本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法,用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即 位于活细胞细胞连接处的蛋白质。我们提供了有关仪器校准、数据采集与分析的详细指南,包括对可能产生伪影的来源进行校正的方法。
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本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法,用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即 位于活细胞细胞连接处的蛋白质。我们提供了有关仪器校准、数据采集与分析的详细指南,包括对可能产生伪影的来源进行校正的方法。
多种生物学过程涉及细胞间的相互作用,这些相互作用通常由位于相邻细胞界面处相互结合的蛋白质介导。目前,仅有少数检测方法能够特异性地直接探测活细胞中的此类相互作用。本文介绍一种用于测量相邻细胞表面表达的蛋白质在细胞-细胞接触区域结合情况的检测方法。该检测方法包括两个步骤:将表达目标蛋白(分别与不同荧光蛋白融合)的细胞混合,随后利用共聚焦激光扫描显微镜在细胞-细胞接触部位进行荧光涨落光谱测量。我们通过测量淀粉样前体样蛋白1(APLP1)在细胞间连接处的相互作用,验证了该方法在生物学相关背景下的可行性。本文提供了基于荧光技术的数据采集详细方案,包括扫描荧光互相关光谱、互相关计数与亮度分析,以及所需仪器校准步骤。此外,我们还讨论了数据分析中的关键步骤,以及如何识别并校正由光漂白或细胞运动等因素引起的外部干扰信号变化。
通常,该检测方法适用于同型或异型细胞间接触处的蛋白质-蛋白质相互作用,可用于相同或不同类型的细胞之间,并可在商用共聚焦激光扫描显微镜上实施。一个重要的要求是系统的稳定性,必须足够稳定,以在数分钟内探测目标蛋白质的扩散动力学。
许多生物过程发生在细胞间相互作用的位点, 例如, 细胞间黏附1,2,3细胞-细胞融合4 以及细胞识别5此类事件在多细胞生物的发育过程以及细胞间通讯中尤为重要, 例如, 在免疫反应过程中,这些过程通常由定位于细胞表面的蛋白质介导。 即, 在邻近细胞的质膜(PM)上,并在细胞-细胞接触处发生特定的相互作用,这些相互作用在空间和时间上受到精确调控。在多数情况下,这些相互作用是直接的同源或异源蛋白质-蛋白质相互作用 转 相互作用,但也可能涉及作为细胞外连接物的离子或配体1尽管具有根本性的重要意义,但目前仍缺乏能够在活细胞天然环境中直接检测这些特定蛋白质-蛋白质相互作用的实验方法。许多技术手段都需要破坏细胞例如, 共免疫沉淀等生化实验6),固定(例如, 一些超分辨率光学显微技术与细胞间接触的电子显微镜观察7,或具有非特异性, 例如, 聚集/黏附实验8,9为解决这一问题,已采用基于荧光共振能量转移(FRET)的荧光技术10 或荧光互补11然而,为了实现荧光团之间足够小的距离,这些方法需要在蛋白质的胞外侧进行荧光标记10,可能会产生干扰 转 相互作用。
在此,我们介绍一种基于荧光的替代性检测方法,用于检测细胞间接触处的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法结合了荧光交叉相关分析技术(扫描荧光交叉相关光谱法(sFCCS)、交叉相关数量与亮度分析(ccN&B)以及表达目标蛋白融合构建体的细胞的混合 例如, 一种黏附受体。对两个相互作用细胞中所研究的受体分别用两种光谱分离的荧光蛋白(FPs)从细胞内侧进行标记(参见 图1A).
所采用的方法基于对荧光融合蛋白在共聚焦激光扫描显微镜焦点体积内扩散运动所引起的荧光强度波动进行统计分析。更具体而言,该检测方法可探测细胞间接触处相邻质膜(PM)中目标蛋白的共扩散行为。如果这些蛋白发生trans相互作用,则形成的trans复合物将携带可在两个光谱通道中发射荧光的荧光蛋白,从而导致两个荧光发射体的荧光波动呈现相关性;反之,若无结合发生,则相对质膜中蛋白的数量波动将相互独立,不会产生相关的荧光波动。数据采集可通过两种方式进行:1)扫描荧光相关光谱(sFCCS)基于对细胞间接触区域进行线状扫描,有效探测接触区某一特定位置的相互作用。通过对荧光波动的时间序列分析,sFCCS还可提供动力学信息,即蛋白复合物的扩散系数;2)细胞接触区光子计数与亮度分析(ccN&B)则基于对细胞间接触区域获取的一系列图像进行逐像素分析。该方法能够探测并绘制整个接触区域(在一个焦平面内)的相互作用分布图,但无法提供动力学信息。两种方法均可结合分子亮度分析,即单个扩散蛋白复合物在单位时间内发射的平均荧光信号强度,从而估算细胞间接触处蛋白复合物的化学计量比。
本文提供了在商用共聚焦激光扫描显微镜上实施所述检测方法的详细实验方案,包括样品制备、仪器校准、数据采集与分析。该实验可在配备光子计数或模拟检测器以及高数值孔径物镜的任意仪器上进行。我们进一步讨论了实验方案中的关键步骤,并提供了针对多种导致伪信号波动过程的校正方法。 例如, 检测器噪声、光漂白或细胞运动。该检测方法最初用于研究贴壁细胞间的相互作用,但可经修改用于悬浮细胞,或调整以模拟膜系统。 例如, 巨大单层囊泡(GUVs)或巨大质膜囊泡(GPMVs),可用于在不同脂质环境或缺乏有序细胞骨架的情况下定量分析分子间相互作用12,13.
扫描荧光交叉相关光谱法 是荧光交叉相关光谱技术的一种改进版本14 并专门设计用于探测脂质膜中缓慢的扩散动力学15基于垂直于质膜(PM)的线扫描采集,其中包含感兴趣的荧光蛋白。为探究两种不同标记蛋白物种之间的相互作用,使用两条激光线和两个检测窗口,在两个光谱通道中进行采集,以实现光谱分离的荧光团检测。由于蛋白质在质膜中扩散动力学较慢(D≤~1 µm2/s),通过逐行交替激发方案,可实现无串扰的测量15分析始于:1)基于约1000行分块平均的侧向细胞运动校正比对算法,2)确定荧光信号最强的位置,即 PM位置,在每个模块中,以及3)将所有模块移至一个共同的原点12,15,分别在每个通道中进行。随后,通过对所有配准线段之和进行高斯拟合,并选取其中心区域,自动选择对应于质膜(PM)的像素。即, 中心 ± 2.5σ)。对每条线中的信号进行积分,得到膜荧光时间序列 F(t) 每个通道(g = 绿色通道,r = 红色通道)。请注意,像素尺寸必须足够小, 例如, <200 nm,以重构点扩散函数的形状并确定其对应于 PM 位置的中心。当存在显著的光漂白时,可使用双指数函数对每个通道的荧光时间序列进行建模,然后通过以下公式进行校正:16
. (1)
需要注意的是,与从未经校正的 F(t) 所得参数估计值相比,该公式可有效校正从 F(t)c 相关分析中获得的振幅和扩散时间。随后,计算荧光信号的自相关和互相关函数(ACFs/CCFs):
,(2)
,(3)
其中 δFi = Fi(t) -
Fi(t)
,且 i = g,r。
然后将一个二维扩散模型拟合到所有相关函数(CFs)上:
. (4)
此处, N 表示观察体积内荧光蛋白的数量 τd 每个通道的扩散时间。该模型考虑到,在所述实验条件下,蛋白质在质膜中的扩散发生在 x-z 平面,而与常用的荧光相关光谱(FCS)实验配置不同,后者通常探测共聚焦体积 x-y 平面内的膜扩散。17腰围0 以及描述伸长 w 的结构因子 Sz z方向上焦体积的,S = wz/ w0通过使用光谱特性相似的染料,并采用已知的扩散系数值,在相同的光学设置下进行单点FCS校准测量而获得 D染料:
, (5)
其中 τd,dye 是通过将三维扩散模型拟合到数据中得到的染料分子的实测平均扩散时间,拟合时需考虑所有 N 个分子中有一部分比例为 T 的分子以时间常数 ττ 转变为三重态:
. (6)
最后,如下计算sFCCS数据的扩散系数(D)、分子亮度值(ε)和相对交叉相关性(rel.cc.):
, (7)
, (8)
, (9)
其中,Gcross(0) 为互相关函数的幅度,
为第 i 个通道自相关函数的幅度。
相对互相关函数的这一定义, 即 使用 最大 而不是 平均值 在公式9中,考虑了两种不同浓度的蛋白质物种所形成的复合物的最大数量受限于数量较少的物种。
交叉相关数与亮度基于在样品固定位置随时间采集的图像序列中每个像素的荧光强度矩分析,该图像序列通常包含约 100–200 帧,并具有两个光谱通道(g = 绿色通道,r = 红色通道)。根据时间平均值
I
i 和方差
,可在每个像素和光谱通道(i = g,r)中计算出分子亮度 εi 和分子数 ni18:
, (10)
。(11)
需要注意的是,上述方程适用于理想情况下的真正光子计数探测器。对于模拟检测系统,应使用以下方程19,20:
, (12)
. (13)
此处,S 是检测到的光子数与记录的数字计数值之间的转换系数,
是读出噪声,以及 偏移量 指检测器的强度偏移量。通常,对于任何类型的检测器,都应基于在稳定光照条件下测量检测器方差随强度的变化来校准这些参数。19, 例如, 反射性金属表面或干燥的染料溶液。 偏移量 可通过测量无激发光照射样品时的计数率来确定。通过对接收器相关方差进行线性回归分析
与强度的关系(I)图,S 和
可以确定19:
. (14)
最后,计算每个像素的交叉相关亮度,其通用定义为21
, (15)
其中
为互协方差
。
为了滤除长寿命的波动,所有 ccN&B 计算在对每个像素独立进行箱形滤波后执行22简而言之, niεi (i = g, r)和 Bcc 在滑动片段中进行计算 例如, 8-15 帧。随后可对所得数值取平均值,以获得最终的像素数量和亮度值。
化学计量学分析
为了估算细胞-细胞接触处蛋白质复合物的化学计量比,可对 sFCCS 或 ccN&B 数据的每个光谱通道分别分析分子亮度。在 sFCCS 中,每次测量在每个通道中获得一个亮度值。在 ccN&B 中,获得对应于细胞-细胞接触的所有像素的亮度直方图,并可使用其平均值(或中位数)作为该次测量的代表性亮度。通过对单体参考蛋白进行相同的分析,所有亮度值均可归一化,从而直接获得所检测蛋白质复合物的平均寡聚状态。此时,重要的是需校正非荧光荧光蛋白(FP)的存在,因其可能导致对寡聚状态的低估。通常通过使用单色 sFCS 或数量与亮度(N&B)方法测量同源二聚体参考蛋白的亮度来实现这一校正23,24。
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1. 样品制备:细胞间混合实验
注意:以下方案描述了贴壁细胞的混匀步骤。对于悬浮培养的细胞,可对此方案进行相应调整。

图1. 实验流程及在细胞间接触处进行扫描荧光互相关光谱和互相关数与亮度分析的示意图。 (A) 样品制备示意图:两种转染了目标蛋白的细胞群体(例如, APLP1)与两种光谱不同的荧光蛋白融合例如, mEYFP 和 mCardinal)在转染后混合。在显微镜实验中选择不同转染细胞之间的接触区域。为避免干扰细胞外结合结构域,荧光蛋白应融合至目标蛋白的胞内末端。B扫描荧光相关光谱(sFCCS)测量在两个光谱通道(通道1,绿色;通道2,红色)中垂直于细胞-细胞接触面进行。扫描线(以延时图像表示)对齐后,对膜区域像素进行求和。随后,从强度轨迹计算自相关函数(ACFs)和互相关函数(CCFs)。 Fi(t). ACF以红色和绿色表示。CCF以蓝色表示。 (C交叉相关 N&B (ccN&B) 采集结果生成一个三维(x-y-时间)图像序列。在细胞-细胞接触区域周围选择一个感兴趣区域(ROI)。随后选择通道及互相关亮度(ε1ε2,以及 Bcc在每个细胞-细胞接触像素中计算 ) 值,然后将所有选定像素的结果汇总并以直方图形式可视化。 请点击此处以查看此图的放大版本。
2. 样品制备:用于交叉相关实验的阳性对照及用于亮度分析的同源二聚体构建
3. 共聚焦激光扫描显微镜:设置与焦平面体积校准
注意:以下方案是针对本研究中使用的激光扫描共聚焦显微镜上以 mEGFP/mEYFP 和 mCherry/mCardinal 进行的实验所撰写的。光学装置、软件设置(激光谱线、二向色镜、滤光片)以及校准染料的选择可根据其他荧光蛋白(FPs)和显微镜系统进行调整。
4. 扫描荧光交叉相关光谱:数据采集
注意:以下方案是针对本研究中使用的激光扫描共聚焦显微镜上以 mEGFP/mEYFP(“绿色”)和 mCherry/mCardinal(“红色”)进行的实验所撰写的。对于其他荧光蛋白或显微镜系统,其光学配置和软件设置(激光线、二向色镜、滤光片)可能有所不同。
5. 扫描荧光交叉相关光谱:数据分析
注意:以下方案遵循先前文献中详细描述的分析流程的实施方案12,15。软件代码可向作者申请获取。
6. 交叉相关计数与亮度:探测器校准
注意:以下方案提供了关于如何校准检测系统的通用指南。此步骤对于模拟检测系统是必需的,但在使用真正的光子计数检测器时并非严格需要。
7. 交叉相关计数与亮度:数据采集
8. 互相关计数与亮度:数据分析
注意:以下实验方案遵循先前描述的分析流程12,31。软件代码可应要求向作者索取。
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蛋白质-蛋白质相互作用检测的初步实验 即, 表达光谱不同的荧光蛋白的细胞混合,随后进行sFCCS/ccN&B 测量(图1),应在那些不预期在细胞-细胞接触处发生相互作用的蛋白质上进行即, 阴性对照)。因此,将表达豆蔻酰化-棕榈酰化-mEYFP(myr-palm-mEYFP)或-mCardinal的HEK 293T细胞混合,并在细胞-细胞接触区域进行溶液荧光相关光谱(sFCCS)分析(图2A)。在理想情况下,由于蛋白质在质膜(PM)中的扩散运动以及焦体积内蛋白质分子数量的统计学波动,每个通道的荧光信号应围绕一个稳定的均值波动。对于不发生相互作用的蛋白质,两个通道中的波动彼此独立,因此光谱交叉相关性预期在零值附近波动。事实上,在典型的测量中观察到相对交叉相关性接近于零。图2C)。ACF 显...
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本文所述实验方法可用于研究细胞间接触处的蛋白质-蛋白质反式相互作用,采用荧光涨落光谱技术,即sFCCS和ccN&B。这些方法通过对两个相邻细胞接触处表达的、分别与目标蛋白融合的两种光谱可区分的荧光蛋白所发出的荧光信号涨落进行统计分析,来量化邻近细胞质膜中蛋白质共扩散的程度,从而检测反式复合物的存在。除详细的样品制备、数据采集与分析方案外,本文还提供了该方法成功应用于神经细胞黏附蛋白APLP1的研究证据。我们证明,APLP1在细胞间接触处发生特异性的同型反式相互作用。此外,锌离子可促进APLP1在细胞间接触处形成簇状结构,从而为反式相互作用提供多价平台,并增强反式结合能力。
与以往基于破坏性生化方法检测此类相互作用的检测技术相比6该方法可直接在活细胞上进行,无需固定或分离蛋白质复合物。此外,通过检测与目标蛋白基因融合的荧光蛋白,该方法可提供分子特异性和相关信息,与以往的定性检测方法不同。8
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作部分得到了德国研究基金会(DFG)项目编号254850309的资助。作者感谢Madlen Luckner对稿件的审阅。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM 培养基 | PAN-Biotech | P04-01548 | |
| 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBS | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| 含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBS | PAN-Biotech | P04-35500 | |
| 胰蛋白酶 EDTA | PAN-Biotech | P10-023100 | |
| TurboFect 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| HEK 293T 细胞 | DSMZ | ACC 635 | |
| Alexa Fluor 488 NHS 酯 | Thermo Fisher Scientific | A20000 | |
| 罗丹明 B | Sigma-Aldrich | 83689-1G | |
| 质粒 DNA | Addgene | NA | 有关所有质粒的详细描述,请参见参考文献 12(Dunsing 等,MBoC 2017) |
| 6 孔板 | Starlab | CC7672-7506 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | CellVis | D35-14-1.5-N | |
| Zeiss LSM780 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | NA | |
| MATLAB 软件包 | MathWorks | 2015b | |
| Neubauer 细胞计数板 | Marienfeld | 640110 |
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