需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

成年小鼠脑脊液内直接注射重组腺相关病毒

38.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58565

⸱

2019年2月15日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Hebei Medical University, 2No.2 Middle School of Shijiazhuang, 3Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 4Key Laboratory of Hebei Neurology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种使用含1%盐酸利多卡因的病毒溶液进行直接鞘内注射的技术，以确保腺相关病毒高效递送至小型动物，并建立了一种评分系统，可根据利多卡因引起的短暂性肌力减弱程度来预测中枢神经系统中的转导效率。

摘要

腰椎穿刺（IT）注射腺相关病毒（AAV）因其在中枢神经系统（CNS）中具有安全性高、侵入性小以及优异的转导效率，已在CNS基因治疗领域引起广泛关注。 既往研究已证实，通过IT途径递送AAV介导的基因治疗在神经退行性疾病中具有治疗潜力。然而，由于在小型动物中实施IT给药存在技术局限性，导致失败率较高且难以预测。本文中，我们建立了一种评分系统，通过在注射液中添加1%盐酸利多卡因，用于评估小型动物腰椎穿刺的成功程度。我们进一步证明，注射后出现的短暂性肌力减弱程度可预测AAV的转导效率。因此，该IT注射方法可用于优化影响中枢神经系统广泛区域的CNS疾病小鼠模型中的治疗试验。

引言

腺相关病毒（AAV）可在中枢神经系统（CNS）转导中实现长期且广泛的基因表达，且副作用较少，因此已成为治疗包括肌萎缩侧索硬化症（ALS）、亨廷顿病（HD）、阿尔茨海默病（AD）、溶酶体贮积病（LSD）、戈谢病（GD）和神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL）在内的CNS疾病最有前景的基因治疗载体之一1。目前，已有超过100种AAV血清型从人类和动物中分离获得。其中，至少有12种已用于临床前和临床试验，包括最常用的基因载体如AAV1、2、4、5、6、8、9、rAAVrh.8和rAAVrh.101,2,3,4,5,6。

不同的中枢神经系统（CNS）疾病由于累及的CNS区域和细胞类型不同，需要采用不同的AAV递送策略。AAV能够转导的CNS区域和细胞类型取决于血清型以及递送方式。例如，研究显示，当通过系统性静脉注射（IV）递送时，rAAVrh10主要转导星形胶质细胞；而通过鞘内注射递送时，则可同时转导神经元和胶质细胞4,7。此外，实质内注射导致转导局限于注射部位周围区域，而通过脑室内或鞘内注射将病毒递送至脑脊液（CSF）中则可实现广泛的中枢神经系统转导8。已有研究还证明，通过鞘内（IT）给药递送AAV基因治疗在神经退行性疾病中具有治疗潜力9,10,11。在影响中枢神经系统广泛区域的疾病（如肌萎缩侧索硬化症，ALS）中，与系统性递送方法相比，向脑脊液进行鞘内注射可在较低剂量下覆盖疾病累及的大部分区域4,10。最近的研究还表明，在ALS小鼠模型中可通过腰椎穿刺注射AAV，从而避免椎板切除术和鞘内导管植入可能带来的损伤4。

实验性直接腰椎穿刺最早于1885年用于将药物（尤其是麻醉剂）递送至脊髓，以实现镇痛和麻醉效果12,13。在本报告中，我们介绍了在成年小鼠中借助注射液中添加的1%盐酸利多卡因（一种酰胺类局部麻醉药）进行腰椎穿刺鞘内注射的方法，用于评估和监测注射质量。成功的注射表现为利多卡因诱导的短暂性麻痹，而失败的注射则无此表现。我们将短暂性肌力减弱的程度分为五个等级，以帮助预测注射效率。最后，我们证明rAAVrh10的转导水平可通过麻痹等级进行预测。因此，这种鞘内AAV递送方法可用于增强AAV介导的基因递送，服务于中枢神经系统疾病的实验性治疗。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

FVB/NJ小鼠在河北神经病学重点实验室动物饲养设施中繁育。所有小鼠实验均经河北医科大学第二医院伦理委员会批准，并依照中华人民共和国科学技术部发布的《实验动物管理条例》进行。

1. 20% 盐酸利多卡因储备液的制备

  1. 称取 2 g 盐酸利多卡因，加入 5–6 mL 无菌水，轻轻涡旋混匀，再用无菌水定容至 10 mL。
  2. 1.2 将储备液经 0.2 微米滤膜过滤，按每管 1 mL 分装至 1.5 mL 微量离心管中，用封口膜密封，4 °C 保存。

2. 在清醒小鼠中进行直接鞘内AAV递送

  1. 使用含70%乙醇的无菌纱布擦拭工作区域，并按照表1中所述准备所需物品。
  2. 通过将95 µL的rAAVrh10储存液（5 × 1012 基因组拷贝/mL）加入无菌的200 µL微量离心管中，再加入5 µL的20%盐酸利多卡因储存液，配制100 µL的AAVrh.10/1%盐酸利多卡因复合物。用移液器反复吹打混匀。随后将病毒溶液置于冰上（4 °C）保存。
    注意：每只小鼠使用8 µL4。
  3. 准备用于注射的含AAV溶液的注射器
    1. 装配一支25 µL Hamilton注射器和27 G针头，并将针头斜面与注射器上的体积刻度对齐。
    2. 轻柔地吸取8 µL病毒溶液（含4 × 1010 基因组拷贝）至注射器中，确保去除气泡。
  4. 准备小鼠
    注意：    本研究使用雄性或雌性FVB/NJ小鼠（30–70日龄）。鞘内注射在生物安全柜中进行。
    1. 用70%乙醇对生物安全柜内的工作区域进行消毒。将清醒的小鼠（雄性或雌性，30–70日龄，体重13–20 g）俯卧位放置于生物安全柜内的垫布上。用无菌纱布覆盖其上半身以安抚小鼠并防止被咬伤。
    2. 用一只手的拇指在一侧、食指和中指在另一侧适当且牢固地抓握小鼠骨盆带以固定动物。用拇指和食指绷紧双侧骨盆带之间的皮肤。用手掌轻轻托住动物的上半身。
    3. 剃除双侧骨盆带之间背部的毛发，然后用含碘消毒剂和70%乙醇对皮肤表面进行消毒。
  5. 鞘内注射12
    1. 用另一只手的拇指或食指沿双侧骨盆带之间的中线触摸椎间隙，并用指甲轻压形成凹陷，以标示L5-L6椎间隙（确定注射位点）。
    2. 轻微且轻柔地旋转尾部基部以标示脊柱中线。在注射前（见步骤2.3.1），调整针头斜面朝向动物头部。
    3. 确保动物被牢固固定，并将针头沿脊柱中线对齐。
    4. 轻柔且垂直地（或略微倾斜70–80°）将针头插入凹陷与中线的交点处，并保持注射器处于正中矢状面。当针尖接触骨骼时，缓慢将角度减小至约30°，然后将针头滑入椎间隙。
      注意：明显的突然尾部抽动是成功进入硬膜内的标志。一旦针头进入椎间隙，针尖会感觉被牢固夹住。本研究使用的27 G针头适用于小鼠鞘内给药，但不适用于大鼠。
    5. 注射载体溶液（见步骤2.2）。启动计时器，以1 µL/4 s的速度注射8 µL载体溶液。注射完成后保留针头约1分钟。轻柔旋转拔出针头，以避免液体泄漏。
    6. 给药后立即对小鼠四肢的短暂性肌无力进行评分，以评估注射质量4。
      注意：评分标准如下4：评分0：无肌无力；评分1：后肢轻微无力，无步态异常；评分2：后肢中度无力，有明显步态异常；评分3：后肢完全瘫痪；评分4：后肢完全瘫痪，呼吸急促，前肢中度无力；评分5：四肢完全瘫痪，呼吸明显急促。
    7. 将小鼠放回笼中，使其从瘫痪状态中恢复。
  6. 清理
    1. 用1 mL无菌水冲洗注射器。分类整理实验用品，收集所有非一次性材料进行高压灭菌消毒。用70%乙醇清洁实验台面。

3. 免疫组织化学染色的组织制备

  1. 组织采集
    1. 注射后21天，通过腹腔注射3%水合氯醛（0.1 mL/10 g）对小鼠进行深度麻醉。
    2. 首先用20 mL冰浴的0.01 M PBS（NaCl 147 mM；NaH2PO4 1.9 mM；K2HPO4 8.1 mM，pH 7.4）进行心脏灌流，随后使用泵灌注4%冰浴的多聚甲醛（溶于0.01 M PBS中）（先以10 mL/min流速灌注1分钟，再以5 mL/min流速灌注9分钟）。
      注意：多聚甲醛具有致癌性和毒性，仅可在通风橱内操作，并佩戴手套。
  2. 脊髓和脑组织的解剖
    1. 将每只动物俯卧位固定在泡沫板上，用注射器针头固定四肢和头部，然后用剪刀剥离并去除从头部至骶骨的皮肤。
    2. 在两眼之间剪断颅骨，沿颅骨中线及小脑上方的水平线剪开，将颅骨向两侧打开。
    3. 用镊子提起枕骨，用眼科剪刀沿两侧打开脊髓管，剪除两侧肋骨，并小心移除上半段椎骨。
    4. 用弯头镊子轻轻抬起脑组织，切断颅底神经，小心分离出完整的脑和脊髓组织。将组织在4%多聚甲醛中后固定24小时。
  3. 组织切片制备
    1. 将脑组织及颈段和腰段脊髓在30%蔗糖溶液中4 °C条件下过夜进行冷冻保护。将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并用液氮快速冷冻。
    2. 使用冷冻切片机将组织切成25 µm厚切片，将冷冻切片置于0.01 M PBS中，4 °C保存备用。

4. 免疫组织化学

  1. 将游离切片在1% H2O2中预处理10分钟，然后用PBS洗涤10分钟。在含有5%血清和0.3%非离子型去污剂的PBS封闭液中孵育1小时。
  2. 将切片与相应的一抗在4 °C下孵育过夜。用PBST（含0.2% Tween 20的PBS）洗涤切片30分钟（每次10分钟，共3次）。
  3. 将切片与相应的生物素标记二抗在室温下孵育1小时。用PBST洗涤30分钟（每次10分钟，共3次）。
  4. 将切片与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物在37 °C下孵育40分钟，然后用无色原底物显色。将切片贴附于载玻片上并适当干燥。
  5. 将载玻片依次浸入无水乙醇5分钟和二甲苯10分钟，然后用封片剂封片。最后，使用配备电荷耦合器件（CCD）的显微镜在100倍、200倍和400倍放大倍数下对切片进行成像。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

小鼠在鞘内注射含1%盐酸利多卡因的AAV溶液后，由于鞘内注射质量的差异，表现出不同程度的一过性肢体无力。根据我们建立的半定量5级评分系统，我们检测了不同利多卡因诱导肢体无力程度的小鼠中AAV的转导模式（评分0分，n = 2；评分1分，n = 1；评分4分，n = 4；评分5分，n = 3）。脊髓组织的EGFP免疫染色显示，评分为0分的小鼠腰段脊髓中几乎无或仅有少量转导；评分为1分的小鼠转导略有增强；而评分为4或5分的小鼠则表现出强烈且广泛的转导（图1A）。我们对表现出不同程度一过性肢体无力的小鼠进行了GFP染色强度的定量分析（图1B），并得出结论：注射后肢体无力的严重程度与脊髓转导范围密切相关。

我们进一步研究了rAAVrh10在整个中枢神经系统中的详细转导谱，发现在...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

从技术上讲，在清醒小鼠中进行鞘内注射时有几个关键步骤。首先，操作过程中必须正确抓握并牢固控制小鼠，这是成功给药的前提条件。其次，最具挑战性的环节是用针尖触感辨认椎间隙，此时需避免在无阻力情况下插入过深，或在遇到较大阻力时强行进针，以免损伤动物或导致针尖弯曲。第三，尽管利多卡因引起的短暂性瘫痪可作为评估鞘内注射质量的客观指标，但仍需大量练习才能实现稳定且成功的操作结果。

在本研究中，我们建立了一种在清醒小鼠中进行腺相关病毒（AAV）直接鞘内注射的方法，其中利多卡因作为评估鞘内注射成功程度的指示剂，并可用于预测基因治疗的效率。实验性直接腰椎穿刺最初用于将药物（特别是麻醉剂）递送至脊髓，以实现镇痛和麻醉，该方法已被广泛推荐用于中枢神经系统（CNS）疾病的基因治疗。鉴于在小鼠等小型动物中进行鞘内注射存在技术难度，我们结合了直接腰椎穿刺的两种应用，并选用局部麻醉药利多卡因（临床上已广泛使用利多卡因，通过评估短暂且可逆的麻痹反应来客观判断注射质量）。此外，我们定义了一种通过麻痹程度预测AAV递送效率的标准，并通过免疫染色加以验证。结果表明，在成年小鼠中，注射成功的小鼠其中枢神经系统内的rAAV...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由河北省人力资源和社会保障厅资助项目（CY201605）和河北省自然科学基金项目（H2017206101）资助，我们非常感谢Dr. Guangping Gao为本研究提供了AAV。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FVB/NJ 小鼠Charles River Laboratories China
盐酸利多卡因一水合物HEOWNS73-78-9
AAV马萨诸塞大学医学院基因治疗中心病毒载体核心实验室
25 µL Hamilton 注射器/27-30 G 针头GASTIGHT1702
O.C.T. 包埋剂SAKURA4583
H2O2SHUI HUAN PAI170401
羊血清SolarbioS9070
Triton X-100LIFE SCIENCEST8200
兔抗 GFP 抗体Life techG103621:333 稀释
二抗（山羊抗兔）Jackson Immuno Research111-005-1441:1,000 稀释
VECTASTAIN ABC 试剂Vector LabPK-6100
ImmPACT DAB 过氧化物酶底物试剂盒Vector LabSK-4105
含 DAPI 的荧光封片剂VectorshieldH-1200
NaCl永大化学
NaH2PO4·2H2O永大化学
Na2HPO4·12H2O永大化学
多聚甲醛永大化学307699
粘附性显微镜载玻片CITOGLAS1708325 mm × 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLASElectro Microscopy Sciences72236-6024 mm × 60 mm
15 mL 离心管CORNING430790
96 孔细胞培养板Coster3599
24 孔细胞培养板Coster3524
70% 乙醇文志
纱布维安051711128 cm × 10 cm × 12 cm
1 mL 注射器宏达
微量离心管Plasmed
移液器 eppendorf
移液器吸头Rainin
离心机eppendorf5427R
冰箱海尔BCD-539WT
滤器MILLEX GPR4PA42342
泵LongerPumpBT-100-2J/YZ1515X
显微镜OlympusBX53
冷冻切片机LeicaCM1520

参考文献

  1. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).
  2. Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
  3. Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
  4. Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
  5. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  6. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
  7. Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).
  8. Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
  9. Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
  10. Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
  11. Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
  12. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  13. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
  14. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
  15. Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

AAV
成年小鼠脑脊液内直接注射重组腺相关病毒
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。