一种利用19F NMR波谱法测定脂溶性（logP）的全新简便方法

摘要

开发了一种新型且简便的摇瓶法变体，通过¹⁹F核磁共振波谱法精确测定含氟化合物的脂溶性。

摘要

氟化已成为优化生物活性化合物理化性质的有效工具。引入氟元素的应用之一是调节化合物的脂溶性。在本课题组，我们致力于研究氟化对脂肪族氟代醇和氟代碳水化合物脂溶性的影响。这些化合物不具有紫外活性，导致脂溶性测定具有挑战性。本文介绍了一种通过¹⁹F核磁共振波谱法测定氟代化合物脂溶性的简便方法。该方法无需化合物具有紫外活性，也无需精确称量溶质质量、溶剂及移液体积。利用该方法，我们测定了大量氟代烷醇和碳水化合物的脂溶性。

引言

脂溶性是药物分子的关键理化参数之一，影响药物候选物的多个方面性质，包括药物溶解度、生物利用度和毒性¹。脂溶性通常以化合物在正辛醇与水之间分配后浓度比值的对数（logP）来衡量。基于口服药物的统计数据分析，已提出最佳脂溶性范围，其中最著名的例子是利宾斯基的"五规则”^2,3。事实上，控制脂溶性已被证明对于提高药物候选物的开发前景至关重要。在过去几十年中，通过提高脂溶性来增强药物结合亲和力，已被确认为药物发现项目中的主要问题之一，导致候选药物的淘汰率上升³。因此，有研究建议，在亲和力优化过程中，成功的药物开发与将药物候选物的分子脂溶性保持在最佳范围内密切相关^3,4。为此，一些新概念（如脂溶性效率指数）已被引入^5,6。

因此，在药物研发过程中准确测定脂溶性具有重要意义。此外，随着基础研究致力于寻找logP 调节。目前，已有多种成熟的方法可用于脂溶性的测定¹标准“摇瓶（SF）”方法⁷及其变体常用于测量对数P 直接测定数值，大多数情况下依赖紫外-可见光谱法进行定量。这种经典液-液萃取方法的主要缺点是操作繁琐、劳动强度大。此外，可能会形成乳化现象，尤其对于高亲脂性化合物更为明显^8,9为解决此类问题，已开发出多种方法，例如采用流动注射分析法、透析管等。 等等.⁹,¹⁰然而，这些方法中没有一种是简单直接或易于在非专业实验室中应用的。

还有许多可采用的间接方法，例如电位滴定法¹¹，电泳方法^12,13基于RP-HPLC的色谱方法、基于质谱的方法¹⁴, 等等。这些是间接方法，因为对数P 通过标准曲线获得数值。在这些方法中，反相高效液相色谱法（RP-HPLC）因操作简便、节省时间而被广泛应用。然而，其准确性取决于建立标准曲线所用的训练集，且所估算的脂溶性依赖于所采用的分配体系。^13,15.

文献中已报道了多种基于¹H NMR的亲脂性测定方法。Mo et al. 开发了一种无需氘代溶剂、利用¹H NMR测定logP的方法。水和辛醇作为分配溶剂，被用作各相中溶质浓度定量的参考标准¹⁶。Herth及其同事也报道了一种方法，该方法在NMR核磁管中直接进行分配实验，通过采集1-辛醇萃取前后底部D₂O水相层的NMR数据，获得分配系数¹⁷。此外，Soulsby et al. 将¹H NMR作为分析工具，利用完全还原至幅频表软件的方法测定信号幅值，两相中信号幅值之比即为测得的分配系数¹⁸。这些方法相对简便，但通常需要校准选择性脉冲和功率水平，或使用成形梯度脉冲，以确保适当的溶剂抑制和信号选择性。

化合物的计算logP（clogP）值也可获得，目前存在多种计算方法和商业软件。此类clogP值在制药行业中常用于评估大量药物分子。然而，clogP值存在较大误差的情况并不少见^19,20。

紫外活性要求对浓度分析以及建立用于logP计算的校准曲线造成了限制，阻碍了该领域的研究进展，尤其对于无紫外活性的脂肪族化合物而言更是如此。近年来，含氟脂肪族结构在药物设计中日益受到关注，其对化合物整体脂溶性的影响也是我们课题组的研究方向之一²¹。此外，¹⁹F是一种高度灵敏的核磁共振活性核，使得¹⁹F NMR成为分析含氟化合物的有力工具，且其化学位移范围较¹H更宽。因此，开发一种通过¹⁹F NMR波谱法直接测定无紫外活性含氟化合物logP值的简便方法具有重要意义。本方法的总体目标是实现对含氟化合物脂溶性的便捷测定。

我们的关键原则 ¹⁹基于氟核磁共振的方法是在分配实验中加入一种含氟的参照化合物（图1)²¹化合物X与参比化合物（ref）在水相与有机相之间的分配 n-辛醇。平衡后，从每一相中取出等分试样置于核磁共振管中， ¹⁹在两个核磁共振样品上均进行氟-19核磁共振（¹⁹F NMR）实验。氟信号峰的强度与化合物的浓度（C）及其所含氟原子数目（n）成正比。在化合物X与内标物ref之间，可获得两相中的积分比值。该比值在 n-octanol 层定义为 ρ_八月，和 ρ_aq 水相层（公式 1). ρ值的比值等于分配系数的比值（P化合物X的量及参考文献（eq. 2）。这导出了最终方程（eq. 4) 用于对数P 化合物X的测定。因此，为了确定logP 未知化合物 X 的值，仅积分比（ρ）_八月 和 ρ_aq）在两层中均需通过测量 ¹⁹F NMR

方案

1. 分相

1. 加入4,4,4-三氟丁-1-醇（化合物X，约6.0 mg）和2,2,2-三氟乙醇（参比化合物，约3.0 mg）至10 mL梨形烧瓶中，溶于 n正辛醇（HPLC 级，约 2 mL），加入水（HPLC 级，约 2 mL）。
   注意：本实验设三个重复。化合物在水中的溶解度及 n-octanol 的用量必须进行检查。用于分配的化合物用量需仔细考虑，以避免化合物在任一相中过饱和。还应考虑化合物 X 与参比化合物 ref 之间的质量比，以确保给定 NMR 样品的积分比保持在 10/1 至 1/10 范围内。例如，如果存在差异，则 <2 logP 化合物X与参照物之间的单位数，最佳质量比可确保水相和1-辛醇相NMR样品中的积分比值处于10/1至1/10范围内。相反，若某一相中获得50/1的积分比值，则浓度较低组分的峰积分更可能产生相对较大的误差。以下方程可用于预测最佳化合物质量比：
   m_X / m_参考文献 = {(cP_X / P_参考文献)^-0.5 * (M_X/ M_参考文献) * [(1 + cP_X) / (1 + P_参考文献)]} / (N_X / N_参考文献)
   m，质量；M，分子量；N，氟原子数目；P，分配系数；cP，计算分配系数
2. 将烧瓶置于控温容器中，容器位于搅拌器上方，并连接循环冷却器。在25 °C条件下搅拌两相混合物2小时，搅拌速度设定为600 rpm。
3. 将混合物在25 °C下平衡过夜（约16 h），以确保完全相分离。
   注意：在某些情况下，两相之间会形成泡沫 n-octanol 与水相之间的界面可以观察到。将混合物转移至一个 4 mL 玻璃小瓶中，离心至泡沫完全消失。双相混合物随后在 25 °C 下静置过夜，使其再次达到平衡。

2. 核磁共振样品制备

1. 用夹子将烧瓶固定在铁架台上。
2. 从水和样品中各取约 0.70–0.85 mL 的等分试样 n-octanol 层，使用带长针头的 1 mL 一次性塑料注射器。
   1. 取水样时，先将注射器抽入约0.02 mL空气，再将针头插入混合液中。当针头穿过上层 n将辛醇层推入水层时，轻轻排出空气以防止 n防止辛醇溶液进入针头。
   2. 从混合物中取出长针头。弃去少量水样，使注射器中剩余约 0.6 mL 样品。用干燥的纸巾小心擦拭针头，将约 0.5 mL 水样注入一支洁净的 NMR 管中。迅速用盖子密封 NMR 管。
   3. 对于 n-辛醇样品，取下长针头 n-辛醇层。弃去少量 n-octanol 样品，使注射器中剩余约 0.6 mL 样品。用干燥的纸巾小心擦拭针头，然后注入约 0.5 mL 的 n将-octanol样品转移至一支洁净的核磁管中。迅速用盖帽封闭核磁管。
3. 目视检查两者 n辛醇和水样是否存在任何污染例如，微小的液滴 n水样中的正辛醇或水的小液滴 n-辛醇样品
   注意：若存在任何污染，需从两相混合物重新制备等分试样。由于测量需设置三个重复，因此共获得六支核磁共振管。
4. 向每根核磁共振管中加入0.1 mL可与两者混溶的氘代核磁共振溶剂 n-辛醇和水（例如，丙酮-d₆以在核磁共振采集过程中实现信号锁定。
5. 对于沸点较低的化合物（例如., <120 °C），用喷灯密封核磁管，冷却后将核磁管倒置以检查是否泄漏。将密封或未密封的核磁管小心地倒置20次，以获得均匀的溶液 ¹⁹F NMR 实验

3. 核磁共振实验

1. 运行，采用标准核磁共振参数设置（NS 64，D1 1 s，SW 300 ppm，O1P -100 ppm） ¹⁹F{¹H} NMR 实验用于鉴定4,4,4-三氟丁-1-醇（化合物X）和2,2,2-三氟乙醇（参比化合物）的化学位移 n辛醇和水的核磁共振样品。
2. 使用反转恢复序列测量诊断用氟核的自旋-晶格弛豫时间（T1）²²根据测得的 T1 值确定合适的脉冲延迟时间（D1，设为 ≥ 5*T1），以实现准确的定量核磁共振积分。
   注意：此步骤非常耗时，但水相样品的 D1 设置为 60 秒，辛醇相样品的 D1 设置为 30 秒，属于保守设定，可安全满足 D1 ≥ 5*T1 的标准。
3. 运行 ¹⁹F{¹H} NMR 实验，调整参数设置如下：a) 使用 D1 ≥ 5*T1；b) 将频率偏置点（O1P）置于两个特征性氟信号之间，以实现对两种核的均匀激发；c) 设置谱宽（SW）为 300 ppm，但可根据需要降低以获得更优的信噪比；d) 设置累加次数（NS）为 64，但若需更高信噪比可适当增加。
   注意：非去耦合 ¹⁹F NMR 实验也可用于 NMR 数据采集。然而，需进行质子去耦 ¹⁹F核磁共振实验在此处更受青睐，因为它消除了质子-氟耦合，从而简化了氟信号，同时提高了信噪比。我们采用反向门控去耦技术，以获得不含核Overhauser效应（nOe）增强的去耦谱。²³定量整合时，期望信噪比（≥300）。²⁴

4. 数据处理

1. 使用 ACD/NMR Processor Academic Edition 或其他自定义核磁共振波谱处理软件对获得的数据进行处理。
   1. 打开核磁共振（NMR）数据文件，然后打开 pdata 文件夹，随后是文件夹 1. 删除 1r 文件。
   2. 返回 NMR 数据文件并拖动 fid 将文件导入 ACD/NMR Processor 窗口。
   3. 点击 W函数 按钮，选择 指数，设置 LB值 作为 2，然后单击 好的 按钮。
   4. 点击 零填充 按钮，增加 点计数 其4倍 原始点计数 通过点击数字旁边的小按钮，然后点击 好的 按钮
   5. 点击 傅里叶变换 按钮
   6. 点击 相 按钮，然后单击 小鼠 Ph 按钮，单击并按住鼠标左键，前后移动鼠标，直至光谱的主峰正确相位。
      1. 单击并按住鼠标右键，前后移动鼠标，直至光谱的其他峰达到合适的相位，然后松开鼠标 小鼠 Ph. 按钮，放大至含氟峰的谱图区域，点击 精细调节，根据前述方法进行相位校正（如需要），直至所有峰均正确校正相位，然后单击 蜱 按钮
   7. 单击 基线 按钮，然后 选项 按钮。选择 光谱平均 对于自动模型，如有需要（特别是对于信噪比较低的谱图），调整盒半宽的点数，然后单击 好的 | 自动，然后单击 蜱虫 按钮。
   8. 点击 整合，积分诊断性氟峰，然后单击 蜱 按钮
      注意：如果积分曲线不与基线平行，请单击 偏差校正 按钮，并调节倾斜度和斜率，直至曲线与基线平行。
2. 从以下获取整合比率 n辛醇和水的核磁共振样品制备及其在log P测定中的应用P 计算公式（图1, eq. 4) 以获取对数值P 4,4,4-三氟丁-1-醇（化合物X）的值

结果

作为对照实验的两组数据如图2²¹所示。以2,2,2-三氟乙醇作为参考化合物，测得2-氟乙醇和3,3,3,2,2-五氟丙醇的logP值分别为-0.75和+1.20（图2A）。随后，再次测定2-氟乙醇的脂溶性，但以3,3,3,2,2-五氟丙醇为参考化合物（使用其先前实验测得的logP值+1.20）。测得的logP值为-0.76，与以2,2,2-三氟乙醇为参考测得的结果相比，仅相差0.01个logP单位。

同样，对于cis-2,3-二氟-1,4-丁二醇，使用2-氟乙醇及其trans异构体作为参考化合物所测得的logP值差异也非常小（0.01 logP单...

讨论

本文所述方案是一种用于测定含氟化合物logP值的简便方法。该方法适用于logP值在-3至3范围内的含氟化合物。对于亲水性更强（logP < -3）或脂溶性更强（logP > 3）的化合物，仍可使用此方法，但需要更长的核磁共振（NMR）实验时间，因为需采集更多累加信号以获得良好的信噪比。因此，这是该方法的一个局限性。对NMR谱仪的频率无特定要求，只要满足定量积分所需的条件（NMR参数设置及足够的信噪比）即可。与所有振荡烧瓶法一样，在分层取样过程中必须避免过饱和和污染。

与之前的摇瓶法及其各种变体相比，本方法相对于现有方法具有以下几项优势：1）无需测量溶质质量、分配溶剂体积以及用于核磁共振（NMR）样品的等分试样体积。2）待测化合物可含有杂质，只要杂质的氟化学位移与待测化合物不同即可。3）由于在处理比值的比值时具有内在的补偿效应，系统误差得以消除。4）该方法适用于无紫外活性的含氟化合物。5）该方法易于在开放获取的NMR设备上使用，无需特殊的NMR设置（如溶剂压制、施加小激发角等）。 等等。<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
核磁共振（400 MHz），配备 Bruker 5 mm SEF 探头	Bruker	n/a	AVIIIHD400
核磁共振（400 MHz），配备 Bruker 5 mm SMART 探头	Bruker	n/a
DrySyn Snowstorm 反应器	Asynt	ADS13-S
循环冷却器	Asynt	n/a	型号：Grant-LTC2
磁力搅拌器	Asynt	ADS-HP-NT
ACD/NMR 处理软件	ACD/Labs	n/a	ACD/NMR 处理器学术版或 ACD/Spectrus 处理器 2015