雷诺丁受体N端结构域的晶体结构 Plutella xylostella

摘要

本文中，我们描述了N端结构域的蛋白质表达、纯化、结晶及结构解析的实验方案 小菜蛾兰诺定受体Plutella xylostella).

摘要

靶向昆虫鱼尼丁受体（RyR）的高效杀虫剂的研发在农业害虫防治领域备受关注。迄今为止，已有多种靶向害虫RyR的双酰胺类杀虫剂实现商品化，年销售额达20亿美元。然而，由于缺乏关于昆虫RyR的结构信息，目前对靶向RyR杀虫剂作用机制的理解仍十分有限，这也限制了人们对害虫杀虫剂抗性发展机制的认识。小菜蛾（DBM）是一种严重危害全球十字花科作物的害虫，已被报道对双酰胺类杀虫剂产生抗性。因此，研发靶向小菜蛾RyR的新型杀虫剂具有重要的实际意义，特别是作用于传统双酰胺结合位点以外区域的杀虫剂。本文提供了一种用于结构表征小菜蛾RyR N端结构域的实验方案。该蛋白的X射线晶体结构通过分子置换法在2.84 Å分辨率下解析，显示其具有β-三叶折叠模体及一个侧翼α螺旋。本方案可推广应用于其他结构域或蛋白质的表达、纯化及结构表征。

引言

兰诺定受体（RyRs）是一类特异性的离子通道，介导钙离子（Ca²⁺）穿过肌肉细胞肌质网（SR）膜的通透过程，因此在兴奋-收缩耦联过程中发挥重要作用。在功能状态下，RyR以同源四聚体形式组装，分子质量>2 MDa，每个亚基包含约5000个氨基酸残基。在哺乳动物中存在三种同工型：RyR1—骨骼肌型，RyR2—心肌型，以及RyR3—在不同组织中广泛表达¹。

在昆虫中仅存在一种雷诺丁受体（RyR），其在肌肉和神经组织中均有表达²。昆虫RyR与哺乳动物RyR2更为相似，序列同源性约为47%³。针对鳞翅目和鞘翅目昆虫RyR的双酰胺类杀虫剂已由拜耳（氟苯虫酰胺）、杜邦（氯虫苯甲酰胺）和先正达（氰虫酰胺）等主要公司研发并投入市场。自其相对较近的上市以来，双酰胺类杀虫剂已成为增长最快的杀虫剂类别之一。目前，这三种杀虫剂的年销售额已超过20亿美元，自2009年以来增长率超过50%（Agranova）。

近期研究报道，昆虫在使用这些杀虫剂数代后已产生抗性^4,5,6,....

方案

1. 基因克隆、蛋白表达与纯化

1. PCR扩增目的蛋白对应的DNA（DBM RyR的1-205位氨基酸，Genbank登录号AFW97408），并通过无缝克隆（Ligation-Independent Cloning, LIC）技术将其克隆至pET-28a-HMT载体中²⁵该载体在N端含有一个组氨酸标签、MBP标签和TEV蛋白酶切割位点¹⁵.
   1. 设计具有与LIC兼容的5’延伸的LIC引物，用于扩增目标基因：
      正向LIC引物：
      5’ TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3’
      反向LIC引物：
      5’ TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3’
   2. 将反应组分混合（总体积50 μL）：1 μL DNA模板（100 ng/μL）、1 μL上游引物（10 μM）、1 μL下游引物（10 μM）、0.5 μL DNA聚合酶（NEB）、5 μL 10×反应缓冲液、1 μL dNTP（25 mM）、40.5 μL无RNase的ddH₂O。₂O.
      1. 将反应混合物放入PCR仪中，并运行以下程序。
      2. 95 °C 孵育 3 分钟，然后进行 30 个循环....

结果

纯化

DBM RyR 的 N 端结构域以融合蛋白形式表达，包含六聚组氨酸标签、MBP 标签和 TEV 蛋白酶切割位点。我们采用五步纯化策略，获得高纯度蛋白，适用于结晶。首先，通过 Ni-NTA 柱（HisTrap HP）从细胞裂解液的可溶性组分中纯化该融合蛋白。接着，用 TEV 蛋白酶进行切割，并通过 amylose 树脂柱和 Ni-NTA 柱去除六聚组氨酸-MBP 片段。随后，蛋白经阴离子交换柱（Q Sepharose HP）进一步纯化，最后通过凝胶过滤柱（Superdex 200 26/600）完成纯化。使用 2YT 培养基，每升细菌培养物最终获得的纯化蛋白产量约为 4 mg。纯化后的蛋白在 SDS-PAGE 上显示为单一的约 21 kDa 条带（图 1）。凝胶过滤柱的洗脱体积表明，纯化的 RyR N 端结构域为单体（图 1）。

.......

讨论

本文中，我们描述了重组表达、纯化、结晶并解析DBM RyR NTD结构的实验流程。在结晶过程中，获得高溶解度、高纯度和高均一性的蛋白质是关键要求。在本方案中，我们选用pET-28a-HMT载体，因其含有六组氨酸标签和MBP标签，二者均可用于纯化，从而获得更高纯度的蛋白产物。此外，MBP标签有助于提高目标蛋白的溶解度。我们通过五个连续步骤对蛋白进行纯化，最终获得高纯度且适用于结晶的蛋白样品。结晶初筛采用自动化液体处理系统完成。与传统人工点板方法相比，自动化系统所需样品体积更小，节省时间与人力，并因液体操作精度更高而显著提升实验可重复性。晶体初筛在本实验室进行衍射测试，数据收集则在同步辐射光源处完成，因其提供的X射线具有更高强度和更小发散度，可获得高质量的衍射数据。分子置换法为首选相位确定方法，因数据库中已有相似结构模板可供参考。替代方法为实验相位法，包括MAD、SAD和MIR。 等等。

在解析DBM RyR NTD结构的过程中，Xtriage³⁰计算得到的Matthews系数表明，非对称单位（ASU）最可能包含四个单体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pET-28a-HMT 载体			该修饰型 pET 载体在 N 端含有六组氨酸标签、MBP 融合蛋白以及 TEV 蛋白酶切割位点（Lobo 和 Van Petegem，2009）
E. coli BL21 (DE3) 菌株	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP 柱（5 mL）	GE Healthcare	45-000-325
淀粉糖树脂柱	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose 高性能柱	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon 浓缩器（10 kDa MWCO）	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 凝胶过滤柱	GE Healthcare	28-9893-36
自动化液体处理机器人系统	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 孔 CrystalQuick 板	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
安装式 CryoLoop - 20 微米	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
载晶盘杜瓦瓶装载工具	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
晶体培养箱	Molecular Dimensions	MD5-605
X 射线衍射仪	Rigaku	FRX
PCR 仪	Eppendorf	Nexus GX2
质粒小提试剂盒	Qiagen	27104
凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
SspI 限制性内切酶	NEB	R0132S
T4 DNA 聚合酶	Novagen	2868713
卡那霉素	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-巯基乙醇	Genview	60242
离心机	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
超声波破碎仪	Scientz	II-D
蛋白纯化系统	GE Healthcare	Akta Pure
光学显微镜	Nikon	SMZ745
IzIt 晶体染料	Hampton Research	HR4-710
电泳装置	Bio-Rad	1658005EDU
摇床培养箱	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index 晶体筛选试剂盒	Hampton Research	HR2-144
Structure 晶体筛选试剂盒	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex 晶体筛选试剂盒	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier 晶体筛选试剂盒	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus 晶体筛选试剂盒	Molecular Dimensions	MD1-37