一种基于微 ct 的小动物脑损伤和定位电极表征方法

Summary

本文介绍了一种简单的方法来准备小动物大脑的微 ct 成像, 其中病变可以量化和电极定位在整个大脑的上下文中具有较高的精度。

Abstract

损伤和电极位置验证传统上是通过对染色脑片的组织学检查来完成的, 这是一个耗时的过程, 需要手动估计。在这里, 我们描述了一种简单、直接的方法, 用于量化大脑中的病变和定位电极, 这种方法不那么费力, 产生更详细的结果。整个大脑被雷亚铁污染, 嵌入树脂中, 并用微型 ct 扫描仪成像。扫描结果是大脑的3d 数字体积, 其分辨率和虚拟截面厚度取决于样本大小 (大鼠和斑马雀的每体素分别为12–15和 5-6μm)。表面和深层病变可以被定性, 单型或状物、四极体阵列、电解损伤和硅探针也可以局部化。自由和专有的软件允许实验者从任何平面上检查样品体积, 并手动或自动分割体积。由于这种方法产生整个大脑体积, 病变和电极的量化程度远远高于目前的方法, 这将有助于规范研究内部和研究之间的比较。

Introduction

神经学家长期依靠病变来了解大脑中的功能和位置之间的关系。例如, 我们对海马体是学习和记忆所不可缺少的理解, 对前额叶皮层作为冲动控制的关键的理解, 都是人类^1,2的意外病变的产物。然而, 动物模型的使用, 使神经科学家能够通过超越偶然来利用病变的力量, 通过对结构-功能关系的系统研究, 已经阐明了无数大脑区域的功能。病变^3,4。

然而, 要正确地将功能分配给结构, 病变研究需要精确的量化程序, 这是一个一直缺乏的领域。目前用于定量病变的金标准是用光学显微镜对大脑进行分割、安装和成像。然后将成像切片与地图集上最接近的部分进行匹配, 并间接报告受试者之间病变的大致坐标, 通常是通过使用相机 lucida 图像或组织切片^{3,4 示例 ,5,6,7,8,9, 10.}

除了目前病灶定量程序的不精确, 这些技术是耗时和容易失败。大脑僵硬、刀片锐度和温度的微小变化会导致部分出现错误、扭曲或撕裂。由于安装介质中的气泡, 截面也会不均匀地染色和成像不当。重要的是, 在切片时, 病变在大脑中的位置的三维上下文丢失, 使大脑中病变的精确三维重建具有挑战性。

病变的另一个常见应用是确定大脑中单个和多个电极记录的位置。在最后的记录结束时, 研究人员在电极尖端诱导小的电解质病变, 并按照常规病变实验11的方式处理大脑的组织学^.这种技术也有上述相同的缺点, 还有其他问题, 即电解质病变通常比用来制造电解质病变的电极大, 但通常足够小, 很难找到组织学上的东西。当插入多个电极时, 如四极阵列的情况下, 通过电解损伤进行验证更具挑战性。电解病变的另一种选择是在电极上使用染料来验证后的组织学 12, 但这种技术也有传统组织学的缺点。

在这里, 我们深入地描述了最近描述的方法¹³基于染色技术的电子显微镜 (em) 和 x 射线计算机断层扫描 (微 ct), 量化病变和定位电极的小动物大脑比目前更好方法。微 ct 是一种成像技术, 在这种技术中, x 射线拍摄于360°旋转的样品, 而闪烁器收集的 x 射线不会被样品偏转。其结果是对样品进行高分辨率的数字3d 重建, 可以在任何方向上进行可视化并精确量化。许多学术机构都有微型 ct 扫描仪, 这些扫描仪也可在商业上买到。

Protocol

哈佛机构动物护理和使用委员会对动物的所有护理和实验操作进行了审查和批准。这里描述的灌注是特定的大鼠, 但该程序适用于任何动物与较小或类似大小的大脑。

1. 灌注

1. 准备1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。对于大鼠 (年龄: 0.5–1.5 岁, 体重: 250–600克), 800–1000毫升应该足够了。使用400毫升的动物和额外的400毫升稀释固定剂。
2. 在 1x pbs 中制备由 2% (w/v) 和 2.5% (w/v) 戊二醛 (ga) 组成的固定剂。对于老鼠来说, 400 毫升就足够了。在50毫升的锥形管中保存50毫升, 用于灌注后大脑的固定后。
3. 用4-5% 异氟烷气体 (在 21°c 1.0 bar 时 0.8 l/min o₂ ) 对大鼠进行15分钟的麻醉。
4. 注射致命剂量的戊巴比妥钠腹腔内 (180 mg/kg)。
5. 通过进行脚趾夹紧反射检查来测试动物的反射损失。等待开始灌注, 直到动物失去了反射反应。
6. 遵循前面描述的心内灌注和大脑提取方案14与以下解决方案^:在125毫米汞的情况下, 用400毫升的 1x pbs 给动物注入水, 以去除血液。一旦所有血液都被取出并替换为 1x pbs, 开始用400毫升的溶液注入 2% pfa 和 2.5% ga 溶解在 1x pbs 125 毫米汞。
   注: 如果该程序是在不是大鼠的动物身上进行的, 灌注过程的唯一重要组成部分是在 1x pbs 中使用 1x pbs 和 2% pfa, 2.5% ga。溶液体积和灌注压力可根据物种进行调整。

2. 固定后

1. 将提取的大脑放入2% 的 pfa, 2.5% ga 在 1x pbs 溶液中 (以前用于灌注动物的相同溶液)。确保溶液体积至少是大脑体积的10倍。对于老鼠, 将大脑放置在一个50毫升的锥形管, 溶液为50毫升。将样品存放在固定后 2-3天, 在4°c 下轻轻晃动。
   注: 如果样品位于50毫升锥形管中, 将其水平放置在轨道振动台上将确保最佳结果。
2. 在样品经过足够长的时间后固定后, 用双蒸馏水 (ddh2o)、去离子水 (dih2o) 或超纯水 (见材料表) 清洗样品, 持续时间如下: 1、1、1和15分钟。
   注: 对于本协议, ddh2o、dih2o_或超纯水应该是可互换的。为了简单起见, ddh2o 将被用来指从今以后的纯净水.

3. 染色

注意: 在此步骤中, 使用手套时, 请在引擎盖下进行所有解决方案准备。

1. 准备至少10倍于大脑体积的染色液。对于大鼠的大脑, 将股票的25毫升 4% oso4 溶液和25毫升的 ddh2o 溶液结合起来, 制备出四氧化二酸 2% (oso4) 中的 50毫升.
   注意: 四氧化二铵是挥发性的, 如果处理不当, 可能会导致暂时失明和呼吸问题。将与四氧化二铬接触的所有材料丢弃在辅助容器内的适当化学危险容器中。
2. 将大脑放入一个新的50毫升锥形管, 并添加 oso₄溶液。当 oso₄与组织中的脂质发生反应时, 大脑应该开始变成棕色。
3. 关闭管并用石蜡膜 (见材料表) 彻底密封, 以确保其在孵育过程中不会泄漏。
   注: 铬是挥发性的, 会与管的塑料温和反应, 所以正确密封管是非常重要的。管可以用铝箔包裹, 以增加保护。
4. 将密封管存放在 4°c, 在50转/分的轨道振动台上轻轻晃动2周。将管水平放置, 以确保最佳的混合。在晃动时, 确保样品完全淹没在溶液中。
   注: 如果不允许铬连续循环, 它可能不能完全穿透样品, 所以水平放置在振动筛上是非常重要的。

4. 嵌入

1. 在 oso₄中孵育2周后, 在室温下用 ddh2o5 次(rt) 清洗, 时间为1、1、1、15和 60分钟, 以去除样品中所有未绑定的 oso₄ 。
   注: 多个交换, 包括最后60分钟的交换, 是必要的, 以允许循环系统中的所有铬扩散。
2. 在4°c 下, 用 ddh2o_清洗样品30分钟。
   注: 可能会继续从样品中扩散出去, 但其数量应从上一步大幅减少。
3. 用乙醇使样品脱水, 最终用树脂浸润样品。要脱水, 请将 ddh_{2o 改为}10–20 ml 的以下乙醇稀释剂 (4°c 时各 30分钟): 20% (v/v) 乙醇和 80% (v/v) ddh 2o_;50% (v2) 乙醇和 50% (v/v) ddh 2o;70% (v2) 乙醇和 30% (v/v) ddh 2o;90% (v2) 乙醇和 10% (v/v) ddh 2o;100% 乙醇。
4. 准备丙酮/树脂稀释剂, 如下所示。
   1. 根据制造商的说明准备100毫升的树脂进行嵌入 (见材料表)。
   2. 使33% 树脂-67% 丙酮溶液, 将15毫升树脂倒入50毫升锥形管中, 加入30% 的100% 玻璃蒸馏丙酮。
   3. 为了使50% 树脂-50% 丙酮, 将 22.5 ml 树脂倒入50毫升锥形管中, 加入 22.5 ml 100% 玻璃蒸馏丙酮。
   4. 使67% 树脂-33% 丙酮溶液, 将30毫升树脂倒入50毫升锥形管中, 加入15% 的100% 玻璃蒸馏丙酮。
   5. 使用剩余的32.5 毫升树脂作为100% 以下树脂的第一溶液。
5. 通过以下丙酮和丙酮树脂稀释剂的 10-20 ml 将样品移动到树脂渗透过程中: 100% 丙酮在4°c 下 30分钟;在4°c 下, 100% 丙酮 30分钟;和100% 丙酮在室温下 30分钟 (rt)。
   注: 其余的渗透过程将在 rt 进行。
6. 将样品浸泡在 33% (v/v) 树脂67% 丙酮 3小时 at rt, 然后将50% 树脂 (v/v) 树脂-50% 丙酮在 rt 3小时, 67% (v/v) 树脂33% 丙酮 (3 ~ 3 在 rt), 100% 树脂在 rt 为 12 h。
7. 按照瓶子上的说明, 制作新鲜的50毫升树脂。将样品转移到将固化的容器中 (例如,材料表中描述的一次性模具)。在 rt 为样品注入新鲜的100% 树脂4小时。
   注: 如果不使用新鲜树脂, 前一天制成的树脂将开始过早变硬, 样品将难以操作。
8. 在45°c 的真空烤箱中对样品进行15分钟的脱脂。
   注: 此步骤将有助于去除样品中的任何被困气泡, 但它不是必需的, 不会影响数据的质量。
9. 最后, 在60°c 的烤箱中固化48小时的样品。

5. 微 ct

1. 样品固化后, 将一次性模具剥离, 并用微型 ct 机器进行扫描。
   注: 根据所使用的计算机, 设置将有所不同。对于材料表中列出的作者使用的扫描仪, 推荐的设置为130千伏、135μa, 带有 0.1 mm 的铜过滤器和钼源, 曝光 1秒, 平均每个投影4帧。但是, 实验者应单独校准扫描仪, 因为许多因素会影响特定会话期间的最佳设置。
2. 扫描完成后, 使用实验者的扫描器/软件组合在计算机上使用扫描仪软件重建样品。
3. 最后, 使用实验者选择的软件对重建后的数字卷进行可视化和分析 (例如, 请参见材料表)。

Results

传统上, 大脑被分割和染色, 以量化病变和定位电极, 但这种方法是容易出错, 劳动密集型, 通常需要估计结果。通过为微 ct 成像准备整个大脑, 极大地降低了破坏样本的概率, 可以在整个大脑的上下文中分析感兴趣的特征, 该方法可以极大地同时对许多样本进行并行处理加快样品制备速度。

该方法包括四个主要步骤: (1) 用四氧化铬染色灌注脑, (2) 将大脑嵌入树脂中, (3) 用微型 ct 扫描仪成像大脑, (4) 分析由此产生的数字体积 (图 1)。在本文中, 仅介绍了步骤 1–3, 因为步骤 4 (分析) 将根据项目的特定需要而有很大差异。

而在必须事先选择一个切片方向的传统切片中, 由此产生的数字卷可以在三个维度中进行操作, 并在任何方向上几乎切片 (

Discussion

以下是协议的关键步骤: 首先, 使用 pfa 和 ga 的组合来灌注动物, 然后在修复后的大脑是至关重要的, 以实现对组织的一致的充分渗透。虽然我们没有明确地测试这一点, 一个合理的解释是, pfa 固定是可逆^{的 15}, 而 ga 固定是不可逆的^16,17。由于在四氧化铬中完全浸润组织需要两周的孵育, 因此大脑内部的 pfa 可能会扩散, 而在染色过程中组织会退化。因此, 铬不能保存内部结构。

使用铬水, 而不是溶解在缓冲液中的铬,是绝对必要的, 以确保完全的组织渗透的铬。即使经过6周的孵育, 溶解在仙人掌酸钠中的铬也没有完全浸润组织, 似乎遇到了扩散屏障 (图 6)。对脂质反应极大, 被认为能将脂质结合^{在细胞膜18、19}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
多聚甲醛 （PFA）	电子显微镜科学 （EMS）	15710	2% （w/v/） 溶于 1X PBS
戊二醛 （GA）	EMS	16220	2.5% （w/v） GA 溶于 1x PBS
OsO4	EMS	19190	在通风橱中工作
乙醇	Decon Labs	Koptec	140、190、200 认证
丙酮	EMS	10015	玻璃蒸馏
Durcupan ACM 树脂	Sigma-Aldrich	44610	A、B、C 和 D 组件，用于包埋的树脂
一次性模具	Ted Pella	27114	建议的
milliQ 水（超纯水）	Millipore Sigma	QGARD00R1（或相关净化器）	建议的
石蜡膜（石蜡膜）	Millipore Sigma	P7793	建议的石蜡膜
显微 CT 扫描仪	Nikon Metrology Ltd.， Tring， UK	X-Tek HMS ST 225	作者使用
用于可视化和分析显微 CT 扫描的软件：
	Volume 图形	VG Studio Max	作者使用
	FEI / Thermo Scientific
	FEI / Thermo Scientific	Amira	类似于 Avizo
	Mark Sutton &Russell Garwood	Spiers	免费、http://spiers-software.org/
	Pixmeo Sarl	Osirix Lite	免费、https://www.osirix-viewer.com/
	开源	FIJI	免费、https://fiji.sc/
	Adobe	Photoshop	适合一次分析一个切片