本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即 位于活细胞细胞连接处的蛋白质。我们提供了有关仪器校准、数据采集与分析的详细指南，包括对可能产生伪影的来源进行校正的方法。
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本文内容
摘要
摘要
多种生物学过程涉及细胞间的相互作用，这些相互作用通常由位于相邻细胞界面处相互结合的蛋白质介导。目前，仅有少数检测方法能够特异性地直接探测活细胞中的此类相互作用。本文介绍一种用于测量相邻细胞表面表达的蛋白质在细胞-细胞接触区域结合情况的检测方法。该检测方法包括两个步骤：将表达目标蛋白（分别与不同荧光蛋白融合）的细胞混合，随后利用共聚焦激光扫描显微镜在细胞-细胞接触部位进行荧光涨落光谱测量。我们通过测量淀粉样前体样蛋白1（APLP1）在细胞间连接处的相互作用，验证了该方法在生物学相关背景下的可行性。本文提供了基于荧光技术的数据采集详细方案，包括扫描荧光互相关光谱、互相关计数与亮度分析，以及所需仪器校准步骤。此外，我们还讨论了数据分析中的关键步骤，以及如何识别并校正由光漂白或细胞运动等因素引起的外部干扰信号变化。
通常，该检测方法适用于同型或异型细胞间接触处的蛋白质-蛋白质相互作用，可用于相同或不同类型的细胞之间，并可在商用共聚焦激光扫描显微镜上实施。一个重要的要求是系统的稳定性，必须足够稳定，以在数分钟内探测目标蛋白质的扩散动力学。
引言
许多生物过程发生在细胞间相互作用的位点， 例如， 细胞间黏附1,2,3细胞-细胞融合4 以及细胞识别5此类事件在多细胞生物的发育过程以及细胞间通讯中尤为重要， 例如， 在免疫反应过程中，这些过程通常由定位于细胞表面的蛋白质介导。 即， 在邻近细胞的质膜（PM）上，并在细胞-细胞接触处发生特定的相互作用，这些相互作用在空间和时间上受到精确调控。在多数情况下，这些相互作用是直接的同源或异源蛋白质-蛋白质相互作用 转 相互作用，但也可能涉及作为细胞外连接物的离子或配体1尽管具有根本性的重要意义，但目前仍缺乏能够在活细胞天然环境中直接检测这些特定蛋白质-蛋白质相互作用的实验方法。许多技术手段都需要破坏细胞例如， 共免疫沉淀等生化实验6），固定（例如， 一些超分辨率光学显微技术与细胞间接触的电子显微镜观察7，或具有非特异性， 例如， 聚集/黏附实验8....
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方案
1. 样品制备：细胞间混合实验
注意：以下方案描述了贴壁细胞的混匀步骤。对于悬浮培养的细胞，可对此方案进行相应调整。
- 在6孔板上接种适量数量的细胞， 例如， 800,000 个 HEK 293T 细胞（使用血细胞计数板计数），在转染前一天接种。接种细胞数可根据接种至转染之间的时间间隔进行调整，并根据不同细胞类型进行相应优化。进行基础实验时（即， 目的蛋白和阴性对照），至少准备4个孔。将细胞接种培养于 37 °C，5% CO₂2 在添加了胎牛血清（10%）和 L-谷氨酰胺（1%）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中
- 按照制造商的说明转染细胞（参见 材料表).
- 为了进行一个基础实验，分别在不同的孔中转染编码目的蛋白与“绿色”荧光蛋白融合的质粒例如， 单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFP）或黄色荧光蛋白（mEYFP）或“红色”（例如， mCherry 或 mCardinal 荧光蛋白
注意：在本方案中，我们重点关注 APLP1-mEYFP 和 APLP1-mCardinal12，以及相应的阴性对照， 例如， 豆蔻酰化-棕榈酰化-mEYFP（myr-palm-mEYFP）和-mCardinal（myr-palm-....
- 为了进行一个基础实验，分别在不同的孔中转染编码目的蛋白与“绿色”荧光蛋白融合的质粒例如， 单体增强型绿色荧光蛋白（mEGFP）或黄色荧光蛋白（mEYFP）或“红色”（例如， mCherry 或 mCardinal 荧光蛋白
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结果
蛋白质-蛋白质相互作用检测的初步实验 即， 表达光谱不同的荧光蛋白的细胞混合，随后进行sFCCS/ccN&B 测量（图1），应在那些不预期在细胞-细胞接触处发生相互作用的蛋白质上进行即， 阴性对照）。因此，将表达豆蔻酰化-棕榈酰化-mEYFP（myr-palm-mEYFP）或-mCardinal的HEK 293T细胞混合，并在细胞-细胞接触区域进行溶液荧光相关光谱（sFCCS）分析（图2A）。在理想情况下，由于蛋白质在质膜（PM）中的扩散运动以及焦体积内蛋白质分子数量的统计学波动，每个通道的荧光信号应围绕一个稳定的均值波动。对于不发生相互作用的蛋白质，两个通道中的波动彼此独立，因此光谱交叉相关性预期在零值附近波动。事实上，在典型的测量中观察到相对交叉相关性接近于零。图2C）。ACF 显.......
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讨论
本文所述实验方法可用于研究细胞间接触处的蛋白质-蛋白质反式相互作用，采用荧光涨落光谱技术，即sFCCS和ccN&B。这些方法通过对两个相邻细胞接触处表达的、分别与目标蛋白融合的两种光谱可区分的荧光蛋白所发出的荧光信号涨落进行统计分析，来量化邻近细胞质膜中蛋白质共扩散的程度，从而检测反式复合物的存在。除详细的样品制备、数据采集与分析方案外，本文还提供了该方法成功应用于神经细胞黏附蛋白APLP1的研究证据。我们证明，APLP1在细胞间接触处发生特异性的同型反式相互作用。此外，锌离子可促进APLP1在细胞间接触处形成簇状结构，从而为反式相互作用提供多价平台，并增强反式结合能力。
与以往基于破坏性生化方法检测此类相互作用的检测技术相比6该方法可直接在活细胞上进行，无需固定或分离蛋白质复合物。此外，通过检测与目标蛋白基因融合的荧光蛋白，该方法可提供分子特异性和相关信息，与以往的定性检测方法不同。8
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了德国研究基金会（DFG）项目编号254850309的资助。作者感谢Madlen Luckner对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM 培养基 | PAN-Biotech | P04-01548 | |
| 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBS | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| 含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBS | PAN-Biotech | P04-35500 | |
| 胰蛋白酶 EDTA | PAN-Biotech | P10-023100 | |
| TurboFect 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| HEK 293T 细胞 | DSMZ | ACC 635 | |
| Alexa Fluor 488 NHS 酯 | Thermo Fisher Scientific | A20000 | |
| 罗丹明 B | Sigma-Aldrich | 83689-1G | |
| 质粒 DNA | Addgene | NA | 有关所有质粒的详细描述，请参见参考文献 12（Dunsing 等，MBoC 2017） |
| 6 孔板 | Starlab | CC7672-7506 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | CellVis | D35-14-1.5-N | |
| Zeiss LSM780 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | NA | |
| MATLAB 软件包 | MathWorks | 2015b | |
| Neubauer 细胞计数板 | Marienfeld | 640110 |
参考文献
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
- Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
- Harris, T. J. C., Tepass, U.
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