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方法文章

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

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DOI：

10.3791/58582

⸱

2018年12月1日

 , 
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即 位于活细胞细胞连接处的蛋白质。我们提供了有关仪器校准、数据采集与分析的详细指南，包括对可能产生伪影的来源进行校正的方法。

摘要

多种生物学过程涉及细胞间的相互作用，这些相互作用通常由位于相邻细胞界面处相互结合的蛋白质介导。目前，仅有少数检测方法能够特异性地直接探测活细胞中的此类相互作用。本文介绍一种用于测量相邻细胞表面表达的蛋白质在细胞-细胞接触区域结合情况的检测方法。该检测方法包括两个步骤：将表达目标蛋白（分别与不同荧光蛋白融合）的细胞混合，随后利用共聚焦激光扫描显微镜在细胞-细胞接触部位进行荧光涨落光谱测量。我们通过测量淀粉样前体样蛋白1（APLP1）在细胞间连接处的相互作用，验证了该方法在生物学相关背景下的可行性。本文提供了基于荧光技术的数据采集详细方案，包括扫描荧光互相关光谱、互相关计数与亮度分析，以及所需仪器校准步骤。此外，我们还讨论了数据分析中的关键步骤，以及如何识别并校正由光漂白或细胞运动等因素引起的外部干扰信号变化。

通常，该检测方法适用于同型或异型细胞间接触处的蛋白质-蛋白质相互作用，可用于相同或不同类型的细胞之间，并可在商用共聚焦激光扫描显微镜上实施。一个重要的要求是系统的稳定性，必须足够稳定，以在数分钟内探测目标蛋白质的扩散动力学。

引言

许多生物过程发生在细胞间相互作用的位点， 例如， 细胞间黏附1,2,3细胞-细胞融合4 以及细胞识别5此类事件在多细胞生物的发育过程以及细胞间通讯中尤为重要， 例如， 在免疫反应过程中，这些过程通常由定位于细胞表面的蛋白质介导。 即， 在邻近细胞的质膜（PM）上，并在细胞-细胞接触处发生特定的相互作用，这些相互作用在空间和时间上受到精确调控。在多数情况下，这些相互作用是直接的同源或异源蛋白质-蛋白质相互作用 转 相互作用，但也可能涉及作为细胞外连接物的离子或配体1尽管具有根本性的重要意义，但目前仍缺乏能够在活细胞天然环境中直接检测这些特定蛋白质-蛋白质相互作用的实验方法。许多技术手段都需要破坏细胞例如， 共免疫沉淀等生化实验6），固定（例如， 一些超分辨率光学显微技术与细胞间接触的电子显微镜观察7，或具有非特异性， 例如， 聚集/黏附实验8,9为解决这一问题，已采用基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光技术10 或荧光互补11然而，为了实现荧光团之间足够小的距离，这些方法需要在蛋白质的胞外侧进行荧光标记10，可能会产生干扰 转 相互作用。

在此，我们介绍一种基于荧光的替代性检测方法，用于检测细胞间接触处的蛋白质-蛋白质相互作用。该方法结合了荧光交叉相关分析技术（扫描荧光交叉相关光谱法（sFCCS）、交叉相关数量与亮度分析（ccN&B）以及表达目标蛋白融合构建体的细胞的混合 例如， 一种黏附受体。对两个相互作用细胞中所研究的受体分别用两种光谱分离的荧光蛋白（FPs）从细胞内侧进行标记（参见 图1A).

所采用的方法基于对荧光融合蛋白在共聚焦激光扫描显微镜焦点体积内扩散运动所引起的荧光强度波动进行统计分析。更具体而言，该检测方法可探测细胞间接触处相邻质膜（PM）中目标蛋白的共扩散行为。如果这些蛋白发生trans相互作用，则形成的trans复合物将携带可在两个光谱通道中发射荧光的荧光蛋白，从而导致两个荧光发射体的荧光波动呈现相关性；反之，若无结合发生，则相对质膜中蛋白的数量波动将相互独立，不会产生相关的荧光波动。数据采集可通过两种方式进行：1）扫描荧光相关光谱（sFCCS）基于对细胞间接触区域进行线状扫描，有效探测接触区某一特定位置的相互作用。通过对荧光波动的时间序列分析，sFCCS还可提供动力学信息，即蛋白复合物的扩散系数；2）细胞接触区光子计数与亮度分析（ccN&B）则基于对细胞间接触区域获取的一系列图像进行逐像素分析。该方法能够探测并绘制整个接触区域（在一个焦平面内）的相互作用分布图，但无法提供动力学信息。两种方法均可结合分子亮度分析，即单个扩散蛋白复合物在单位时间内发射的平均荧光信号强度，从而估算细胞间接触处蛋白复合物的化学计量比。

本文提供了在商用共聚焦激光扫描显微镜上实施所述检测方法的详细实验方案，包括样品制备、仪器校准、数据采集与分析。该实验可在配备光子计数或模拟检测器以及高数值孔径物镜的任意仪器上进行。我们进一步讨论了实验方案中的关键步骤，并提供了针对多种导致伪信号波动过程的校正方法。 例如， 检测器噪声、光漂白或细胞运动。该检测方法最初用于研究贴壁细胞间的相互作用，但可经修改用于悬浮细胞，或调整以模拟膜系统。 例如， 巨大单层囊泡（GUVs）或巨大质膜囊泡（GPMVs），可用于在不同脂质环境或缺乏有序细胞骨架的情况下定量分析分子间相互作用12,13.

扫描荧光交叉相关光谱法 是荧光交叉相关光谱技术的一种改进版本14 并专门设计用于探测脂质膜中缓慢的扩散动力学15基于垂直于质膜（PM）的线扫描采集，其中包含感兴趣的荧光蛋白。为探究两种不同标记蛋白物种之间的相互作用，使用两条激光线和两个检测窗口，在两个光谱通道中进行采集，以实现光谱分离的荧光团检测。由于蛋白质在质膜中扩散动力学较慢（D≤~1 µm2/s），通过逐行交替激发方案，可实现无串扰的测量15分析始于：1）基于约1000行分块平均的侧向细胞运动校正比对算法，2）确定荧光信号最强的位置，即 PM位置，在每个模块中，以及3）将所有模块移至一个共同的原点12,15，分别在每个通道中进行。随后，通过对所有配准线段之和进行高斯拟合，并选取其中心区域，自动选择对应于质膜（PM）的像素。即， 中心 ± 2.5σ）。对每条线中的信号进行积分，得到膜荧光时间序列 F(t) 每个通道（g = 绿色通道，r = 红色通道）。请注意，像素尺寸必须足够小， 例如， <200 nm，以重构点扩散函数的形状并确定其对应于 PM 位置的中心。当存在显著的光漂白时，可使用双指数函数对每个通道的荧光时间序列进行建模，然后通过以下公式进行校正：16

数学建模的函数方程；公式显示；方程分析。.    (1)

需要注意的是，与从未经校正的 F(t) 所得参数估计值相比，该公式可有效校正从 F(t)c 相关分析中获得的振幅和扩散时间。随后，计算荧光信号的自相关和互相关函数（ACFs/CCFs）：

荧光涨落光谱分析中的自相关函数公式 G_auto(τ)。，（2）

涨落分析、显微镜背景下使用的互相关函数方程 G_cross(τ)。，（3）

其中 δFi = Fi(t) - 色谱方程 ΣFx=0 示意图；化学分离过程中的质量平衡。Fi(t)静态平衡；ΣFx=0 示意图；力学平衡图示；物理学教学概念。，且 i = g,r。

然后将一个二维扩散模型拟合到所有相关函数（CFs）上：

荧光相关光谱分析公式，\( G(\tau) \) 的表达式。.   (4)

此处， N 表示观察体积内荧光蛋白的数量 τd 每个通道的扩散时间。该模型考虑到，在所述实验条件下，蛋白质在质膜中的扩散发生在 x-z 平面，而与常用的荧光相关光谱（FCS）实验配置不同，后者通常探测共聚焦体积 x-y 平面内的膜扩散。17腰围0 以及描述伸长 w 的结构因子 Sz z方向上焦体积的，S = wz/ w0通过使用光谱特性相似的染料，并采用已知的扩散系数值，在相同的光学设置下进行单点FCS校准测量而获得 D染料:

“方程 w₀=√(4τd,dyeDdye)；分子扩散分析；公式，研究”， （5）

其中 τd,dye 是通过将三维扩散模型拟合到数据中得到的染料分子的实测平均扩散时间，拟合时需考虑所有 N 个分子中有一部分比例为 T 的分子以时间常数 ττ 转变为三重态：

荧光相关光谱方程；用于分析分子动力学，τ依赖公式。.   (6)

最后，如下计算sFCCS数据的扩散系数（D）、分子亮度值（ε）和相对交叉相关性（rel.cc.）：

阻尼系数公式，D=ω₀²/4τd，显示动态稳定性分析方程。,    (7)

静态平衡方程，ε=⟨F(t)⟩/N，公式，教育研究，简明描述。 ,   (8)

静态平衡，公式：rel.cc=max{C_cross(0)/C_g_auto(0),C_cross(0)/C_r_auto(0)}。,   (9)

其中，Gcross(0) 为互相关函数的幅度，静态平衡；ΣFx=0，ΣFy=0；示意图；力学稳定性分析方程。 为第 i 个通道自相关函数的幅度。

相对互相关函数的这一定义， 即 使用 最大 而不是 平均值 在公式9中，考虑了两种不同浓度的蛋白质物种所形成的复合物的最大数量受限于数量较少的物种。

交叉相关数与亮度基于在样品固定位置随时间采集的图像序列中每个像素的荧光强度矩分析，该图像序列通常包含约 100–200 帧，并具有两个光谱通道（g = 绿色通道，r = 红色通道）。根据时间平均值 色谱方程 ΣFx=0 图示；化学分离过程中的质量平衡。I静力平衡；ΣFx=0 图示；力学平衡示意图；物理学教学概念。i 和方差 静力平衡；公式 Σσ²ᵢ；物理方程；教学图示，可在每个像素和光谱通道（i = g，r）中计算出分子亮度 εi 和分子数 ni18：

静态平衡方程：εᵢ = (σᵢ²/⟨Ι⟩ᵢ) - 1，数学公式示意图。,   (10)

统计数据分析方程，显示加权平均值计算方法的公式。（11）

需要注意的是，上述方程适用于理想情况下的真正光子计数探测器。对于模拟检测系统，应使用以下方程19,20：

静力平衡方程；应变分析符号 εi；材料应力评估的数学公式。,   (12)

过程分析的统计公式；方程包含偏移量计算和方差项。.   (13)

此处，S 是检测到的光子数与记录的数字计数值之间的转换系数， 静力平衡公式 σ₀²；方程图像。 是读出噪声，以及 偏移量 指检测器的强度偏移量。通常，对于任何类型的检测器，都应基于在稳定光照条件下测量检测器方差随强度的变化来校准这些参数。19, 例如， 反射性金属表面或干燥的染料溶液。 偏移量 可通过测量无激发光照射样品时的计数率来确定。通过对接收器相关方差进行线性回归分析 静态平衡；ΣFx=0 方程；示意图；教育，物理概念，受力分析 与强度的关系（I）图，S 和 静力平衡公式 σ₀²；方程图像。 可以确定19:

静态平衡公式 σ²d = S(l) - S ⋅ offset + σ²₀。数学方程示意图。.   (14)

最后，计算每个像素的交叉相关亮度，其通用定义为21

光谱相关系数的BCC公式；方程；研究与分析关键词。， (15)

其中 数学语境中的统计符号 σ²，用于方差计算。 为互协方差 信号处理分析中的互协方差公式 σ²_cc；数学方程。。

为了滤除长寿命的波动，所有 ccN&B 计算在对每个像素独立进行箱形滤波后执行22简而言之， niεi (i = g, r）和 Bcc 在滑动片段中进行计算 例如， 8-15 帧。随后可对所得数值取平均值，以获得最终的像素数量和亮度值。

化学计量学分析
为了估算细胞-细胞接触处蛋白质复合物的化学计量比，可对 sFCCS 或 ccN&B 数据的每个光谱通道分别分析分子亮度。在 sFCCS 中，每次测量在每个通道中获得一个亮度值。在 ccN&B 中，获得对应于细胞-细胞接触的所有像素的亮度直方图，并可使用其平均值（或中位数）作为该次测量的代表性亮度。通过对单体参考蛋白进行相同的分析，所有亮度值均可归一化，从而直接获得所检测蛋白质复合物的平均寡聚状态。此时，重要的是需校正非荧光荧光蛋白（FP）的存在，因其可能导致对寡聚状态的低估。通常通过使用单色 sFCS 或数量与亮度（N&B）方法测量同源二聚体参考蛋白的亮度来实现这一校正23,24。

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方案

1. 样品制备：细胞间混合实验

注意：以下方案描述了贴壁细胞的混匀步骤。对于悬浮培养的细胞，可对此方案进行相应调整。

  1. 在6孔板上接种适量数量的细胞， 例如， 800,000 个 HEK 293T 细胞（使用血细胞计数板计数），在转染前一天接种。接种细胞数可根据接种至转染之间的时间间隔进行调整，并根据不同细胞类型进行相应优化。进行基础实验时（即， 目的蛋白和阴性对照），至少准备4个孔。将细胞接种培养于 37 °C，5% CO₂2 在添加了胎牛血清（10%）和 L-谷氨酰胺（1%）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中
  2. 按照制造商的说明转染细胞（参见 材料表).
    1. 为了进行一个基础实验，分别在不同的孔中转染编码目的蛋白与“绿色”荧光蛋白融合的质粒例如， 单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFP）或黄色荧光蛋白（mEYFP）或“红色”（例如， mCherry 或 mCardinal 荧光蛋白
      注意：在本方案中，我们重点关注 APLP1-mEYFP 和 APLP1-mCardinal12，以及相应的阴性对照， 例如， 豆蔻酰化-棕榈酰化-mEYFP（myr-palm-mEYFP）和-mCardinal（myr-palm-mCardinal）12通常，200 ng - 1 µg 质粒DNA的量足够即可。较高的转染效率可增加观察到相互接触的“红色”和“绿色”细胞的概率。通过调整质粒和转染试剂的用量以优化转染效率。 关键： 转染细胞时，细胞融合度应约为70%。若细胞过度融合，转染效率会降低；若细胞融合度不足，转染和混匀操作可能引起细胞应激，并导致大量细胞在混匀后无法正常贴壁。
  3. 进行细胞混合 ~转染后4 ± 2小时
    1. 移除培养基，用 1 mL 含 Mg 的 PBS 轻柔洗涤每孔2+ 和 Ca2+然后，移除 PBS。关键的在孔板边缘滴加 PBS，以防止洗涤过程中细胞脱落。
    2. 加入约~50 µL 将胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液逐滴加入各孔，以促进细胞脱落。于37℃孵育 37 °C 2 分钟后，缓慢横向摇动 6 孔板以使细胞脱离。
      注意：某些细胞类型可能需要延长孵育时间。
    3. 添加 950 µL 向每个孔中加入适量生长培养基，通过上下吹打数次重悬细胞，使所有细胞从孔底脱离。关键的确保细胞重悬充分并相互分离，通过肉眼观察确认重悬后无大块细胞团聚。否则，混合后将出现大量“红色-红色”或“绿色-绿色”接触。
    4. 将一个孔的细胞溶液（目的蛋白或阴性对照）转移至对应的孔中， 即， 红色（red）例如， APLP1-mCardinal 转染）至“绿色”（例如， APLP1-mEYFP 转染的细胞。轻轻吹打数次混匀。随后将混合后的细胞接种至 35 mm 玻璃底培养皿中（每皿加入 1 mL 混合细胞悬液，并添加 1 mL 生长培养基），继续培养 1 天 37 °C，5% CO₂2.

APLP1蛋白检测示意图；荧光相关光谱，数据分析，相关性图
图1. 实验流程及在细胞间接触处进行扫描荧光互相关光谱和互相关数与亮度分析的示意图。 (A) 样品制备示意图：两种转染了目标蛋白的细胞群体（例如， APLP1）与两种光谱不同的荧光蛋白融合例如， mEYFP 和 mCardinal）在转染后混合。在显微镜实验中选择不同转染细胞之间的接触区域。为避免干扰细胞外结合结构域，荧光蛋白应融合至目标蛋白的胞内末端。B扫描荧光相关光谱（sFCCS）测量在两个光谱通道（通道1，绿色；通道2，红色）中垂直于细胞-细胞接触面进行。扫描线（以延时图像表示）对齐后，对膜区域像素进行求和。随后，从强度轨迹计算自相关函数（ACFs）和互相关函数（CCFs）。 Fi(t). ACF以红色和绿色表示。CCF以蓝色表示。 (C交叉相关 N&B (ccN&B) 采集结果生成一个三维（x-y-时间）图像序列。在细胞-细胞接触区域周围选择一个感兴趣区域（ROI）。随后选择通道及互相关亮度（ε1ε2，以及 Bcc在每个细胞-细胞接触像素中计算 ) 值，然后将所有选定像素的结果汇总并以直方图形式可视化。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 样品制备：用于交叉相关实验的阳性对照及用于亮度分析的同源二聚体构建

  1. 转染前一天，使用细胞计数板计数，将600,000个HEK 293T细胞接种于35 mm玻璃底培养皿中。在含完全DMEM培养基（见步骤1.1）的条件下，于37 °C、5% CO2培养箱中继续培养一天。
  2. 根据制造商说明书，用约250 ng质粒DNA转染细胞。作为正交相关性对照，使用编码膜锚定荧光蛋白异源二聚体的质粒，例如 myr-palm-mCherry-mEGFP 或 myr-palm-mCardinal-mEYFP12，对应于目标蛋白所用的荧光蛋白。为进行亮度校准，使用编码膜锚定荧光蛋白单体和同源二聚体的质粒，例如 myr-palm-mEYFP 和 myr-palm-mEYFP-mEYFP，以校准APLP1-mEYFP的亮度分析12。
  3. 在含完全DMEM培养基（见步骤1.1）的条件下，于37 °C、5% CO2培养箱中继续培养一天。

3. 共聚焦激光扫描显微镜：设置与焦平面体积校准

注意：以下方案是针对本研究中使用的激光扫描共聚焦显微镜上以 mEGFP/mEYFP 和 mCherry/mCardinal 进行的实验所撰写的。光学装置、软件设置（激光谱线、二向色镜、滤光片）以及校准染料的选择可根据其他荧光蛋白（FPs）和显微镜系统进行调整。

  1. 至少在实验开始前一小时打开显微镜和激光器，以确保激光稳定性及温度平衡。
  2. 制备100-200 µL 合适的水溶性荧光染料溶液（参见 材料表 在水或PBS中稀释至10–50 nM浓度范围，用于校准焦平面体积（例如）。
  3. 将染料溶液置于洁净的35 mm玻璃底培养皿（#1.5）中， 即， 厚度为0.16–0.19 mm。
    注意：理想情况下，应使用具有低厚度公差的高性能盖玻片培养皿， 例如， 0.170 ± 0.005 mm，以实现最佳的环形校正（步骤 3.6）。必须使用与后续实验所用相同类型的培养皿。
  4. 将含有染料溶液的培养皿直接置于物镜上（建议使用水浸物镜，数值孔径 NA 1.2），以确保聚焦到溶液中。或者，将培养皿放置在样品载台上，然后对样品进行聚焦。例如， 10-20 µm 培养皿底部上方
    注意：由于在对水性样品深层聚焦时使用油镜所获得的信号较差，因此不推荐使用油镜。
  5. 设置激发和发射光路， 例如， 选择488 nm激光器、488/561 nm二向色镜、检测窗口为499–552 nm，针孔大小为1艾里单位（AU）。确保针孔大小与将在互相关测量中使用的一致。
  6. 调整针孔位置（针孔调节并调节物镜的环形校正环以最大化计数率。为此，旋转环形校正环直至检测到最大计数率。
    注意：环形校正用于补偿所用盖玻片的特定厚度。最大化计数率， 即尽可能多地收集每个分子的光子，对于最大化测量的信噪比（SNR）至关重要。
  7. 进行一系列定点FCS测量（例如， 6个不同位置的测量，每个位置重复15次，每次持续10秒，即 总时间2.5分钟，进行采样 1 µs 停留时间或更短），激光功率与交叉相关测量中所用的相同（通常约为1%） 即， ~1-2 µW).
  8. 拟合包含三重态贡献的三维扩散模型（公式6）到数据中。
    注意：通常获得的扩散时间约为 30 µs 结构因子约为4-8。
  9. 计算腰围 w0 根据测得的平均扩散时间以及染料在室温下已发表的扩散系数值25 根据公式5，典型值为200–250 nm。
  10. 如有需要，使用另一种荧光染料重复校准程序（步骤 3.4–3.9），以用于第二个检测通道例如， 561 nm 激发，检测波长范围为 570 nm 至 695 nm。保持针孔位置和大小与第一检测通道设置时相同。
  11. 根据校准测量结果计算分子亮度（公式8），并保存所得数值。
    注：所用装置的典型值为 ~8-10 kHz/分子（MOL）用于 1.8 µW 488 nm 激发功率。若数值低于正常水平，可能表明物镜上有污垢、系统光路未对准或激光输出减弱。应定期使用功率计检测并记录物镜处的激光输出功率。在比较不同系统时，以激发激光功率归一化的分子亮度是评估显微镜性能最有意义的参数。

4. 扫描荧光交叉相关光谱：数据采集

注意：以下方案是针对本研究中使用的激光扫描共聚焦显微镜上以 mEGFP/mEYFP（“绿色”）和 mCherry/mCardinal（“红色”）进行的实验所撰写的。对于其他荧光蛋白或显微镜系统，其光学配置和软件设置（激光线、二向色镜、滤光片）可能有所不同。

  1. 设置光路， 例如， 488 nm 和 561 nm 激发光，使用 488/561 nm 二向色镜，488 nm 激发时针孔设为 1 AU。为避免光谱串扰，选择两个独立的扫描通道，依次激发并检测 mEGFP/mEYFP（488 nm 激发，绿色通道）和 mCherry/mCardinal（561 nm 激发，红色通道），并选择 切换轨道每一行使用适用于两个通道的适当滤光片进行检测， 例如， 绿色通道为499-552 nm，红色通道为570-695 nm。
  2. 如果无法实现交替激发，请为红色通道设置适当的滤光参数，以最大限度减少光谱串扰（即 检测mCherry/mCardinal荧光时，其发射波长不低于600 nm。这可能会减少在红色通道中检测到的光子数量，从而降低信噪比。
  3. 将含有混合细胞的培养皿放置在样品台上。等待至少10分钟，以确保温度平衡并减少焦距漂移。
  4. 使用透射光聚焦细胞 定位 菜单
  5. 寻找一对相互接触的“红色”和“绿色”细胞。对于正交相关性或同源二聚体亮度对照实验（见第2节），需寻找在两个通道中均发出荧光或在质膜（PM）处显示相应同源二聚体信号的孤立细胞。
    注意： （关键步骤） 在寻找细胞时尽量减少样品暴露，以避免预漂白，这可能会降低互相关性26因此，应以最快速度扫描并使用低激光功率。为避免成像高表达细胞时探测器饱和，请搜索 积分模式然而，为了尽量减少暴露，可以在较低激光功率下进行扫描 光子计数 模式。
  6. 选择一条垂直于细胞间接触的扫描路径（或针对单个细胞的质膜，用于正交相关或同源二聚体亮度对照），使用 作物 如图所示的按钮 图1B 和 2A.
    注意：一些较旧的显微镜不支持任意扫描方向。在这种情况下，必须定位与扫描方向垂直取向的细胞间接触。
  7. 缩放 以实现 50–200 nm 的像素尺寸并进行选择 线 在 扫描模式设置 帧大小 至 128 × 1 像素。
    注意：典型的像素尺寸为 160 nm，对应扫描长度约为 20 µm.
  8. 设置 扫描速度 至允许的最大值， 例如， 472.73 µs 每行
    注意：对于另一种激发方案，这对应于 954.45 µs 扫描时间， 即 ~1000 次扫描/秒，在所使用的装置上。扫描速度可根据目标蛋白的扩散系数进行调整。对于膜锚定蛋白，典型的扩散时间约为 10–20 ms。扫描时间应至少比扩散时间小十倍。较低的扫描速度可能导致更强的光漂白，需使用较低的照明功率。或者，可以设置暂停， 例如， 5 ms，用于扫描之间间隔，针对扩散极为缓慢的复合物 间隔 在 时间序列 子菜单
  9. 选择合适的激光功率， 例如， ~1-2 µW 488 nm 和约 5-10 µW 561 nm 激发。
    注意：较高的激光功率可提高信噪比，但会加剧光漂白。因此，应选择适当的激光功率，使光漂白程度低于初始计数率的50%。
  10. 设置 循环 至100,000-500,000。
    注意：扫描次数， 即， 测量持续时间可能有所不同：较长的测量时间可提高信噪比，更适合扩散较慢的分子，但细胞运动和光漂白效应会限制最长测量时间。本文所展示的数据通常采集时长为 ~3-6 分钟。 即， 200,000–400,000 次线扫描。
  11. 设置检测器为 光子计数 模式。按下 开始实验 开始采集。重复步骤 4.5–4.11 以测量另一个细胞。
    注意：建议在不同表达水平下，每份样品测量 10–15 个细胞。关键的避免在高表达水平下检测器饱和。最大计数率不应超过约 1 MHz。
  12. 若进行亮度分析以确定寡聚状态，应根据修改后的步骤4.1–4.11执行同源二聚体亮度校准测量：分别测量每种荧光蛋白同源二聚体（在使用第2部分方案制备的孤立细胞中），且仅在单一光谱通道中进行测量。

5. 扫描荧光交叉相关光谱：数据分析

注意：以下方案遵循先前文献中详细描述的分析流程的实施方案12,15。软件代码可向作者申请获取。

  1. 导出原始数据（例如， 将CZI文件转换为原始数据格式的RGB TIFF图像。该文件将包含一个双通道的荧光强度图，其中绿色和红色通道的数据分别对应于图像中标记为G和R的通道。
  2. 使用适当的分析软件导入TIFF文件，并进行分析。
    注意：以下步骤（步骤 5.3–5.7）需针对每个通道分别进行：
  3. 通过分段或移动时间平均法对500-1000行数据块进行对齐。确定膜的位置， 即， 每个区块中计数率最高的像素位置。将所有区块移动至相同的横向位置。该步骤可校正细胞-细胞接触的横向位移， 例如， 由于细胞运动。
  4. 沿时间轴对所有对齐的线条求和，并使用高斯函数拟合平均强度分布。当存在显著的细胞内背景时，采用高斯函数与S型函数的组合进行拟合。将膜位置 ±2.5σ 范围内的所有像素定义为膜区域像素，并对每条线中这些像素的强度求和，从而获得每个时间点的单一荧光信号值即， 每次线扫描）。
  5. 如有需要（例如， 背景 >在每1000行的区块中，通过从膜荧光信号中减去细胞质平均像素强度乘以2.5σ（以像素单位计）来校正背景信号（约为膜信号的10%）。选择背景像素时，应避开明亮的细胞内囊泡。
  6. 如果观察到光漂白现象，则需进行漂白校正。因此，使用双指数函数拟合膜荧光时间序列，并应用相应的校正公式（公式1）。16.
    注意：也可采用基于傅里叶谱的校正方法27. (关键的若存在光漂白但未进行校正，CF值可能会严重失真，参数估计可能出现显著偏差例如，参见 图5E).
  7. 根据公式2和公式3计算ACF和CCF，使用， 例如， 多重τ算法28为提高分析的可靠性并避免伪影，应对整个测量数据分成10–20个相等的片段进行计算。检查每个片段的荧光时间序列和相关函数（CFs），并剔除明显畸变的片段（参见示例于 图 4A- 4D）。对所有未失真的片段取平均值。
    注意：该步骤可实现自动化，以避免数据产生主观偏差29对于极不稳定的测量，采用许多较短的片段可能会有帮助。然而，片段长度仍应至少比扩散时间高出三个数量级，以避免统计采样不足的误差29,30,17.
  8. 将二维扩散模型（公式4）拟合到获得的CFs上。因此，将结构因子固定为校准测量（方案第3节）中获得的值。通过使用多重tau算法获得的每个数据点的统计权重进行加权拟合，可提高拟合的准确性。
  9. 根据公式7，利用校准后的束腰计算扩散系数。
  10. 通过将每个通道中的平均荧光强度除以相应的粒子数来计算分子亮度（公式8）。将各通道中测定的亮度值除以相应单体参考物的平均亮度进行归一化，以获得寡聚状态，并考虑非荧光荧光蛋白的影响。23为此，通过单色分析确定同源二聚体的平均亮度值，以计算非荧光荧光蛋白的比例23.
  11. 根据公式9计算相对互相关。

6. 交叉相关计数与亮度：探测器校准

注意：以下方案提供了关于如何校准检测系统的通用指南。此步骤对于模拟检测系统是必需的，但在使用真正的光子计数检测器时并非严格需要。

  1. 干燥适当的水溶性染料溶液（参见 材料表 在35 mm玻璃底培养皿中进行示例实验。相应调整光路设置， 即， 488 或 561 nm 激发，分别在 499-552 nm 或 570-695 nm 范围内检测。
    注意：也可使用反光金属表面替代干燥的染料溶液，将金属片直接放置在物镜上方即可。
  2. 进行单色N&在不同染料浓度区域或不同激光功率下进行 B 测量。因此，使用 缩放 以实现300 nm的像素尺寸， 扫描速度 设置合适的像素驻留时间， 例如， 25 µs 并设置 循环 100-200 帧
  3. 设置检测器为 光子计数 或 模拟模式 如果使用模拟检测进行测量，则按下 开始实验 开始采集。在零激发功率下进行测量，以确定强度偏移量。
  4. 将所有测量像素的像素方差对像素强度作图，并对这些数据进行线性拟合。以线性拟合的斜率确定增益 S。根据方程 14，利用 S 和确定的强度偏移量，由 y 轴截距计算读出噪声。

7. 交叉相关计数与亮度：数据采集

  1. 按照sFCCS采集方案的4.1-4.4步骤操作。
  2. 使用 作物 选择一个围绕细胞-细胞接触（或用于同源二聚体亮度对照的孤立质膜）的 512 × 128 像素的帧 缩放 以实现50-100 nm的像素尺寸。
  3. 使用 扫描速度 设置合适的像素驻留时间， 例如， 6.3 µs.
    注意：在 N&B，像素驻留时间应远小于目标蛋白的扩散时间。如果选择了其他激发方案， 例如， 每次切换轨道的时间间隔应小于目标蛋白的扩散时间，否则可检测到的交叉相关性会降低。
  4. 设置 循环 100-200 帧
    注意：较高的帧数可提高信噪比，但细胞运动可能限制总测量时间。每帧的扫描时间应远长于目标蛋白的扩散时间；否则，表观亮度会降低。 即， 颗粒似乎不移动。对于扩散非常缓慢的复合物，应暂停观察， 例如， 2 秒，帧间间隔使用 间隔 在 时间序列 子菜单
  5. 将激光功率设置为适当值（典型值约为 ~1-2 µW 488 nm 和约 5-10 µW 用于561 nm激发。
    注意：较高的激光功率可导致更高的亮度和更好的信噪比（SNR），但也会加剧光漂白。激光功率应足够高，以达到每个分子每秒至少约1 kHz的检测亮度，但又需保持足够低，以避免光漂白超过10–20%。对于mEGFP/mEYFP或mCherry/mCardinal，通常可将光漂白控制在10%以下。
  6. 设置检测器为 光子计数 或 模拟模式 如果使用模拟检测进行测量）。按下 开始实验 开始采集。
  7. 评估光子计数率。若细胞间接触区域像素的计数率超过1 MHz，应降低激光功率或选择表达水平较低的细胞。重复步骤7.2–7.7以测量下一对细胞。建议每次实验在不同表达水平下测量10–15对细胞。
  8. 若进行亮度分析以量化寡聚化程度，请根据修改后的步骤7.1–7.7执行同源二聚体亮度校准测量：分别测量每种荧光蛋白同源二聚体（在使用第2部分方案制备的孤立细胞中），且仅在一个光谱通道中进行测量。

8. 互相关计数与亮度：数据分析

注意：以下实验方案遵循先前描述的分析流程12,31。软件代码可应要求向作者索取。

  1. 导入原始数据（例如， CZI 文件可使用 Bioformats 导入32 包装）。对所有帧进行平均，并在细胞-细胞接触周围选择一个感兴趣区域（ROI）。
  2. 执行图像配准算法33, 例如， 通过在两个通道中对任意侧向平移进行平均，最大化后续帧中感兴趣区域（ROI）之间的空间相关性，从而校正细胞的侧向移动。
  3. 应用方波滤波器22 以减少源自外部的长寿命波动， 例如， 残余细胞运动或背景漂白。或者，可采用去趋势方法校正光漂白34.
    注意：若未进行分段分析或去趋势处理，表观亮度可能会被严重高估。
    1. 定义滑动片段 例如， 8 到 15 帧（例如， 1 至 8 帧、2 至 9 帧，依此类推）中，根据公式 10、11 和 15 对每个片段逐像素计算通道内和通道间交叉相关亮度值。若探测器并非真正的光子计数探测器，在计算亮度时应考虑校准后的探测器参数。 即， 改用公式12和13。
      注意：以8到15帧为片段计算亮度值会导致绝对亮度被低估10%–20%，颗粒数量被高估10%–20%。然而，亮度比值（例如， 二聚体与单体的亮度比值不受影响，前提是分析过程中片段长度保持恒定（数据未显示）。对于特定的片段长度，其统计误差可通过模拟计算进行确定，从而加以校正。
    2. 对所有片段的亮度值进行逐像素平均。在此步骤中，可从平均值中剔除亮度值最高和最低的5%，或排除因强度明显失真而受影响的片段。 例如， 一种在这些像素中短暂存在的细胞内囊泡或聚集体。
  4. 将像素亮度值作为像素强度的函数进行绘图，并选择对应于细胞-细胞接触的像素群体。背景像素的强度值非常低。此时，重新评估最大计数率。排除计数率高于1 MHz的像素，以防止堆积效应。
  5. 创建所选细胞-细胞接触像素的通道和互相关亮度直方图，并获取ROI平均亮度值。通过相应单体参考样品的平均亮度对通道平均亮度值进行归一化，以获得寡聚状态，同时考虑非荧光荧光蛋白的影响。23因此，通过单色分析确定同源二聚体的平均亮度值，以计算非荧光荧光蛋白的比例23.
  6. 例如，绘制通道和互相关亮度图。

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结果

蛋白质-蛋白质相互作用检测的初步实验 即， 表达光谱不同的荧光蛋白的细胞混合，随后进行sFCCS/ccN&B 测量（图1），应在那些不预期在细胞-细胞接触处发生相互作用的蛋白质上进行即， 阴性对照）。因此，将表达豆蔻酰化-棕榈酰化-mEYFP（myr-palm-mEYFP）或-mCardinal的HEK 293T细胞混合，并在细胞-细胞接触区域进行溶液荧光相关光谱（sFCCS）分析（图2A）。在理想情况下，由于蛋白质在质膜（PM）中的扩散运动以及焦体积内蛋白质分子数量的统计学波动，每个通道的荧光信号应围绕一个稳定的均值波动。对于不发生相互作用的蛋白质，两个通道中的波动彼此独立，因此光谱交叉相关性预期在零值附近波动。事实上，在典型的测量中观察到相对交叉相关性接近于零。图2C）。ACF 显...

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讨论

本文所述实验方法可用于研究细胞间接触处的蛋白质-蛋白质反式相互作用，采用荧光涨落光谱技术，即sFCCS和ccN&B。这些方法通过对两个相邻细胞接触处表达的、分别与目标蛋白融合的两种光谱可区分的荧光蛋白所发出的荧光信号涨落进行统计分析，来量化邻近细胞质膜中蛋白质共扩散的程度，从而检测反式复合物的存在。除详细的样品制备、数据采集与分析方案外，本文还提供了该方法成功应用于神经细胞黏附蛋白APLP1的研究证据。我们证明，APLP1在细胞间接触处发生特异性的同型反式相互作用。此外，锌离子可促进APLP1在细胞间接触处形成簇状结构，从而为反式相互作用提供多价平台，并增强反式结合能力。

与以往基于破坏性生化方法检测此类相互作用的检测技术相比6该方法可直接在活细胞上进行，无需固定或分离蛋白质复合物。此外，通过检测与目标蛋白基因融合的荧光蛋白，该方法可提供分子特异性和相关信息，与以往的定性检测方法不同。8

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了德国研究基金会（DFG）项目编号254850309的资助。作者感谢Madlen Luckner对稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM 培养基PAN-BiotechP04-01548
不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBSPAN-BiotechP04-36500
含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBSPAN-BiotechP04-35500
胰蛋白酶 EDTAPAN-BiotechP10-023100
TurboFect 转染试剂Thermo Fisher ScientificR0531
HEK 293T 细胞DSMZACC 635
Alexa Fluor 488 NHS 酯Thermo Fisher ScientificA20000
罗丹明 BSigma-Aldrich83689-1G
质粒 DNAAddgeneNA有关所有质粒的详细描述，请参见参考文献 12（Dunsing 等，MBoC 2017）
6 孔板StarlabCC7672-7506
35 mm 玻璃底培养皿CellVisD35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 共聚焦显微镜Carl ZeissNA
MATLAB 软件包MathWorks 2015b 
Neubauer 细胞计数板Marienfeld640110

参考文献

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273(2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634(2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494(2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073(2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487(2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412(2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545(2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

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一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法
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