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一种用于新生儿多微生物败血症的受控小鼠模型

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DOI：

10.3791/58574

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2019年1月27日

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1Department of Experimental Medicine, University of British Columbia, 2Department of Pediatrics, Division of Infectious Diseases, University of British Columbia, 3Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Florida, 4Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了建立和评估7日龄小鼠新生儿败血症所需的步骤。

摘要

新生儿败血症仍然是全球性的健康负担。目前亟需一种临床前模型，用于筛选有效的预防或治疗干预措施。通过将盲肠匀浆液经腹腔注射至出生第7天的小鼠体内，并在随后的一周内进行监测，可建立新生儿小鼠多微生物败血症模型。本文详细介绍了实施该新生儿败血症模型所需的具体步骤，包括制备均一的盲肠匀浆原液、将其稀释为根据体重和窝别调整剂量的工作液、监测时间表的安排，以及用于定义人道终点的健康状况分类标准。通过汇集多个供体来源制备均一盲肠匀浆原液，可实现对多窝小鼠的长期给药，减少供体间差异，并避免使用潜在有毒性的甘油。所采用的监测策略有助于预测存活结局，并识别出后续将进展至死亡的小鼠个体，从而更早地确定人道终点。健康评分主要依据两个行为学特征：新生小鼠在仰卧位时能否自行翻正身体，以及其活动能力水平。只要通过预实验验证其准确性，这些标准亦可能适用于其他新生儿小鼠疾病研究中的人道终点判定。总之，该方法为建立新生儿败血症小鼠模型提供了标准化操作流程，同时提供了评估动物福利的资源，有助于为受挑战动物设定早期人道终点。

引言

脓毒症是导致人类新生儿感染性死亡的主要原因1。由于对新生儿脓毒症的认识尚不充分，在疾病早期识别高危新生儿以及开发有效治疗或预防措施方面进展甚微。因此，有必要采用脓毒症动物模型，以更深入地理解该疾病过程并测试可能的干预手段。此外，成年啮齿类动物对脓毒症的反应与新生儿存在显著差异，表现为达到相同致死剂量（LD）所需接种的细菌数量具有统计学上的显著不同，且宿主反应也有所不同2。因此，新生儿脓毒症必须在新生儿个体中进行研究。目前已有多种成年脓毒症模型被用于脓毒症研究，包括通过静脉接种与成人人类脓毒症相关的特定病原体，或采用盲肠结扎穿刺法（CLP）。CLP是一种内源性攻击模型，通过外科手术分离盲肠，将其结扎并穿刺，使肠内容物泄漏至腹膜腔，最终导致微生物及其产物的全身播散3。然而，建立CLP模型所需的手术操作对新生动物具有致死性，因此需要一种替代方法来模拟CLP所引起的多微生物攻击，以诱导新生儿脓毒症。为此，研究人员建立了用于新生儿多微生物脓毒症研究的盲肠浆液模型，即采集动物的盲肠内容物，将其悬浮于无菌的5%葡萄糖水溶液（D5W）中，并通过腹腔注射注入新生小鼠体内2。该模型此后被广泛应用于新生儿及成年动物脓毒症的研究，显著推动了对疾病机制的理解4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。

鉴于该模型的使用日益广泛，且研究人员希望直接比较不同出版物之间的结果，因此有必要在各项研究中对技术细节进行充分描述并实现标准化。标准化涉及模型的三个方面：i）盲肠悬液原液的制备；ii）用于注射实验动物的挑战剂量分装液的制备；iii）人道终点的定义，即在挑战实验中判定动物为非存活者的标准。具体而言，盲肠悬液原液的制备方法通常参考最初提出该模型的原始文献2。该原始模型简述如下：采集成年小鼠的盲肠内容物，将其悬浮于无菌D5W中，浓度为80 mg/mL，并在2小时内用于注射实验动物。该原始模型使用来自同一供应商地点、相同年龄的小鼠，且在采集盲肠内容物前于各自研究机构内饲养时间少于2周。使用本单位繁育的小鼠虽可降低常规供应商供货成本，并允许使用更广泛性别和年龄的多余小鼠，但也显著增加了供体之间的个体差异。这促使了另一种技术的开发，即将多只小鼠的盲肠内容物混合，制备大量原液，随后分装并储存于-80 °C13。该替代方法已被多个研究团队采用14,15。然而，这种改进在储存介质（10%或15%甘油，或仅使用D5W）以及去除颗粒物的过滤策略（通过860 µm滤膜后再经190 µm滤膜的多级过滤，或分别使用100 µm或70 µm滤膜单独过滤）方面产生了某些技术上的差异13,14,15。单独注射甘油可能造成潜在伤害，因为已有研究使用25%-50%甘油注射作为啮齿类动物肾损伤模型16,17,18,19,20。为避免甘油带来的非预期副作用，本研究中小鼠盲肠悬液原液的制备采用不含甘油的D5W进行冷冻保存，并对-80 °C储存条件下的细菌活力进行了检测。本研究所采用的过滤策略为一次性通过70 µm滤膜，该方法尚未与其他所列过滤策略进行直接比较。

注射盲肠浆液的致死剂量（按体重调整）可能因实验设施不同而有所差异，应针对各实验组滴定至所需的致死率。使用不同的攻击剂量时，相应的攻击体积也必然发生变化。然而，这一方法学细节此前尚未见报道。此外，对于腹腔注射等标准操作步骤，文献中很少详细描述，但个体操作技术可能影响新生小鼠注射后是否发生渗漏，并进而影响其最终实验结果。

动物福利，包括人道终点的定义，是该模型以及任何啮齿类动物感染与炎症模型中的核心内容211998年，加拿大动物护理委员会（CCAC）发布了关于人道终点选择的详细指南，将人道终点定义为 "应选择与研究科学目标相容的最早终点，以尽量减少或缓解任何实际或潜在的疼痛、痛苦或不适"22. 其他研究者也提醒，人道终点的设定必须基于科学依据，而不能仅凭对动物状态的主观判断21尽管在临床、行为及基于体征的安乐死终点判断标准方面已有大量资源可供参考，甚至在感染与炎症等特定情况下也是如此21,23,24，这些均不包括CCAC关于人道终点的指南22, 提及新生小鼠。因此，鉴于新生动物行为能力有限，且缺乏体重减轻等常用于成年小鼠的评估指标证据，为其建立客观且科学依据充分的人道终点标准要困难得多。目前，在盲肠浆液文献中，用于5至12日龄新生小鼠的人道终点标准均引用自最初提出该模型的原始论文2在本篇原始论文中，新生动物的人道终点定义基于两个标准：小鼠离开巢穴（散落）以及未观察到乳斑，这两种情况均被发现可在数小时内导致死亡。然而，在确定人道终点时存在一个复杂因素，即在毛色较深的小鼠品系（如常用的C57BL/6J品系）中，出生第一周后乳斑变得难以观察，而患病动物通常需持续监测至出生后第14天（DOL）。此外，应用这些标准时，可在挑战实验后发现已死亡的动物（作者观察；未发表数据）；因此，有必要制定更为严格的人道终点定义，以减轻实验动物的痛苦，并在可更早准确判断结局的情况下避免动物死亡。

盲肠浆液模型的三个方法学方面均在标准操作程序中进行了阐述，包括盲肠浆液储备液的制备、一种可保持不同剂量间注射体积恒定并降低泄漏风险的实验动物注射方法，以及基于行为建模系统的7至12日龄小鼠人道终点定义。通过收集超过240只实验动物的小鼠健康评分行为信息，并按最终存活结果进行分组，建立了基于证据的人道终点定义。通过在最早时间点识别濒死新生小鼠，可减少实验动物的痛苦，同时通过观察关键变量可推断出具有生物学意义的存活结果。盲肠浆液制备过程及新生小鼠行为的可视化展示，将为研究脓毒症或新生动物攻毒模型的任何研究团队提供宝贵的资源。

方案

本方案中的所有实验均已获得不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会（协议编号 A17-0110）的批准。

1. 工具灭菌

  1. 在生物安全柜（BSC）中，打开并预热干热灭菌器至 250 °C，使用前至少预热 30 分钟。
  2. 将器械浸入 70% 乙醇中。
  3. 将器械完全浸入预热的干热灭菌器中，至少 1 分钟。
    注意：若器械手柄在干热灭菌器中停留超过 1.5 分钟，会变热并可能造成烫伤。
  4. 用 70% 乙醇喷洒纸巾垫进行表面灭菌。
  5. 从干热灭菌器中取出器械时，避免已灭菌的器械部分接触其他浸入器械的非无菌手柄，并将器械放置在喷有乙醇的纸巾垫上。
  6. 等待 30 秒至 2 分钟，待器械冷却后再用于解剖操作。

2. 盲肠内容物悬液的制备

  1. 预先称量15 mL离心管（每安乐死五只小鼠使用一个离心管）。
  2. 根据当地动物护理指南对盲肠悬液供体小鼠实施安乐死，或采用以下方案。
    注意：制备盲肠悬液时最多使用40只6至12周龄的C57BL/6J小鼠，每次最多安乐死五只小鼠。
    1. 将小鼠转移至安乐死舱内，并将异氟烷麻醉机设置为5%浓度并辅以氧气灌注。
    2. 观察小鼠是否丧失运动能力，进入外科麻醉深度，并最终停止呼吸。
    3. 从安乐死舱中取出一只小鼠，捏压其足掌，观察是否有腿部回缩或吸气反应。若存在任一反应，则将小鼠放回安乐死舱；否则继续下一步操作。
    4. 通过快速颈椎脱位法对小鼠实施终末安乐死。
  3. 在生物安全柜（BSC）中使用预先灭菌并冷却的器械（见第1节）进行盲肠解剖。
    1. 使用23 G针头将小鼠四肢固定在挤塑聚苯乙烯泡沫板上，使其腹部朝上。固定后，用70%乙醇喷洒腹部。
    2. 使用无菌镊子和剪刀切开皮肤，用剪刀将皮肤与腹膜分离，从腹股沟至胸骨、左侧至右侧剪出一个矩形切口，并清除腹膜上的毛发。
    3. 更换一副新的无菌器械以切开腹膜，切口方式与皮肤相同；若器械接触皮肤，则需立即更换。
    4. 识别盲肠，其应横跨身体从左至右延伸。分离结缔组织以辨认盲肠与肠道的分支，并将盲肠从肠道上剪下。将盲肠置于已灭菌的称量纸上。
      注意：称量纸可通过双面喷洒70%乙醇后晾干，或通过紫外线照射进行灭菌。或者，也可在无菌培养皿上进行盲肠解剖。
  4. 盲肠内容物挤出
    1. 在生物安全柜（BSC）中使用无菌器械切开盲肠两端。
    2. 用无菌镊子夹住盲肠中部，使用平坦的无菌金属刮勺以滚动方式轻轻将内容物从切口端推出，避免刮擦动作以免撕裂上皮组织。收集内容物并放入已预称重的15 mL离心管中。
    3. 最多将五只小鼠的盲肠内容物收集至同一离心管中。添加全部内容物后再次称量离心管。
      注意：每只小鼠平均可获得约300 mg、最多达390 mg的盲肠悬液，每只小鼠需1.8至2.4 mL的D5W溶液重悬；因此，此步骤中使用超过五只小鼠可能导致15 mL离心管过满。
    4. 用经乙醇喷洒的纸巾清洁器械，并重复步骤1.2–1.6进行重新灭菌。
  5. 盲肠悬液过滤
    1. 称量装有盲肠内容物的离心管，通过将盲肠内容物重量除以所需储备液浓度（单位为mg/mL），计算需加入的D5W体积，如下方公式所示。
      计算盲肠内容物浓度所需D5W体积的公式；方程分析。
    2. 在生物安全柜（BSC）中，向含有盲肠内容物的15 mL离心管中加入相应体积的冰冻D5W溶液。
    3. 将15 mL离心管垂直和水平涡旋振荡30秒。检查是否存在直径大于1–3 mm的颗粒，若存在，则继续振荡直至所有大颗粒明显消失。
    4. 将一个无菌70 µm细胞筛置于放置于冰上的50 mL离心管中。用移液器吸取4 mL重悬的盲肠悬液加入细胞筛中，随后流入收集管。通过上下吹打2–3次重悬残留颗粒。在用移液器头搅拌内容物的同时，轻柔挤出气泡以加快过滤速度，直至无液滴继续滤下。
      注意：混合过程中可能出现足以堵塞5 mL移液器的较大颗粒。此时应重复步骤2.5.3的涡旋操作；若溶液仍未分散，可用移液器将颗粒压向离心管壁。
    5. 重复步骤2.5.4，每次更换新的细胞筛，并将所有滤液收集至同一个置于冰上的50 mL离心收集管中；若滤液体积超过冰盒中冰面高度，则可转移至第二个50 mL离心管中。
  6. 分装盲肠悬液。
    1. 如适用，将步骤2.5.5中获得的多个50 mL盲肠悬液滤液管合并至更大的无菌容器中（例如1,000 mL储存瓶）。然后涡旋15秒，并将20 mL转移至一个新的50 mL离心管中。
    2. 将50 mL离心管中的盲肠悬液原液涡旋5–10秒，取500 µL分装至三个带有橡胶密封圈的2 mL冻存管中，以防止长期储存过程中发生蒸发。立即把主原液和分装的冻存管置于冰上。
    3. 重复步骤2.6.1和2.6.2，直至所有盲肠悬液完成分装；每分装三支冻存管后对主原液涡旋一次，以防止颗粒沉降，保持混合均匀。
    4. 将盲肠悬液分装样品在-80 °C下冷冻保存。
      注意：每只成年小鼠预计可获得三至四个500 µL的储备冻存管。每支储备管大致足以用于一组八只小鼠在出生后第7天（DOL 7）的攻毒实验。

3. 7日龄新生小鼠的脓毒症攻击

  1. 分离、识别并称重新生小鼠。
    1. 在生物安全柜中，将新生小鼠转移至新笼子中，使小鼠远离母鼠，以减少对母鼠的应激。
    2. 戴上手套后，取部分垫料并揉搓，使笼子的气味转移到手套上。然后将垫料塑成较小的巢状，并放入不含母鼠的新笼子中。
    3. 将新生小鼠转移至新笼子中的垫料巢内。
    4. 再转移更多垫料，在新笼子中制作第二个空巢。
    5. 关闭并移开母鼠的笼子，使其无法听到任何新生小鼠的 distress 声音，从而避免应激。
    6. 为在一段时间内追踪同窝中每只新生小鼠的个体情况，可使用乙醇不褪色标记笔在尾部正面或背面标记一到五个点，并根据需要每 12–24 小时重新标记一次。
    7. 称量每只需要进行挑战实验的小鼠，称重后将其放入次级巢中，并对所有小鼠重复此操作。
    8. 在制备盲肠悬液挑战分装液之前，将整窝小鼠归还给母鼠。
  2. 通过为每窝小鼠单独完成以下步骤，计算每只小鼠按体重调整的盲肠悬液剂量以及使用 D5W 所需的稀释倍数，可依据下方公式或提供的工作表（见 补充文件）进行计算。
    1. 通过将小鼠体重（单位：克，b）乘以期望的挑战剂量（单位：每克小鼠给予的盲肠悬液毫克数，c），计算每只小鼠需给予的盲肠悬液毫克数（a）。
      乘法公式 a=b×c 方程；用于数学计算和代数研究。
    2. 通过将步骤 3.2.1 中计算出的每只小鼠所需盲肠悬液质量（a）除以盲肠悬液原液浓度（160 mg 盲肠悬液/mL D5W，e），再乘以 1,000 µL/mL（将毫升转换为微升），计算每只小鼠所需未稀释盲肠悬液原液的体积（单位：µL，d）。
      浓度计算公式：d=a÷e×1,000μL 每 mL；与稀释研究相关。
    3. 通过将一窝 n 只小鼠中每只小鼠所需的盲肠悬液原液体积（d）相加，再除以小鼠数量（n），计算每只小鼠平均所需的盲肠悬液原液体积（g）。
      g=sum(di→n)÷n；平均值的统计公式；教育图示；数据分析概念。
    4. 通过将平均注射体积（100 µL）除以每只小鼠平均所需盲肠悬液原液体积（g），计算盲肠悬液原液的平均稀释倍数（h）。
      静力平衡方程，\( h = 100 \mu L \div g \)，用于物理计算中的公式分析。
    5. 通过将每只小鼠所需盲肠悬液原液体积（d）乘以平均稀释倍数（h），计算每只小鼠特定的注射体积（单位：µL，j），然后四舍五入至最接近的 10 的倍数（以匹配注射器 10 µL 的刻度增量）。
      静力平衡方程 j=d×h，符号表示，教育用数学公式。
    6. 通过从平均注射体积（100 µL）中减去平均盲肠悬液原液体积（g），计算稀释盲肠悬液原液所需 D5W 的平均体积（k）。
      体积计算方程，k=100μL−g，静力平衡，公式表示。
    7. 通过将每只小鼠平均所需盲肠悬液原液体积（单位：µL，g）乘以该窝小鼠数量（n），再乘以 1.4（以制备额外量），计算所需盲肠悬液原液总体积（单位：µL，l）。
      静力平衡方程 l=g×n×1.4，适用于机械分析研究。
    8. 通过将稀释所需 D5W 的平均体积（k）乘以小鼠数量（n），再乘以 1.4（以制备额外量），计算稀释盲肠悬液原液所需 D5W 的总体积（单位：µL，m）。
      方程 m=k×n×1.4 公式，数学计算，教育参考。
  3. 在计算出所需盲肠悬液原液体积（l，来自步骤 3.2.7）后，制备挑战分装液。在生物安全柜中，将所需数量的盲肠悬液原液小瓶于室温下解冻，并用移液器吹打混匀。
    1. 当解冻后的盲肠悬液中不再有可见冰晶时，将计算出的盲肠悬液原液体积（l，来自步骤 3.2.7）转移至无菌 1.8 mL 微量离心管中。
    2. 根据步骤 3.2.8 计算出的体积（m），加入冰冻 D5W 进行稀释至所需浓度。将挑战分装液置于冰上保存。
    3. 在装填注射器前，轻弹微量离心管 20 次混匀，随后使用 500 µL 28 G ½ 英寸胰岛素注射器抽吸并排出 300–500 µL 盲肠悬液 3 次，以充分混匀。
    4. 用同一注射器吸取约 150 µL 稀释后的盲肠悬液。
    5. 轻弹注射器，使气泡从活塞处脱离，稍微回拉注射器活塞，然后排出气泡。
    6. 将多余盲肠悬液排回微量离心管中，直至注射器中保留的盲肠悬液体积等于步骤 3.2.5 中为单只小鼠计算出的注射体积（j）。
  4. 根据当地动物护理机构的相关指南，对小鼠进行腹腔注射盲肠悬液，或按照以下步骤操作。
    1. 在生物安全柜中，按照步骤 3.1 所述方法将新生小鼠与母鼠分离。
    2. 用拇指和食指捏住小鼠颈部背部皮肤以固定小鼠。
    3. 将小鼠尾巴固定在中指和无名指背面，或固定在无名指和小指前面。
    4. 为减少泄漏，将新生小鼠倾斜使其头部朝下，针尖斜面朝上，于后腿与生殖器之间进针，保持针头浅层且位于皮下。
    5. 当针头插入约 1 cm 时，向下并向前轻压，感受针头穿透腹膜。缓慢推动活塞，尽可能保持针尖稳定，避免横向移动以免损伤小鼠器官。
    6. 在 5–10 秒内沿原路径小心拔出针头，拔出过程中放松中指，以减少小鼠身体张力。
    7. 注射后将小鼠握持数秒，以便注射部位闭合，并观察注射部位是否有渗漏或隆起；若出现上述情况，则该小鼠不应纳入分析。
      注：注射部位皮肤隆起表明腹腔注射失败，注入物位于皮下。
    8. 将小鼠放在纸巾上，让其迈步。若小鼠 5 秒内无活动，可轻压其尾部。
    9. 拾起小鼠，检查注射部位是否有盲肠悬液渗漏。若有渗漏，应将该小鼠排除在分析之外并实施安乐死。

4. 小鼠监测

  1. 定期监测小鼠，以判断其是否达到人道终点。
    1. 攻毒后 2 小时观察小鼠是否存在与注射相关的并发症。
    2. 攻毒后 12 小时监测小鼠是否出现脓毒症相关病征，并识别达到人道终点的小鼠（判断标准见步骤 4.2–4.3）。
    3. 在最初 2 天内随后每 4–6 小时监测一次，夜间 8 小时除外，此期间新生小鼠无人照看。
    4. 攻毒超过 2 天后，每日监测 1–2 次。若发现生病小鼠或健康评分下降的小鼠，则将监测频率增加至每 4–6 小时一次。
  2. 监测新生小鼠
    1. 对涉及新生小鼠的任何操作，均应如步骤 3.1 所述将垫料转移至新笼（原因同该步骤所述）。仔细检查是否有哺乳期间被拖离巢穴的新生小鼠。哺乳期间被拖离同窝的小鼠不应视为散落小鼠。
    2. 移除巢顶时，识别是否存在远离巢穴或卡在筑巢材料中但脱离同窝同伴的新生小鼠，哺乳期间被拖离同窝者除外。若发现散落小鼠，请参照步骤 4.5 中的人道终点标准进行判断。
  3. 测量小鼠的翻正反射和活动能力。
    1. 将小鼠仰卧置于纸巾上，观察其是否能在最多 4 秒内自行翻正。当小鼠被放置为仰卧时，它会倒向左侧或右侧，此时开始计算 4 秒时间。
      注：要归类为“可翻正（Rights）”组，小鼠必须能在纸巾上用至少三个脚掌支撑身体持续 1 秒。即使翻正后再次倾倒，仍视为具备翻正能力。
      1. 若小鼠能够翻正，则等待 8 秒以确定其活动水平。
      2. 若小鼠能翻正并连续迈出多步探索周围环境，则归类为“可翻正-活动（Rights-Mobile）”。
      3. 若小鼠能翻正并迈出几步探索环境，则归类为“可翻正-迟钝（Rights-Lethargic）”。该组小鼠在迈步时可能倾倒、站立不稳，并在步间暂停。
      4. 若小鼠能翻正但活动较少，则归类为“可翻正-无活动（Rights-Nonmobile）”。此类小鼠可能倾倒，若在 8 秒内未迈出任何步伐，即归为此类。
    2. 若小鼠无法自行翻正，则根据观察到的髋部运动情况对其活动能力进行分类。
      注：避免重复测试或延长小鼠仰卧时间，因为这可能影响评分系统和人道终点判断；某些在 4 秒内未能翻正的小鼠若给予更长时间可能成功翻正，但仍应按失败处理。
      1. 若小鼠无法翻正且髋部运动幅度超过水平方向 90° 角，则归类为“无法翻正（FTR）-活动”。部分小鼠若给予超过 4 秒时间可能翻正，但仍应归为 FTR，其活动评分依据髋部运动情况。
      2. 若小鼠无法翻正且髋部运动幅度低于水平方向 90° 角，则归类为“FTR-迟钝”。
      3. 若小鼠无法翻正且腿部出现颤抖或震动但无髋部运动，则归类为“FTR-无活动”。其肢体可能伸展或收缩，但无侧向运动。此类小鼠明显病重，已达到人道终点。
  4. 在小鼠另一侧重复步骤 4.3，记录两侧结果。
    注：观察记录方法详见补充文件。
  5. 根据表 1及以下说明，判断小鼠是否达到人道终点并需要实施安乐死。
    1. 根据步骤 4.3 和 4.4 的监测记录，将小鼠分类至不同的翻正与活动等级。每侧均测量小鼠活动能力，以其活动行为判断是否需要实施安乐死。
    2. 将翻正反射为（a）FTR-无活动或（b）FTR-迟钝且脱离巢穴的小鼠判定为达到人道终点。
    3. 在攻毒后 20 小时以上的监测时间点，若小鼠两侧翻正反射均为“无法翻正”，则判定其达到人道终点，因为已有数据高度准确地预测此类小鼠最终将死于疾病且无法恢复。
  6. 将根据步骤 4.5 判定需实施安乐死的小鼠分离出来。若监测的小鼠未达到人道终点，则将其放入新笼中无母鼠的第二个空巢内，并继续处理其他新生小鼠。
  7. 待整窝小鼠均完成监测后，将一半筑巢材料移入有母鼠的笼中，在中间留出空间重新构筑巢穴。
    注：巢穴构筑不当可能导致小鼠散落，并减少母鼠可提供的照护。
  8. 将新生小鼠转移回有母鼠的笼中。
  9. 用剩余的筑巢材料覆盖整窝小鼠，并轻轻捏紧盖子周围以固定筑巢材料，将小鼠封闭在巢内。
  10. 根据当地机构要求，对在步骤 4.6 中分离出的新生小鼠实施安乐死。

5. 盲肠悬液的滴定

  1. 以所需的攻毒剂量（第3节）对小鼠进行攻毒，并监测结果（第4节）。
  2. 观察最终结果是否达到预期的致死剂量（LD），若未达到，则使用新的一窝小鼠，在更高或更低的攻毒剂量下重复第3和第4节操作，剂量调整幅度为5%-10%。
    注意：攻毒剂量可能与图1B相似，但需在每个实验设施和小鼠品系中进行滴定确定。
  3. 同时观察小鼠是否比图1B中预期的动力学更快或更慢地达到人道终点，若是，则使用新的一窝小鼠，在更高或更低的攻毒剂量下重复第3和第4节操作，剂量调整幅度为5%-10%。

结果

通过连续稀释法将保存于 -80 °C 的盲肠匀浆样品在 5% 绵羊血胰蛋白酶大豆琼脂培养基上进行系列稀释并涂布等分试样，随后于 37 °C 有氧条件下培养 24 小时，可随时间推移检测盲肠匀浆的活性。结果发现，盲肠匀浆制备物中可培养的菌落形成单位（CFU）含量在 6 个月期间未发生改变，且长期保存于 -80 °C 并未影响其活性（图 2）。每只供体小鼠平均可提供足以为 3 至 4 窝幼鼠进行攻毒实验的盲肠匀浆量（数据未显示）。

在出生后第7天（DOL 7）通过盲肠浆液攻击以诱导多微生物脓毒症的小鼠，在攻击后12小时内开始达到人道终点，多微生物脓毒症大多在攻击后48小时内得到解决，这一结果来自对超过200只受攻击小鼠数据合并绘制的Kaplan-Meier生存曲线（图1A）。死亡率依赖于给予的攻击剂量，攻击剂量变化5%即可导致生存率约15%的差异（图1B）。每次监测时均测量小鼠体重。所有受攻击动物均出现体重下降，在攻击后最初24小时内，最终存活与未存活的小鼠之间体重下降程度无明显区分（图1C）。24小时后，大多数存活动物开始恢复体重，而所有未存活动物则持续体重下降并达到人道终点。然而，仍有少数最终存活且保留翻正反射的小鼠也持续体重下降或未能恢复体重，直至实验结束，甚至在攻击后40小时内体重减少高达初始体重的20%。由于最终存活与未存活小鼠之间的体重下降存在重叠，因此体重变化或体重下降阈值无法作为人道终点的判断标准，否则将影响准确区分存活与非存活个体的研究目标。

小鼠的行为监测按照方案和表2中所述进行。健康状况分类的快照如图所示（图3A-C）。这些照片展示了当小鼠被置于仰卧位后无法自行翻正时的不同健康状态，并阐明了FTR-可移动（FTR-Mobile）与FTR-迟钝（FTR-Lethargic）之间的区别，这一区别至关重要。未经干预的同龄健康小鼠不会表现出FTR-迟钝行为；因此，该健康类别是疾病存在及对刺激产生反应的标志。患病小鼠表现出FTR-迟钝症状（图3B），并可能进一步恶化为FTR-不可移动（FTR-Nonmobile）状态（图3C），此时其上肢腿保持与下肢腿平行，髋部 rocking 动作极少或完全消失，这是人道终点判定标准之一。小鼠也可能恢复，髋部活动增加，转变为FTR-可移动状态（图3A）。每只小鼠左右两侧的翻正反射和活动能力评分均被记录，并采用较高分值来判断该小鼠是否已达到人道终点。行为数据来自超过240只接受致死剂量60（LD60）盲肠浆液攻击的小鼠，共观察到144个人道终点事件（图3D-F及表1）。该基于证据的方法被用于在四个疾病阶段中定义并优化人道终点，实验人员根据存活与非存活个体之间的行为差异以及各时间段内达到人道终点的比例对阶段进行分类。在早期实验中，观察到无髋部活动的FTR-不可移动小鼠通常在出现该行为后的4–6小时内死亡。在本研究数据收集中，FTR-不可移动的健康评分被作为人道终点的判定标准。在攻毒后12–21小时期间，尽管FTR-不可移动小鼠被实施安乐死，但存活与非存活动物表现出极为相似的行为模式，无法通过其他方式区分（图3D）。在攻毒后21–48小时期间，大多数存活小鼠恢复了翻正反射，而所观察到的FTR行为中，仅有不到1%出现在最终存活的小鼠中（图3E）。因此，在此时间段内，无法从任一侧自行翻正的小鼠被额外纳入人道终点的判定标准。在攻毒后12至20小时期间，观察到总人道终点数量的12.5%，而在20至48小时期间为80.5%，48小时之后为7%（表1）。最终存活与最终恶化至人道终点的小鼠之间的一个显著区别是翻正反射的丧失，且该现象独立于髋部活动能力（图3F）。事实上，在攻毒后20至48小时期间，共有121只小鼠无法从两侧自行翻正，其中116只最终进展至人道终点（识别无法恢复小鼠的准确率达96%）。攻毒48小时后，共观察到11只小鼠无法从两侧翻正，其中10只进展至人道终点（准确率为91%）。攻毒20小时后，无法从两侧恢复翻正反射的小鼠数量可预测最终结局，准确率超过90%；因此，该指标已被加入人道终点判定标准，以更早识别无法恢复的小鼠，减少其痛苦（表1）。

由于攻毒后小鼠死亡率随时间变化，其监测频率也相应改变，具体如表1所示。若小鼠出现无法自行翻身、双侧髋部无活动能力，或被发现脱离巢穴、无法翻身且髋部活动迟缓，则被视为达到人道终点。具有上述任一状况的小鼠均无法重新融入仔鼠群体，并通常在4–6小时内被观察到为FTR-非活动状态。自攻毒后20小时起，新增一项人道终点标准，因为现有数据显示，双侧均出现FTR的小鼠绝大多数最终会因疾病死亡。

本文提供的视频、表格和资源是正确判定实验小鼠行为的有效教学工具。七名实验人员在对60只经处理的小鼠进行行为判定之前，被要求观看培训视频并阅读实验方案及表格内容。在区分FTR-非活动小鼠与其他表现出不同行为的小鼠方面（图4A），以及区分FTR小鼠与在规定时间范围内能够自行翻身的小鼠方面（图4B），人道终点判定的准确性均较高。

生存分析和体重变化图；Kaplan-Meier 曲线、攻毒后时间、生存概率
图 1：Kaplan-Meier 生存曲线、盲肠匀浆剂量滴定以及盲肠匀浆攻毒后的体重变化。（A）在出生第7天（DOL 7）通过腹腔注射不同剂量盲肠匀浆对新生C57BL/6J小鼠进行攻毒后的生存结果。本图数据来自多个独立实验，合并了不同攻毒剂量的结果，剂量范围为每克体重0.7至1.3 mg盲肠匀浆。（B）使用同一批制备的盲肠匀浆，以每克体重0.80至0.95 mg剂量攻毒的新生小鼠，其生存率与给予的盲肠匀浆量之间呈现剂量依赖性关系。（C）与攻毒时体重相比的体重变化百分比，虚线表示自攻毒时起体重下降20%。 请点击此处查看该图的放大版本。

散点图显示年龄与每毫升对数浓度菌落形成单位（CFU）的关系，含回归线；R²=-0.02374，p=0.523。
图2：在-80 °C保存的盲肠匀浆储备液中，菌落形成单位（CFU）浓度在6个月内未发生改变。 采用线性回归分析盲肠匀浆保存时间对CFU浓度的影响。每个数据点代表同一批次盲肠匀浆样品在6个月期间内连续稀释并涂布培养所得的一个分装样本。请点击此处查看该图的放大版本。

显示挑战后生存结果的图表以及行为分析结果的小鼠行为研究。
图3：无法自主翻正的小鼠髋关节活动能力分类及其在不同时间点挑战后的动物行为。 接受脓毒症挑战的小鼠在被置于仰卧位时，会表现出可通过髋部活动程度来衡量的病态体征。(A) 无法翻正-活动型（FTR- Mobile）小鼠表现出上肢髋部摇摆运动，其与水平方向夹角超过90°。(B) 无法翻正-迟钝型（FTR-Lethargic）小鼠虽有髋部摇摆运动，但在持续4秒的监测期间，任何时刻均未超过水平方向90°夹角。(C) 部分无法翻正-不活动型（FTR-Nonmobile）小鼠会伸展腿部并在膝关节处弯曲，但髋部摇摆运动极轻微（小于10°）或完全无活动，且两后肢保持相互平行。(D) 挑战后12–21小时的动物行为显示，仅FTR-Nonmobile行为可有效区分存活者与非存活者。(E) 挑战后21至48小时期间，所观察的592例FTR行为中仅有4例（0.67%）出现在存活小鼠中，表明翻正反射可用于预测最终结局，并可作为人道终点的新判定标准。(F) 感染48小时后，131只曾具有翻正反射的小鼠中有6只（4.55%）最终进入FTR组，并在实验结束时被实施安乐死，因此有必要在整个恢复过程中持续监测。 请点击此处查看该图的放大版本。

幼鼠翻正反射的分类；实验者判断真阳性/假阳性/真阴性/假阴性的柱状图。
图 4：教学资源使独立实验者能够准确进行行为学分类。通过观看本实验方案配套视频接受培训的实验者，对60只新生小鼠视频的行为表现进行了健康状况分类。（A）评估实验者区分人道终点的能力，结果显示平均97%的行为被准确归类为“无法翻正（FTR-Nonmobile）”或非该状态，仅1%的FTR-Nonmobile小鼠被误判为非该状态，另有2%的小鼠被错误地判定为FTR-Nonmobile。（B）对于第二个人道终点标准——即准确区分无法在仰卧后4秒内完成翻正的小鼠（FTR）与具备该能力的小鼠——在97%的评分中被正确识别，仅0.96%的小鼠被错误判断为能够翻正，2%的小鼠被错误归类为FTR。请点击此处查看该图的放大版本。

疾病阶段A：高发病率，无死亡率B：高发病率，低死亡率C：高发病率，高死亡率D：低发病率，低死亡率
攻毒后小时数0−1212−2020−48>48
监测频率攻毒后2小时每4−6小时一次每4−6小时一次，8小时一次，夜间无人值守每日1−2次，必要时增加
观察到的总人道终点比例0/14418/144116/14410/144
观察到的人道终点百分比0%12.5%80.5%7%
人道终点标准1. FTR−两侧均无法移动1. FTR−两侧均无法移动
2. 离开巢穴且表现为FTR−嗜睡2. 离开巢穴且表现为FTR−嗜睡
3. 左侧或右侧出现FTR（任何活动评分）

表1：疾病不同阶段的监测频率和人道终点标准。 疾病不同阶段的监测频率、观察到的人道终点、人道终点所占百分比及人道终点判定标准。

翻正反射活动能力放置于背部后完成翻正的时间限制评估活动量的时间限制（活跃 / 萎靡 / 无活动）活动能力评分标准
能够翻正活跃4 s额外8 s小鼠连续迈出多个步伐，保持向前运动趋势，并探索周围环境。幼鼠不会倾倒。
萎靡小鼠可迈出一步，但在下一步之前会停止并暂停。幼鼠可能会倾倒。
无活动小鼠在翻正后不再迈出任何步伐。幼鼠可能会倾倒。
无法翻正髋部活跃使用相同的4 s用于评估翻正反射在4 s内至少有一次髋部有力运动，大腿旋转超过水平方向90°。
髋部萎靡髋部运动达到但未超过水平方向90°。
髋部无活动肢体可能通过伸展和收缩产生运动，但髋部不发生旋转。幼鼠外观明显病态。

表2：小鼠健康评分的监测表及判定标准。 提供的这些标准用于对小鼠进行健康等级分类，并减少个体差异对健康评分的影响。

讨论

出生后的新生小鼠活动能力非常有限，即使在未受到挑战的情况下，当被置于仰卧位时也无法自行翻身复位。到出生后第7天（DOL 7），即本模型中接受挑战的小鼠年龄，未受挑战的小鼠表现出从“翻身-可活动”到“俯卧-可活动”的一系列运动能力，一个重要区别是，此年龄段未受挑战的小鼠不会表现出“俯卧-嗜睡”行为。只有经历多微生物脓毒症挑战的小鼠才会出现“俯卧-嗜睡”状态；因此，该反应可作为疾病严重程度的标志。注意髋部运动与水平面成90°角的判定阈值，有助于对小鼠髋部运动是否嗜睡或可活动进行一致且准确的评估。选择4秒作为观察小鼠能否自行翻身的时间窗口，是因为未受挑战的小鼠均能在此时间内稳定完成翻身动作。为避免过度疲劳影响小鼠获取食物和保持体温的能力，进而影响其康复预后，每次测试均避免重复测量同一只小鼠，并将翻身时间及髋部活动能力的评估限制在4秒内。观察小鼠从左侧和右侧分别翻身的能力，并采用较高得分作为判断其是否达到人道终点的依据，因为部分小鼠在一侧表现为“俯卧-不可活动”，但在另一侧仍具有较高的活动能力，并最终能够恢复。

用于评估小鼠健康状况的评分系统依赖于对一系列运动表现应用分类阈值，因此可能存在个体主观偏差。工作人员接受了统一培训，以确保每个人对小鼠的评分一致；然而，仍可能存在一定程度的主观性，从而导致评分差异。为评估评分的一致性，安排了七名此前未进行过新生小鼠监测的研究人员学习本方案及视频中所述要求，随后独立进行行为判断并确定人道终点。在对60只受挑战小鼠进行评分时，观察到97%的准确率，表明个体主观偏差在该模型的行为判定中未起显著作用。本研究所呈现的行为监测方案基于对出生后第7天（DOL 7）受挑战动物的观察，然而未受挑战的健康小鼠在出生6天内尚无法稳定完成翻正反射。因此，所描述的人道终点标准不能直接适用于更年幼的小鼠。若在本实验模型中使用更年幼的小鼠，或采用具有不同疾病动力学特征的其他挑战模型，则必须开发并预试验适当的人道终点标准，以避免对本可最终恢复的小鼠实施安乐死。该评分系统提供了一种改进人道终点分类的稳健方法，经过进一步测试与验证后，有望应用于其他模型。

每次制备盲肠悬液或使用新的小鼠品系时，均需重新滴定所给予的盲肠悬液剂量，以达到相似的致死剂量。每次制备均以关注的读数结果（即存活率）为标准进行标准化，而非给予相同的细菌数量。每批盲肠悬液制备物中的活菌浓度略有差异，这可能源于供体小鼠共生菌群的差异，或源于过滤后盲肠悬液原液在细胞滤筛中残留重量的差异。在进行盲肠悬液滴定过程中，前两窝幼鼠被分为两组，每窝的一半分别接受两种不同剂量的攻击，从而使每个剂量均在两窝中得到测试。如果所得存活率未达到预期水平，则将攻击剂量增加或减少5%-10%，并重复实验。使用多窝幼鼠可消除因窝与窝之间差异所导致的对脓毒症抵抗性或易感性的不同。每次新制备盲肠悬液时，准确滴定其原液浓度至关重要，以确保新批次的滴定结果与以往的盲肠悬液制备物具有可比性。观察发现，过度的噪音和振动（特别是在铺设沥青以及附近建筑物和道路施工期间）会增加母鼠的应激反应，这与同类相食发生率升高相关，并影响存活实验的死亡率，甚至影响未接受攻击的幼鼠，表明新生儿存活可能受到其他外界因素的影响，这些因素也需加以控制。

既往的盲肠悬液原液制备方法包括使用新鲜盲肠悬液，或采用多种方法制备冷冻盲肠悬液，其中包含使用甘油保存，而甘油不可避免地会在攻毒过程中被一同转移。尽管使用新鲜盲肠悬液的优势在于其细菌组成最接近原始盲肠内容物，但由于共生菌群存在个体差异，不同供体小鼠之间可能存在变异风险。尽管通过使用同一供应商来源的供体小鼠，并尽量缩短动物到货至实验开始的时间间隔来降低这种变异，但对于某些实验室而言，这种方法可能成本过高，且在启动针对7日龄新生小鼠的盲肠悬液实验时，还需面临同步获取年龄匹配小鼠的时间安排难题。因此，本研究采用了一种替代方法：将多个成年供体小鼠的盲肠内容物合并 pooling，重悬于D5W溶液中，于-80 °C冷冻保存而不添加甘油，实验时每次仅解冻一份等分试样。利用成年供体的盲肠悬液研究新生小鼠败血症时，可能存在将某些新生小鼠尚未接触过的细菌种类传入的情况，但该策略仍可用于新生小鼠败血症的研究，且既往已有研究采用此方法探讨新生小鼠生物学特性13,14,15。盲肠悬液用D5W稀释，旨在为细菌提供营养，从而在注射后促进活性感染的建立，此举亦可模拟坏死性小肠结肠炎期间腹膜腔内营养物质的可利用状态。冷冻保存细菌时未使用甘油作为稳定剂，原因是单独注射甘油可能带来潜在的不良反应。若在盲肠悬液制备过程中加入甘油，则必须通过设置仅注射甘油（不含盲肠悬液）的对照组来评估甘油本身可能引起的损伤，这将增加实验动物的使用量。在不添加甘油的情况下对盲肠悬液原液进行冷冻保存后，检测了其细菌活性，结果显示细菌存活率保持稳定，在-80 °C保存6个月期间，同一批次盲肠悬液不同等分试样中的细菌浓度无显著变化。这表明不使用甘油的冷冻保存方式在保证生物学结果一致性方面是可行的。采用批量制备的冷冻盲肠悬液原液，还可利用本单位自行繁育的小鼠，降低实验成本，并有效利用繁殖过程中多余的雄性小鼠，从而减少实验动物的浪费。

识别小鼠实验中失败的挑战操作至关重要，以避免为系统引入额外的噪声。在腹腔注射盲肠匀浆后，需观察小鼠皮下是否出现隆起，若出现则表明注射实际进入了皮下组织，属于注射失败。还需观察注射部位是否存在渗漏，包括拔针后立即检查以及注射后让小鼠迈步一步后再检查，因为有时（尽管罕见）小鼠仅在移动注射侧肢体后才会发生渗漏。若注射后出现隆起或渗漏，则将该小鼠排除在分析之外。毕竟，这些情况均可能导致不同的实验结果，因为已有研究观察到挑战剂量存在5%的差异即可影响后续的存活率。

盲肠内容物悬液攻击实验通常需要使用不同目标致死剂量，并采用按体重调整的剂量。因此，注射体积可能从仅20 µL到高达100 µL不等。与死腔体积相关的实验误差比例也会随注射体积变化而变化，从而增加了直接比较不同剂量的难度。通过将注射体积标准化这一简单改进，可消除该实验变异来源。

本方案中使用的新生小鼠行为监测系统是同类中的首个系统。致力于开展新生小鼠伦理研究的研究人员，常常面临难以评估该年龄段动物福利状况的资源匮乏问题。本研究所提出的直观且一致的监测系统，开始填补这一知识空白。重要的是，这种基于证据的方法不仅提高了所获得实验数据的质量，同时也有助于减少实验动物的痛苦。

披露

James Wynn 博士获得美国国立卫生研究院（NIH）/ 国家普通医学科学研究所（R01GM128452）以及 NIH/Eunice Kennedy Shriver 儿童健康与人类发育研究所（NICHD）（R01HD089939）的支持。

致谢

特别感谢不列颠哥伦比亚儿童医院研究所（BCCHR）动物护理设施的 Claire Harrison 及其团队在动物实验方面提供的支持，同时感谢程博彦博士在动物监测与福利方面的指导和建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 - 20 μL 移液器吸头VWR732-0799
1.8 mL 微量离心管Costar3621
100 - 1000 μL 移液器吸头VWR732-0801
1 - 200 μL 移液器吸头VWR732-0800
15 mL 离心管FroggaBioTB15-25
23G1 针头Becton Dickinson305145仅使用针头，不使用注射器，用于将小鼠固定在泡沫板上
28G 0.5 mL 胰岛素注射器BD329461
2 mL 冻存管Corning430488
50 mL 离心管Fisher scientific14-432-22
5 mL 移液管Costar4487
6 - 10 周龄 C57BL/6J 成年小鼠Jackson Laboratories664
出生 7 天以上的 C57BL/6J 新生小鼠本单位繁育n.a
70 μm 细胞筛Falcon352350
去纤维羊血DalynnHS30-500
5% 葡萄糖水溶液 (D5W)BaxterJB0080
解剖镊VWR 82027-386
解剖剪，尖头VWR 82027-592
解剖剪，一端尖一端钝VWR82027-594
乙醇（HistoPrep 95% 变性乙醇）FisherbrandHC11001GL用双蒸水稀释至 70%
耐乙醇标记笔；实验标记笔VWR52877-310
EZ 麻醉蒸发器EZ AnesthesiaEZ-155
Germinator 500 干热灭菌器（热珠灭菌器）Braintree ScientificGER 5287-120V
异氟烷Fresenius KabiCP0406V2
微型刮勺ChemglassCG-1983-12
移液辅助器Drummond4-000-100
Rainin Classic 移液器 PR-1000Rainin17008653
Rainin Classic 移液器 PR-20Rainin17008650
Rainin Classic 移液器 PR-200Rainin17008652
天平SartoriusBL 150 S
持针镊VWR82027-440 / 82027-442
1000 mL 方形储存瓶Corning431433
泡沫板任意品牌n.a
Sure-Seal 小鼠/大鼠安乐死舱EuthanexEZ-178
胰蛋白酶大豆琼脂Sigma-Aldrich22091-2.5KG
VX-200 实验室涡旋混合器Labnet InternationalS0200
称量纸Fisherbrand09-898-12B

参考文献

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