中溶解的卤代麻醉剂浓度。暴露一小时后，培养基中七氟烷和异氟烷的浓度分别为251 mg/L和25 mg/L。两种药物在培养基中的溶解浓度随时间变化的曲线趋势相似，均在暴露后一小时达到平台期。
本方案专门设计用于实现七氟烷或异氟烷的精确且可控的浓度 体外 以增进对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）期间上皮性肺损伤相关机制的理解，并测试该综合征的新型治疗方法。
引言
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种以弥漫性肺泡损伤、肺水肿和低氧性呼吸衰竭为特征的临床综合征。尽管ARDS占重症监护病房（ICU）住院病例的10%以上，并且接近25%的ICU患者需要机械通气，但它仍是临床医生尚未充分认识的挑战，其院内死亡率高达35-45%1尽管进行了大量研究，迄今为止仍未找到有效的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）药物治疗或预防方法。导致ARDS死亡率的两个主要特征之一是肺泡液体清除功能受损（AFC）即， 肺泡水肿液从远端肺气腔重吸收异常）和严重炎症2由于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的死亡率仍然较高，当前的防治策略还应包括一级预防；然而，关键挑战在于识别出那些有高风险发展为ARDS的患者，以及明确哪些患者在预防ARDS后能够获益。
挥发性卤代麻醉剂，如七氟烷和异氟烷，广泛用于手术室中提供全身麻醉。全球每年有超过2.3亿例重大手术患者需要全身麻醉和机械通气3，而术后肺部并发症会对临床结局和医疗资源利用产生不利影响4。在胸外科手术患者中，使用七氟烷替代丙泊酚与减轻肺部炎症以及显著降低急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和术后肺部并发症等不良事件的发生率相关5。类似地，在ARDS实验动物模型中，异氟烷预处理对呼吸力学、氧合和血流动力学具有保护作用6,7。尽管仍需进一步研究以明确吸入性麻醉剂对非心脏手术患者结局的影响，但最近一项荟萃分析发现，与静脉麻醉相比，吸入性麻醉剂与心脏手术患者死亡率显著降低相关8。
目前尚缺乏关于使用挥发性麻醉剂对重症监护室（ICU）患者进行镇静以预防或治疗肺损伤的特异性前瞻性数据。然而，已有若干项试验支持吸入性七氟烷用于ICU患者镇静的有效性和安全性，且临床前研究显示，吸入性七氟烷和异氟烷7,9在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）实验模型中可改善气体交换、减少肺泡水肿并减轻炎症反应。此外，七氟烷可减轻II型肺泡上皮细胞损伤10，而异氟烷则通过调节紧密连接蛋白来维持肺泡-毛细血管屏障的完整性11。然而，仍需进一步研究以验证吸入性七氟烷和异氟烷在实验中所显示的器官保护作用在多大程度上可转化为人类临床效益。我们团队开展的首项单中心随机对照试验（RCT）发现，在ARDS患者中早期使用吸入性七氟烷与氧合改善、部分促炎标志物水平降低以及肺上皮损伤减轻相关，后者通过血浆和肺泡灌洗液中晚期糖基化终产物可溶性受体（sRAGE）水平进行评估12。
综上所述，七氟烷和异氟烷对肺损伤的有益作用可能涉及多个依赖于RAGE通路的生物学途径或功能过程，包括肺泡液清除（AFC）、上皮细胞损伤、核因子（NF）-κB的转位以及巨噬细胞活化。此外，七氟烷可能还影响RAGE蛋白本身的表达。由于我们研究团队及他人的前期研究已证实RAGE在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）期间肺泡炎症及肺上皮损伤/修复中发挥关键作用，因此我们设计了一种实验模型，以深入理解七氟烷在肺损伤与修复中的作用机制，推动其转化医学研究。13,14,15。该 体外 在一种新型的人肺泡上皮原代细胞系 hAELVi（人肺泡上皮慢病毒永生化细胞，具有肺泡上皮 I 型样特性，包括功能性紧密连接）中，研究了七氟烷和异氟烷对肺外周气-血屏障的影响16.
在准备我们设计的过程中 体外 研究（例如， 气液界面培养的肺泡上皮细胞暴露于 "吸入的" 七氟烷或异氟烷，我们从先前已发表的研究中了解到，仅对七氟烷的部分成分进行过评估 "空气" 界面17,18,19 使用标准监测仪（类似于临床环境中所用的监测仪）。卤代麻醉药浓度通常根据最低肺泡有效浓度（MAC）值来选择（例如， 在人类中，七氟烷分别为 0.5、1.1 和 2.2 vol%，代表 0.25、0.5 和 1 MAC；异氟烷分别为 0.6、0.8 和 1.3 vol%，代表 0.25、0.5 和 1 MAC。20事实上，此前从未在培养基本身中检测过七氟烷和异氟烷的浓度，从而限制了以往实验模型/仪器的有效性。此外，大多数实验采用厌氧罐，在将含有七氟烷的气体混合物通入后即行密封。而我们的目标是研究肺泡上皮细胞在 "生理的" 条件，我们认为这种厌氧状态可能并非最佳，且不适合长时间的实验。因此，我们开发了一套自有的系统，用于在气液界面培养细胞，并暴露于卤代麻醉剂（七氟烷和异氟烷），旨在实现精确的控制 "空气" 组分和 "培养基" 这些试剂的浓度。我们认为，此实验步骤在以往文献中尚未见报道，但在进行后续任何操作之前均属必要 体外 七氟烷和异氟烷的研究
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方案
1. 肺泡上皮细胞（hAELVi）的培养
- 解冻
- 用移液器将4 mL预配制的人肺泡上皮细胞（huAEC）培养基加入15 mL塑料离心管中，并将冻存管迅速置于预热的37 °C水浴中解冻。
- 将解冻后的细胞悬液转移至含有4 mL培养基的15 mL塑料离心管中，随后在200 × g条件下离心5分钟。
- 吸除上清液，用5 mL培养基重悬细胞沉淀，然后将细胞转移至T25培养瓶中。
- 在标准条件下（5% CO2、95%湿度的空气、37 °C）培养细胞。
- 传代
- 在显微镜下检查细胞状态。当细胞融合度达到80–90%时，按照步骤1.2.2至1.2.10进行传代。
- 用无菌移液器吸除细胞的培养基。
- 用4 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次，随后吸除DPBS。
- 向细胞中加入1 mL胰蛋白酶/EDTA溶液（TE），于37 °C孵育3分钟，直至细胞开始脱落；在显微镜下观察细胞脱落情况。
- 用2 mL培养基重悬细胞，于200 × g离心5分钟。随后吸除上清液，再用3 mL培养基重悬细胞沉淀。
- 采用台盼蓝染色排除法检测细胞活力。取30 µL细胞悬液，加入30 µL 0.4%台盼蓝溶液于离心管中，然后使用100 µL移液器充分吹打混匀3–5次。取10 µL混合液滴加至血细胞计数板盖玻片下方。
- 在血细胞计数板的计数区域内分别计数活细胞总数和死细胞（蓝色）数量，然后根据以下公式计算细胞活力 [%]：细胞活力 = 100 – (100 / 总细胞数 × 死细胞数)。
- 将重悬后的细胞悬液转移至新的T25细胞培养瓶或6孔板中。向T25培养瓶中加入培养基至总体积为5 mL，或向6孔板的每孔中加入1 mL培养基。
- 将细胞置于培养箱中，在标准条件下（5% CO2、95%湿度的空气、37 °C）进行培养。
- 当细胞完全融合后，即可用于实验。
2. 气密室的制备
注意：气密室的构建方案如图1所示。
- 使用一个容积为 6.5 L 的密闭聚丙烯盒，其长、宽、高分别为 30 × 20 × 15.5 cm。请注意，由于盒体边角为圆弧形，实际容积小于理论容积。
- 在侧壁底部钻一个直径为 2.5 cm 的孔。
- 插入带有绿色标记的波纹管，作为气体-空气混合物的进气管，并用硅胶密封。
- 在对面侧壁的顶部钻第二个直径为 2.5 cm 的孔。
- 插入另一根带有红色标记的波纹管，并连接活性炭过滤器，作为气体-空气混合物的出气管，并用硅胶密封。
- 在箱体中壁的中心位置钻一个直径为 4 mm 的紧密小孔。
- 插入一段短输液管，该输液管连接至带有旋转公鲁尔锁接头的歧管，用于连接气体分析仪，并用硅胶密封。
- 在密闭腔室内放置一个数字温湿度计。
3. 将肺泡上皮细胞暴露于卤代试剂（七氟烷和异氟烷）
注意：该装置的示意图如图2所示。
警告：尽管动物研究未发现对胎儿造成伤害或生育能力受损的证据，且一项针对剖宫产的小规模研究也未显示对母亲或胎儿有任何不良影响，但截至目前，尚无证据证明在分娩过程中使用卤化麻醉剂（例如，七氟烷或异氟烷）的安全性。此外，在人类妊娠期间尚未收集到任何对照数据。因此，强烈不建议孕妇进行涉及七氟烷或异氟烷的实验操作。
- 在实验室通风橱下操作。
- 定制麻醉机管路，将一氧化二氮的气体管路更换为二氧化碳（CO₂）2).
- 将带有绿色标记的波纹管密闭舱插入定制的麻醉机管路中。在麻醉机与密闭舱之间的管道中接入加热加湿器（例如重症监护呼吸机所用类型），以将气体混合物流加热至约37 °C
- 将密闭室安装在加热板上，设置加热板温度为37°C。
- 将含有hAELVI细胞的6孔板放入密闭培养室中，并密封盖子。
- 调节气体流速（即， 空气与CO的混合物2) 以快速获得标准条件，定义为5% CO₂2 和95%湿度的加湿空气。
- 打开卤素麻醉剂蒸发器，选择所需的浓度（本研究中，七氟烷和异氟烷的测试浓度分别为4%和1%）。
- 记录外部气体分析仪测得并显示在屏幕上的混合气体成分以及七氟烷或异氟烷浓度。
- 一旦达到目标值，将新鲜气体流量降至1 L/min。
- 气密室可根据实验需要，以该气体流速维持任意时长。
4. 通过色谱法测定七氟烷或异氟烷
- 样品制备
- 在不同时间点，迅速打开培养室取出待测样品（本研究中使用的是6孔板），并立即盖上盖子，其余样品保持在箱内。随后，使用多通道可调移液器吸取每个样品中的1 mL培养基。
- 将培养基放入10 mL 顶空色谱瓶中，用聚四氟乙烯密封盖紧密旋紧。若不立即使用，应将色谱瓶于 -20 °C 冷冻保存。
- 配制50 g/L的七氟烷甲醇储备液和50 g/L的异氟烷甲醇储备液。同时，配制2 g/L的氯仿（内标，IS）甲醇储备液。所有标准溶液均储存于-20 °C。
- 将七氟烷和异氟烷用超纯水/二甲基亚砜（50/50，v/v）配制成50、500和5000 mg/L的工作溶液。为进行内标校准，甲醇中的工作溶液浓度固定为100 mg/L。
- 细胞样品分析
注意：提取步骤基于 Bourdeaux 之前验证过的气相色谱-质谱分析方法 等1 并采用相同的灵敏度和特异性参数。本方案中使用了七氟烷和氯仿（内标），异氟烷则与多参数分析方法相关联。简言之，在质谱采集方面，该方法在注入纯溶液后建立。随后，通过标准品和文献数据确认 m/z 值。除内标外，每种分析物选择三个 m/z 值：其中一个用于定量（丰度最高者），其丰度通过积分定量峰曲线下面积计算；另两个用于确证。通过使用三个 m/z 值，可对分析物进行特异性鉴定，因所有 m/z 值具有相同的保留时间，且所有 m/z 值的量（离子确证相对量） 与 定量）在纯标准品和所有样品中均相同。采用此采集模式，可对分析物进行特异性良好地鉴定和定量。- 使用浓度范围为0.5-400 mg/L的标准品构建8点校准曲线，并设置多个质控点（0.5、1、5、10、20、75、200和400 mg/L）。
注意：为验证每次校准，使用了四种质控样本：定量下限（C1 = 0.5 mg/L）、两个中间浓度水平（C2 = 20 mg/L 和 C3 = 75 mg/L）以及最高浓度水平（C4 = 400 mg/L；定量上限）。所有标准品和质控样本均在培养的细胞基质中进行分析，以避免基质效应。针对每条校准曲线，均分析了一个空白基质样本，以确认其对培养的细胞成分及内标物无干扰。 - 配制50 g/L的七氟烷甲醇储备液和50 g/L的异氟烷甲醇储备液。同时，配制2 g/L的氯仿（内标，IS）甲醇储备液。所有标准溶液均储存于-20 °C。随后，在超纯水/二甲基亚砜（50/50；v/v）中配制七氟烷/异氟烷混合工作溶液，浓度分别为50、500和5000 mg/L。内标工作溶液用甲醇稀释至100 mg/L。
- 对于标准曲线和对照样本，向1 mL细胞样本基质中加入50 µL内标液（100 mg/L）进行样品制备。
- 在10 mL顶空瓶中加入200 µL饱和氯化钠水溶液制备样品溶液，用聚四氟乙烯密封垫螺旋盖严密封紧。
- 使用浓度范围为0.5-400 mg/L的标准品构建8点校准曲线，并设置多个质控点（0.5、1、5、10、20、75、200和400 mg/L）。
- 气相色谱与质谱联用
- 样品分析时，采用顶空进样结合气相色谱-质谱检测法。
- 将顶空瓶置于加热振荡器中，80 °C 振荡孵育 10 分钟。随后取出并注入 1.5 mL 气体样品至气相色谱仪。色谱运行开始时，设定进样口参数为 260 °C，分流流速 100 mL/min，持续 2 分钟。
- 使用不分流/分流进样器并采用载气模式程序控压。首先，将气体压力保持在40 kPa，持续0.15分钟；然后以125 kPa/min的速率将程序压力升至150 kPa，再以16 kPa/min的速率升至300 kPa，并在300 kPa压力下保持5分钟。
- 进样同时，将进样口温度设为60 °C并保持1 min，随后以20 °C/min的升温速率升至140 °C。然后继续升温至250 °C。总运行时间为7 min。
- 使用熔融石英毛细管柱（30 m × 1.4 µm，0.25 mm ID）进行色谱分离。质谱检测采用单离子监测（SIM）模式，同时监测以下离子：七氟烷在保留时间（RT）2.30 min处，定量离子m/z 181，定性离子m/z 151和51；异氟烷在RT 2.8 min处，定量离子m/z 149，定性离子m/z 115和87；氯仿在RT 3.70 min处，定量离子m/z 83。
- 使用加权二次拟合，根据七氟烷和异氟烷相对于内标物（IS）的峰面积比来确定其在细胞培养物中的浓度。七氟烷和异氟烷的定量下限（LLOQ）为 0.5 mg/L，定量上限（ULOQ）为 400 mg/L。
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结果
随着时间推移溶解在培养基中的七氟烷和异氟烷的浓度分别在表1和表2中列出。
七氟烷和异氟烷在培养基中的浓度随时间变化的趋势相似。在设定所需浓度的卤代麻醉剂后，浓度在最初一小时内逐渐上升。随后达到平台期，并持续至停止给予卤代麻醉剂。停药后一小时内，浓度逐渐下降。图3).
1小时后，培养基中七氟烷和异氟烷的中位浓度分别为251 mg/L和25 mg/L。不同实验之间未发现显著差异。
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讨论
本方案描述了一种简便的方法，可使细胞暴露于精确比例的卤代麻醉剂（如七氟烷或异氟烷）中。此外，我们首次报道了气体比例与培养基内七氟烷和异氟烷浓度之间的严格相关性。这一关键步骤使我们能够安全地利用密闭培养室，研究这些卤代麻醉剂对人肺泡上皮细胞单层培养模型的影响。
目前，大多数研究七氟烷对肺泡细胞作用的研究团队采用先用卤代气体饱和再密封的培养罐。在此情况下，七氟烷可能发生代谢，且可推测挥发性麻醉剂的比例可能随时间呈线性下降，导致气体浓度不稳定。然而，文献中尚未明确报道七氟烷气体分数与其在培养基中浓度之间的相关性。通常，这些实验中所用七氟烷的浓度是基于气体分数与MAC之间的简单关系来确定的。MAC于1965年提出，指在手术刺激（疼痛）下，能够抑制50%受试者产生运动反应的肺部麻醉蒸气浓度。22. MAC 用于比较麻醉药蒸气的强度或效力。在重症监护室（ICU）患者中，MAC 与呼气末七氟烷浓度（FeSevo）及临床 Richmond 躁动-镇静量表（RASS）相关23尽管该参数在日常临床实践中是一...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢奥弗涅大区议会（"奥弗涅大区新研究人员计划" 2013）以及法国国家研究署和医疗服务总局（"健康转化研究计划" ANR-13-PRTS-0010）提供的资助。资助方对本研究的设计、实施和分析，以及本文的撰写均无影响。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 七氟烷 | Baxter | 怀孕期间使用七氟烷或异氟烷进行实验应被强烈反对 | |
| 异氟烷 | Virbac | 怀孕期间使用七氟烷或异氟烷进行实验应被强烈反对 | |
| 人肺泡上皮细胞 | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| 人肺泡上皮细胞培养基（即用型） | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| 麻醉机管路 | Drager | Fabius | |
| 气体分析仪 | Drageer | Vamos Plus | |
| 麻醉气体过滤器 | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| 加热湿化器 | Fisher&Paykel | MR850 | |
| 暴露室 | Curver | 00012-416-00 | |
| 气相色谱-质谱联用仪 | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| 熔融石英毛细管柱（30 m x 1.4 μm, 0.25 mm 内径） | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
参考文献
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