方法文章

一种基于显微CT的小动物脑部病变表征与电极定位方法

7.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58585

⸱

2018年11月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Center for Brain Science, Harvard University, 3Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 4Institute of Science and Technology Austria

本文内容

摘要

本文介绍了一种制备小型动物脑组织以进行显微CT成像的简便方法，该方法可在全脑背景下高精度地量化损伤并定位电极。

摘要

病灶和电极位置的验证传统上通过以下方式进行 通过 对染色脑切片进行组织学检查是一项耗时的程序，需要手动估算。本文介绍一种简单直接的方法，用于量化脑损伤并定位脑内电极，该方法劳动强度更低，且能提供更详细的结果。完整脑组织经四氧化锇染色后包埋于树脂中，并使用微型CT扫描仪成像。扫描结果获得脑组织的三维数字体积数据，其分辨率和虚拟切片厚度取决于样本大小（12–15 和 5–6 µm） 分别为大鼠和斑胸草雀脑组织提供了单个体素级别的分辨率）。该方法可对表面及深层病灶进行表征，并能精确定位单根四极电极、四极电极阵列、电解损伤灶以及硅探针。研究人员可利用开源或商业软件，从任意切面观察样本体积，并对手动或自动分割体积进行分析。由于该方法能够生成完整的大脑体积图像，对病灶和电极的量化程度远高于现有技术，有助于在研究内部及跨研究之间实现标准化比较。

引言

神经科学家长期以来依赖脑损伤来理解大脑功能与位置之间的关系。例如，我们认识到海马体对学习和记忆至关重要，而前额叶皮层在冲动控制中起关键作用，这两者均源于人类偶然发生的脑损伤案例1,2。然而，动物模型的使用使神经科学家能够超越偶然性，系统地利用脑损伤来研究脑结构与功能之间的关系，从而揭示了无数脑区的功能3,4。

然而，为了将功能准确地归因于特定结构，损毁研究需要精确的定量分析方法，而这一领域目前尚显不足。当前定量分析损毁区域的金标准是将脑组织切片、贴片后使用光学显微镜成像。随后将所获得的图像切片与图谱中最接近的参考切片进行比对，并间接报告各受试者之间损毁区域的大致坐标，这种报告通常借助透射绘图仪（camera lucida）图像或典型的组织学切片示例来完成3,4,5,6,7,8,9,10。

除了当前病灶定量方法的不精确性外，这些技术还耗时且容易失败。脑组织硬度、刀片锋利程度和温度的微小变化都可能导致切片失败、扭曲或撕裂。此外，由于封片介质中存在气泡，切片还可能出现染色不均或成像不当的情况。更重要的是，一旦进行切片，病灶在脑内原有的三维空间位置信息即告丢失，使得对脑内病灶进行精确的三维重建变得困难。

另一种常见的损毁应用是确定脑内单个或多个电极记录的位置。在最后一次记录结束后，研究人员会在电极尖端诱导微小的电解损毁，并像传统损毁实验一样对脑组织进行组织学处理11。该技术存在上述相同的缺点，此外还存在其他问题：电解损毁的范围通常大于制造它的电极，但又通常小到在组织学上难以定位。当插入多个电极时（例如使用四极电极阵列），通过电解损毁进行验证就更加困难。替代电解损毁的一种方法是在电极上使用染料，以便后续通过组织学方法进行验证12，但该技术同样存在传统组织学所固有的缺点。

本文深入描述了一种近期提出的方法13，该方法基于电子显微镜（EM）和X射线计算机断层扫描（micro-CT）的染色技术，能够比现有方法更准确地定量脑损伤并定位小型动物脑内的电极。Micro-CT是一种成像技术，通过将X射线照射到样品上，同时使样品旋转360°，由闪烁体收集未被样品偏转的X射线信号。最终获得样品的高分辨率数字三维重建图像，可从任意方向进行可视化，并实现精确量化。许多学术机构均配备micro-CT扫描仪，该设备也可通过商业途径获取。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物的护理和实验操作均经过哈佛大学机构动物护理和使用委员会审查并批准。此处描述的灌注方法适用于大鼠，但该操作程序也可用于任何具有较小或类似大小脑组织的动物。

1. 灌注

  1. 配制1×磷酸盐缓冲液（PBS）。对于一只大鼠（年龄：0.5–1.5岁，体重：250–600 g），准备800–1,000 mL即可。使用400 mL用于动物灌流，另取400 mL用于稀释固定液。
  2. 配制含2%（w/v）多聚甲醛（PFA）和2.5%（w/v）戊二醛（GA）的1×PBS固定液。对于一只大鼠，400 mL已足够。另取50 mL置于50 mL锥形管中，用于灌流后脑组织的后固定。
  3. 使用4–5%异氟烷气体（在21 °C、1.0 bar条件下以0.8 L/min流速通入O2）对大鼠麻醉15分钟。
  4. 腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠（180 mg/kg）。
  5. 通过脚趾夹捏反射测试判断动物是否丧失反射反应。待动物完全丧失反射后，再开始灌流操作。
  6. 按照先前描述的心内灌流与脑组织提取方案14进行操作，使用以下溶液：先以125 mm Hg压力灌注400 mL 1×PBS以清除血液；待血液完全被1×PBS替代后，再以相同压力灌注400 mL含2% PFA和2.5% GA的1×PBS溶液。
    注意：若实验对象非大鼠，灌流过程中关键试剂仍为1×PBS以及含2% PFA、2.5% GA的1×PBS溶液；溶液用量和灌流压力可根据物种不同适当调整。

2. 后固定

  1. 将取出的脑组织置于含2% PFA和2.5% GA的1×PBS溶液中（与先前灌注动物所用溶液相同）。确保溶液体积至少为脑组织体积的10倍。对于大鼠，将脑组织放入50 mL锥形管中，并加入50 mL固定液。在4 °C条件下轻轻振荡，后固定保存2–3天。
    注意：如果样品置于50 mL锥形管中，将其水平放置在轨道摇床上可确保最佳效果。
  2. 样品充分后固定后，用双蒸水（ddH₂O）冲洗样品2O)，去离子水（diH2O）或超纯水（参见 材料表）分别进行 1、1、1 和 15 分钟，共四次。
    注意：本方案中，ddH₂O2O, diH2O 或超纯水应可互换使用。为简便起见，ddH2O 将用于指代纯化水。

3. 染色

注意：此步骤中，所有溶液的配制均须在通风橱内进行，并佩戴手套。

  1. 准备至少10倍于脑组织体积的染色液。对于大鼠脑组织，准备50 mL的2%（w/v）四氧化锇（OsO₄）溶液。4) 在 ddH₂O 中2O 通过将25 mL 储存的4% OsO4 溶液和 25 mL ddH₂O2O.
    警告：四氧化锇具有挥发性，若操作不当，可能导致暂时性失明和呼吸系统问题。所有接触过四氧化锇的材料均须置于适当的化学危险品容器中，并置于次级容器内丢弃。
  2. 将脑组织放入一个新的50 mL锥形管中，并加入OsO₄4 溶液。大脑组织应开始变为棕色，因为OsO₄4 与组织中的脂质发生反应。
  3. 关闭管盖，并用石蜡膜彻底密封（参见 材料表以确保孵育过程中无泄漏。
    注意：锇具有挥发性，会与试管的塑料发生轻微反应，因此必须妥善密封试管。为提供额外保护，可用铝箔包裹试管。
  4. 将密封的试管置于4 °C保存，在50 rpm条件下于摇床中水平轻摇2周，以确保充分混匀。振荡过程中应确保样品完全浸没于溶液中。
    注意：如果锇不能持续循环，可能无法完全渗透样本，因此在摇床上水平放置非常重要。

4. 包埋

  1. 样品经OsO₄孵育后4 2周后，用ddH₂O冲洗2在室温（RT）下用 O 洗涤 5 次，每次持续时间分别为：1、1、1、15 和 60 分钟，以去除所有未结合的 OsO₄4 在样品中。
    注意：多次更换，包括最后一次60分钟 交换是必要的，以使循环系统中的全部锇能够扩散出来。
  2. 用ddH₂O洗涤样品24 °C 下孵育 30 分钟
    ​注意：锇可能仍会从样品中继续扩散，但其含量应较前一步骤显著减少。
  3. 用乙醇对样品进行脱水，以便最终用树脂浸透。脱水时，用乙醇逐步置换ddH₂O。2用以下乙醇稀释液在 4 °C 下各孵育 30 分钟，每次使用 10–20 mL：20% (v/v) 乙醇和 80% (v/v) ddH₂O2O；50% (v/v) 乙醇和50% (v/v) 去离子水2O；70% (v/v) 乙醇和30% (v/v) 去离子水2O；90% (v/v) 乙醇和10% (v/v) 去离子水2O；100% 乙醇
  4. 按如下步骤配制丙酮/树脂梯度稀释液。
    1. 准备100 mL用于包埋的树脂（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。
    2. 配制33%（v/v）树脂-67%丙酮溶液时，将15 mL树脂加入50 mL锥形管中，再加入30 mL 100%玻璃蒸馏丙酮。
    3. 将22.5 mL树脂加入50 mL锥形管中，再加入22.5 mL 100%玻璃蒸馏丙酮，配制成50%（v/v）树脂-50%丙酮溶液。
    4. 配制67%（v/v）树脂-33%丙酮溶液时，将30 mL树脂倒入50 mL锥形管中，加入15 mL 100%玻璃蒸馏丙酮。
    5. 使用剩余的32.5 mL树脂作为以下100%树脂的第一种溶液。
  5. 通过以下丙酮及丙酮/树脂稀释液，对样品进行10–20 mL的树脂渗透处理：4 °C条件下100%丙酮处理30分钟；4 °C条件下100%丙酮处理30分钟；室温（RT）条件下100%丙酮处理30分钟。
    注意：后续的浸润过程将在室温下进行。
  6. 将样品浸入33% (v/v) 树脂-67% 丙酮中，在室温下孵育3小时，随后在室温下依次用50% (v/v) 树脂-50% 丙酮处理3小时、67% (v/v) 树脂-33% 丙酮处理3小时，最后用100% 树脂在室温下处理12小时。
  7. 按照瓶子上的说明制备50 mL新鲜树脂。将样品转移至用于固化的容器中（例如，文中所述的一次性模具 材料表用新鲜的100%树脂在室温下浸透样品4小时。
    注意：若未使用新鲜树脂，前一天制备的树脂会过早硬化，导致样品难以操作。
  8. 在45 °C下，将样品置于真空烘箱中脱气15分钟。
    注意：此步骤有助于去除样品中残留的气泡，但并非必需，不会影响数据质量。
  9. 最后，将样品置于60 °C的烘箱中固化48 h。

5. 微型计算机断层扫描（micro-CT）

  1. 样品固化后，撕下一次性模具，用微CT扫描仪进行扫描。
    注意：根据所用仪器的不同，设置参数会有所差异。对于本文所列作者使用的扫描仪，其参数设置如下 材料表推荐的扫描参数设置为130 kV、135 µA，使用0.1 mm铜滤光片和钼光源，曝光时间为1秒，每个投影平均采集4帧图像。然而，由于多种因素会影响特定实验过程中的最佳设置，实验人员应针对扫描仪进行个体化校准。
  2. 扫描完成后，在配备扫描仪软件的计算机上，使用针对实验者所用扫描仪/软件组合推荐的参数对样品进行重建。
  3. 最后，使用研究者选择的软件对重建的数字体积进行可视化和分析（参见 材料表 （例如）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

传统上，大脑需要经过切片和染色以定量分析病变并定位电极，但这种方法容易出错、劳动强度大，且通常需要对结果进行估算。通过制备完整大脑用于显微CT成像，可显著降低样本损伤的概率，感兴趣特征可在全脑背景下进行分析，且该方法适用于多个样本的并行处理，从而大大加快样本制备速度。

该方法包括四个主要步骤：（1）用四氧化锇对灌注后的脑组织进行染色，（2）将脑组织包埋在树脂中，（3）使用显微CT扫描仪对脑组织进行成像，以及（4）分析所得的数字体积数据（图1）。本文仅描述步骤1–3，因为步骤4（分析）将根据具体项目需求而有显著差异。

传统切片需要预先确定单一的切片方向，而本方法获得的数字体积数据可在三维空间中进行操作，并能以任意方向进行虚拟切片（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

以下步骤对于本实验方案至关重要：首先，使用PFA和GA的组合对动物进行灌注，随后对脑组织进行后固定，这是实现组织中锇酸盐完全且稳定渗透的关键。尽管我们未对此进行明确验证，但一个合理的解释是，PFA固定是可逆的15，而GA固定则不可逆16,17。由于组织完全浸润四氧化锇需要两周的孵育时间，脑组织内部的PFA可能在此期间扩散出来，导致组织降解。因此，锇酸盐无法有效保存脑组织内部的结构。

使用水溶液中的锇，而非溶解于缓冲液中的锇 即， 二甲胂酸钠）对于确保锇对组织的充分渗透至关重要。即使经过6周的孵育，溶解在二甲胂酸钠中的锇仍未能完全渗透组织，似乎遇到了扩散屏障。图6）。锇对脂质具有极强的反应性，被认为可与细胞膜中的脂质结合18,19

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Greg Lin 和 Arthur McClelland 在微计算机断层扫描（micro-CT）仪器使用方面的专业支持，感谢哈佛医学院图像与数据分析中心（IDAC）的 David Richmond 和 Hunter Elliott 在图像处理方面的建议，以及感谢波士顿大学的 William Liberti 慷慨提供斑胸草雀脑组织。本研究部分在哈佛大学所属的纳米尺度系统中心（CNS）完成；CNS 是国家纳米技术协调基础设施网络（NNCI）的成员，由美国国家科学基金会（NSF）资助（项目编号 1541959）。本研究得到了 Richard 和 Susan Smith 家族基金会以及美国情报高级研究计划局（IARPA）（合同号 D16PC00002）的支持。S.B.E.W. 获得了人类前沿科学计划（HFSP；LT000514/2014）和欧洲分子生物学组织（EMBO；ALTF1561-2013）博士后奖学金的资助。G.G. 获得了美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金项目（GRFP）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
多聚甲醛（PFA）Electron Microscopy Sciences (EMS)157101× PBS 中 2% (w/v)
戊二醛（GA）EMS162201× PBS 中 2.5% (w/v) 戊二醛
OsO4EMS19190在通风橱中操作
乙醇Decon LabsKoptec140、190、200 证明度
丙酮EMS10015玻璃蒸馏
Durcupan ACM 包埋树脂Sigma-Aldrich44610包含 A、B、C 和 D 组分，用于包埋的树脂
一次性模具Ted Pella27114推荐使用
超纯水（milliQ 水）Millipore SigmaQGARD00R1（或相关纯化系统）推荐使用
Parafilm（石蜡膜）Millipore SigmaP7793推荐使用的石蜡膜
显微CT扫描仪Nikon Metrology Ltd., Tring, UKX-Tek HMS ST 225作者所用设备
用于可视化和分析显微CT扫描的软件：
Volume GraphicsVG Studio Max作者所用软件
FEI / Thermo ScientificAvizo作者所用软件
FEI / Thermo ScientificAmira功能与 Avizo 类似
Mark Sutton & Russell GarwoodSpiers免费软件，http://spiers-software.org/
Pixmeo SarlOsirix Lite免费软件，https://www.osirix-viewer.com/
开源FIJI免费软件，https://fiji.sc/
AdobePhotoshop适用于逐层分析图像

参考文献

  1. Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
  2. Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
  3. Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
  4. Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
  5. Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
  6. Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
  7. Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
  8. Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
  9. Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
  10. Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
  11. Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
  12. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
  13. Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184(2018).
  14. Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564(2012).
  15. Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
  16. Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
  17. Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
  18. Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
  19. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  20. Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
  21. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
  22. Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
  23. Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
  24. Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974(2015).
  25. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
  26. Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833(2016).
  27. Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  28. Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
  29. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
  30. Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
  31. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
  32. Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
  33. Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
  34. Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章