我们介绍一种专门设计的简便方案，用于获得精确且可控浓度的七氟烷或异氟烷 体外 为了增进对肺上皮损伤机制的理解，并测试针对急性呼吸窘迫综合征的新型治疗方法。
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本文内容
摘要
摘要
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种以弥漫性肺泡损伤、肺泡液体清除功能受损以及严重炎症为特征的综合征。在重症监护病房（ICU）患者中使用卤代麻醉剂（如七氟烷或异氟烷）进行镇静，可改善气体交换，减轻肺泡水肿，并缓解ARDS期间的炎症反应。然而，目前尚缺乏关于在ICU中使用吸入性麻醉剂进行持续镇静以治疗或预防肺损伤的临床数据。为了研究卤代麻醉剂在“生理”条件下对肺泡上皮细胞的影响，我们描述了一种简便的系统，可在气液界面培养细胞，并将其暴露于卤代麻醉剂中，从而精确控制这些药物在“气体”中的比例及其在“培养基”中的浓度。我们设计了一个密封的密闭腔室，将含有人肺泡上皮永生化细胞的培养板置于其中，并通过麻醉机回路提供的持续气流，精确控制七氟烷或异氟烷的吸入浓度。细胞分别暴露于4%七氟烷和1%异氟烷中，持续24小时。采用气体质谱法检测培养基中溶解的卤代麻醉剂浓度。暴露一小时后，培养基中七氟烷和异氟烷的浓度分别为251 mg/L和25 mg/L。两种药物在培养基中的溶解浓度随时间变化的曲线趋势相似，均在暴露后一小时达到平台期。
本方案专门设计用于实现七氟烷或异氟烷的精确且可控的浓度 体外 以增进对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）期间上皮性肺损伤相关机制的理解，并测试该综合征的新型治疗方法。
引言
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种以弥漫性肺泡损伤、肺水肿和低氧性呼吸衰竭为特征的临床综合征。尽管ARDS占重症监护病房（ICU）住院病例的10%以上，并且接近25%的ICU患者需要机械通气，但它仍是临床医生尚未充分认识的挑战，其院内死亡率高达35-45%1尽管进行了大量研究，迄今为止仍未找到有效的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）药物治疗或预防方法。导致ARDS死亡率的两个主要特征之一是肺泡液体清除功能受损（AFC）即， 肺泡水肿液从远端肺气腔重吸收异常）和严重炎症2由于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的死亡率仍然较高，当前的防治策略还应包括一级预防；然而，关键挑战在于识别出那些有高风险发展为ARDS的患者，以及明确哪些患者在预防ARDS后能够获益。
挥发性卤代麻醉剂，如七氟烷和异氟烷，广泛用于手术室中提供全身麻醉。全球每年有超过2.3亿例重大手术患者需要全身麻醉和机械通气3，而术后肺部并发症会对临床结局和医疗资源利用产生不利影响4。在胸外科手术患者中，使用七氟烷替代丙泊酚与减轻肺部炎症以及显著降低急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和术后肺部并发症等不良事件的发生率相关5。类似地，在ARDS实验动物模型中，异氟烷预处理对呼吸力学....
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方案
1. 肺泡上皮细胞（hAELVi）的培养
- 解冻
- 用移液器将4 mL预配制的人肺泡上皮细胞（huAEC）培养基加入15 mL塑料离心管中，并将冻存管迅速置于预热的37 °C水浴中解冻。
- 将解冻后的细胞悬液转移至含有4 mL培养基的15 mL塑料离心管中，随后在200 × g条件下离心5分钟。
- 吸除上清液，用5 mL培养基重悬细胞沉淀，然后将细胞转移至T25培养瓶中。
- 在标准条件下（5% CO2、95%湿度的空气、37 °C）培养细胞。
- 传代
- 在显微镜下检查细胞状态。当细胞融合度达到80–90%时，按照步骤1.2.2至1.2.10进行传代。
- 用无菌移液器吸除细胞的培养基。
- 用4 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次，随后吸除DPBS。
- 向细胞中加入1 mL胰蛋白酶/EDTA溶液（TE），于37 °C孵育3分钟，直至细胞开始脱落；在显微镜下观察细胞脱落情况。
- 用2 mL培养基重悬细胞，于200 × g离心5分钟。随后吸除上清液，再用3 mL培养基重悬细胞沉淀。
- 采用台盼蓝染色排除法检测细胞活力。取30 µL细胞悬液，加入30 µL 0.4%台盼蓝溶液于离心管中，然后使用100 µL移液器充分吹打混匀3–5次。取10 ....
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结果
随着时间推移溶解在培养基中的七氟烷和异氟烷的浓度分别在表1和表2中列出。
七氟烷和异氟烷在培养基中的浓度随时间变化的趋势相似。在设定所需浓度的卤代麻醉剂后，浓度在最初一小时内逐渐上升。随后达到平台期，并持续至停止给予卤代麻醉剂。停药后一小时内，浓度逐渐下降。图3).
1小时后，培养基中七氟烷和异氟烷的中位浓度分别为251 mg/L和25 mg/L。不同实验之间未发现显著差异。
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讨论
本方案描述了一种简便的方法，可使细胞暴露于精确比例的卤代麻醉剂（如七氟烷或异氟烷）中。此外，我们首次报道了气体比例与培养基内七氟烷和异氟烷浓度之间的严格相关性。这一关键步骤使我们能够安全地利用密闭培养室，研究这些卤代麻醉剂对人肺泡上皮细胞单层培养模型的影响。
目前，大多数研究七氟烷对肺泡细胞作用的研究团队采用先用卤代气体饱和再密封的培养罐。在此情况下，七氟烷可能发生代谢，且可推测挥发性麻醉剂的比例可能随时间呈线性下降，导致气体浓度不稳定。然而，文献中尚未明确报道七氟烷气体分数与其在培养基中浓度之间的相关性。通常，这些实验中所用七氟烷的浓度是基于气体分数与MAC之间的简单关系来确定的。MAC于1965年提出，指在手术刺激（疼痛）下，能够抑制50%受试者产生运动反应的肺部麻醉蒸气浓度。22. MAC 用于比较麻醉药蒸气的强度或效力。在重症监护室（ICU）患者中，MAC 与呼气末七氟烷浓度（FeSevo）及临床 Richmond 躁动-镇静量表（RASS）相关23尽管该参数在日常临床实践中是一.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢奥弗涅大区议会（"奥弗涅大区新研究人员计划" 2013）以及法国国家研究署和医疗服务总局（"健康转化研究计划" ANR-13-PRTS-0010）提供的资助。资助方对本研究的设计、实施和分析，以及本文的撰写均无影响。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 七氟烷 | Baxter | 怀孕期间使用七氟烷或异氟烷进行实验应被强烈反对 | |
| 异氟烷 | Virbac | 怀孕期间使用七氟烷或异氟烷进行实验应被强烈反对 | |
| 人肺泡上皮细胞 | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| 人肺泡上皮细胞培养基（即用型） | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| 麻醉机管路 | Drager | Fabius | |
| 气体分析仪 | Drageer | Vamos Plus | |
| 麻醉气体过滤器 | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| 加热湿化器 | Fisher&Paykel | MR850 | |
| 暴露室 | Curver | 00012-416-00 | |
| 气相色谱-质谱联用仪 | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| 熔融石英毛细管柱（30 m x 1.4 μm, 0.25 mm 内径） | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
参考文献
- Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D.
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重印与许可
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