本方案提供了一种基于Fiji的、用户友好的方法，并附有简明的说明，解释如何可靠地分析单个细胞和弯曲上皮组织中的肌动球蛋白行为。遵循本教程无需编程技能；所有步骤均通过Fiji的图形用户界面及其相关插件以半交互方式进行。
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方法文章
利用培养细胞延时成像分析局部细胞与组织尺度下的肌动球蛋白动力学 黑腹果蝇 卵室
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
Drosophila 的未成熟卵称为卵室，其结构类似于原始器官，在发育过程中会经历从圆形到椭圆形的形态变化。这一发育过程称为卵发生，对于产生具有功能的成熟卵子以确保下一代果蝇的繁衍至关重要。因此，卵室一直是研究动物器官发育的理想且相关的模型。
已开发出多种体外培养方案，但这些方案存在若干缺点。其中之一是使用各种盖片对成像的卵室施加人为压力，以固定卵室并增加所分析卵室圆周表面的成像获取平面。这种方法可能对产生驱动力使卵室沿其长轴旋转的细小肌动球蛋白装置的行为产生负面影响。
因此，为了克服这一局限性，我们将 Drosophila 卵室在培养基中进行游离培养，以便可靠地分析卵室周长上的肌动球蛋白装置。在本实验方案的第一部分，我们提供了一份操作手册，详细说明如何在局部细胞尺度（最多15个细胞）的有限成像平面内分析肌动球蛋白装置。在方案的第二部分，我们向用户提供了一个基于Fiji的新插件，该插件可简单地提取卵室周向表面的特定薄层。随后的实验流程进一步描述了如何在组织尺度（>50个细胞）上分析肌动球蛋白信号。最后，我们指出了这些方法在局部细胞尺度和组织尺度上的局限性，并探讨了其未来可能的发展方向与应用前景。
引言
新型成像技术和软件技术在生命科学领域的持续发展，极大地推动了人们对生命基本原理的理解。其中一个主要挑战是，如何可靠地可视化发育过程，并结合对各种组织的活体成像。组织是器官和生物体的组成部分，因此大多数组织难以直接进行成像观察。为此，研究人员已开发出相应的实验方案，通过对组织进行解剖并进行体外培养，以可视化能够充分反映活体生物体内真实情况的生物学事件。
几十年来，对类似于原始器官的果蝇（Drosophila）卵泡（具有腺泡样结构）进行培养和活体成像，极大地促进了人们对原始器官发育基本原理的理解1,2,3。目前已有多种培养方案可供选择，具体使用哪种方法取决于成像时间、目标细胞类型以及细胞位置的可及性（例如，内部生殖系细胞与外部体细胞系）4。
所有这些培养方案的一个共同特点是需要将表现出强烈收缩活性的卵室固定在液体培养基中。卵室的收缩活性主要由覆盖在成串相连卵室表面的肌细胞层引起5,6,7。因此，为了有效固定年轻的卵室，已发展出多种方法，包括使用盖玻片6,8,9、柔性覆盖膜4,10或低熔点琼脂糖包埋3,11来固定卵室。这些方法较为常用，因为它们还能通过轻微压平卵室的环周表面，实现更大视野范围的成像。
然而，最近的研究表明，年轻的卵室（1-8 阶段）会围绕其前后轴旋转6，而这种组织运动是由靠近这些年轻卵室周向表面的一层精细的肌动蛋白-肌球蛋白网络所驱动的12。因此，由于该组织轻微压扁所导致的细胞表面人为改变，可能对产生力的肌动蛋白-肌球蛋白装置的行为产生负面影响。相反，如果卵室组织未被压扁，则在卵室周向表面的蛋白质显微成像将因成像平面尺寸减小而受到更大限制。
因此，我们整合了Prasad等人的实验方案。9 以及Celeste Berg的实验室4,10 并且进一步改进了这些方法，使得所开发的方法中无需使用盖玻片、柔性覆盖膜或琼脂糖。 黑腹果蝇 卵室在培养基中自由培养，本文所述方案仅适用于倒置显微镜观察。该方案包含两个部分：第一部分侧重于分析卵室内局部细胞尺度（最多15个细胞）的肌动球蛋白信号；第二部分旨在克服因卵室自由培养所导致的成像平面受限的问题。为此，我们开发了一种基于Fiji的新型计算方法，配备半交互式图形用户界面，可选择性地提取并展开环状组织表面的特定层次。随后的方案描述了如何在组织尺度上分析肌动球蛋白（即 >50个细胞）。由于使用传统的z轴堆叠投影难以选择性地提取弯曲上皮组织的特定薄层，图1），这种易于使用的方法是全面理解的重要前提 薄层（的）行为<1 µm）的肌动球蛋白网络在组织尺度上 果蝇 卵室
此外，为了便于实验操作，我们提供了荧光标记的非肌性常规肌球蛋白II行为的示例延时成像视频（TLMs）和样本文件（见 补充文件 3）。肌球蛋白 II 是一种马达蛋白，代表肌动球蛋白机械装置中具有活性的收缩部分。为了对肌球蛋白 II 进行成像，我们使用 果蝇 表达经修饰的肌球蛋白II调节轻链（称为MRLC::GFP）的转基因品系（参见 材料表 详情请见12,13为了可视化细胞膜，该方案基于商用染料（参见 材料表）。该方案不仅适用于小亚细胞结构中MRLC::GFP信号的分析12 但也可用于其他大小相似的亚细胞颗粒（约 ±300 µm），例如使用 Life-Act::GFP 观察到的颗粒12,14.
尽管本方案中使用的是体外培养的黑腹果蝇（Drosophila）卵室，但通过优化培养基，并根据实验条件选择使用荧光标记蛋白及相应的商用染料，或例如通过mRNA显微注射以获得瞬时基因表达谱，该肌动球蛋白信号的获取方法也可应用于其他组织。类似地，基于Fiji的从环周表面提取薄层图像的方案也可更广泛地应用于类椭球形或类器官组织。
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方案
注意：以下方案提供了在Drosophila卵室中于细胞局部和组织尺度上分析肌动球蛋白的方法。局部尺度方法允许用户在每个卵室中对多达15个细胞内的肌动球蛋白行为进行详细分析，需使用高速成像和倒置共聚焦显微镜进行短时间（5–10分钟）的时间推移显微成像（TLM）。相比之下，组织尺度方法可提供50–100个细胞中的肌动球蛋白信息，但需使用低速成像和倒置转盘共聚焦显微镜进行长时间（≥30分钟）的时间推移显微成像（参见图2以及表1中各尺度推荐的参数）。选择在何种尺度上分析肌动球蛋白信号完全取决于使用者的科学问题。随附的测试TLM数据有助于做出此决策。
1. 局部细胞尺度（LCS）
注意：如需解剖并成像体外培养的Drosophila卵室，请遵循补充文件1中描述的方案。如需分析获取的透射光显微图像（TLM），请继续执行以下方案。相关的TLM测试文件链接见补充文件3。
- 局部细胞尺度（LCS）下TLM数据的处理
- 对TLM进行漂白校正，以补偿荧光标记的强度衰减
- 确保计算机上已安装最新版本的Fiji软件，具体操作如下：Fiji > 打开一个TLM（例如，从补充文件3中选择TestMovie1.tif）。
- 通过点击图像 > 颜色 > 拆分通道来分离颜色通道。
- 使用图像 > 调整 > 漂白校正 > 简单比率 > 背景强度 0.0对两个通道进行漂白校正。
注意：如果结果不理想，请尝试该插件中的其他校正方法（例如，使用直方图匹配代替简单比率）。
- 细胞分割以生成TLM的细胞掩膜
- 如果Fiji尚未打开，请重新启动（并确保其为最新版本），操作路径为：帮助 > 更新 > 应用更改 > 确定。
- 如果尚未完成此操作，请下载宏文件TissueCellSegmentMovie.ijm（网址：http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm）。将该脚本拖放到Fiji中。
- 打开经过漂白校正的TLM .tiff文件（参见第1.1.1节）。使用图像 > 颜色 > 拆分通道对漂白校正后的文件进行通道拆分。
- 在选定TLM的活性细胞膜通道上运行已上传的脚本，点击脚本窗口中的运行图标。将高斯模糊设置为2.500，细胞检测灵敏度设置为-1，然后点击确定。为了获得良好的细胞掩膜，请勿更改上述参数。对于使用63倍物镜采集的TLM，将估计噪声容限设置在10–20之间，并点击确定。
注意：对于其他物镜，可能需要不同的参数。TLM背景越干净，所需的 估计噪声容限越低。 - 生成的细胞掩膜将显示在分析的TLM中，同时出现在一个名为ParticleStack (G)的新窗口中，并且还会弹出一个名为需要操作的小窗口。从TLM上的细胞掩膜中，仅关注位于TLM中心的细胞，并选择那些在整个TLM中能提供完整且轮廓清晰的细胞。
- 如果所选细胞包含人工/多余的细胞轮廓，请使用TLM中名为需要操作的合并工具窗口。具体操作请遵循窗口中的说明。
注意：请确保细胞轮廓清晰且对应于TLM中的真实细胞膜，因为任何不精确都可能影响后续分析。额外的微调和修改（如删除不需要的细胞）可在后续使用表面管理器工具完成（见第1.1.3节）。 - 当中心选定的细胞与真实细胞膜良好对应时，按照文件 > 另存为 > Tiff将ParticleStack保存为.tiff文件。
- 将生成的细胞掩膜加载到表面管理器中
- 将表面管理器插件15安装到所使用的Fiji系统中。请遵循Viktorinova等人的说明16。
- 通过插件 > 分割 > 表面管理器(3D)打开表面管理器。
注意：表面管理器窗口右侧显示多个操作按钮，左侧为空白窗口。为查看所有操作按钮，可能需要调整窗口的高度/宽度。请注意，时间帧将以z切片形式显示。 - 通过点击文件 > 打开，将相应的ParticleStack .tiff文件加载到表面管理器中，并选择要打开的图像（例如，ParticlesStack1.tif）。
- 在表面管理器中，点击读取轮廓图像按钮，并将雅卡尔指数设置为60%。
注意：加载ParticlesStack1.tif文件可能需要几分钟，具体时间取决于计算机的处理能力。 - 加载完成后，每个细胞将被分配一个S编号，并显示在表面管理器窗口的左侧部分。
注意：要显示所有细胞的轮廓和名称，请勾选表面管理器窗口底部的显示全部和显示标签复选框。建议在确认细胞编号正确后使用此功能。 - 点击第一个S编号；从ParticlesStack1.tif导入的细胞轮廓将显示在TLM上。检查每个导入的S编号在整个TLM中的细胞轮廓质量，并删除显示错误轮廓的不需要的细胞。操作方法为：高亮选中细胞轮廓，然后点击删除按钮。
注意：也可以修正不精确的细胞轮廓或添加新的细胞轮廓。相关内容将在讨论部分中描述。 - 通过点击保存到磁盘按钮，将所有修正后的细胞保存为RoiSet.zip文件。
注意：如果需要中断会话，可以稍后将RoiSet文件加载到表面管理器中：在Fiji中打开TLM（文件 > 打开），并选择一个TLM。通过插件 > 分割 > 表面管理器(3D)打开表面管理器。点击从磁盘加载按钮并选择相应的RoiSet.zip文件来加载对应的RoiSet.zip文件。请仔细核对加载的细胞掩膜是否与加载的TLM匹配。
- TLM中的组织漂移校正
注意：在TLM采集期间，由于上皮旋转或非预期移动，可能会观察到漂移效应。在这两种情况下，我们建议进行漂移校正，以便简化后续的手动肌动球蛋白分析。漂移校正仅在手动肌动球蛋白分析中需要。本教程要求使用安装了MultiStackReg插件的最新版Fiji软件（https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg）。- 通过文件 > 打开在Fiji中打开经过漂白校正的TLM，并选择使用上述教程创建的漂白校正文件。
- 拆分通道，并通过图像 > 颜色 > 拆分通道选择标识细胞膜的通道。
- 当细胞轮廓不明显平滑时，使用以下协议：处理 > 滤波器 > 高斯模糊。对于63倍物镜，将其设置为~1–2，点击确定，然后点击是。点击处理 > 二值化 > 转换为掩膜，使用默认设置，然后点击确定。
- 通过插件 > 配准 > MultiStackReg加载MultiStackReg插件。
- 确保Stack 1设置为细胞膜通道，Action 1设置为Align，变换方式设置为Translation。勾选保存变换文件复选框，然后点击确定。
- 重新打开选定的TLM、MultiStackReg插件和保存的变换文件，操作路径为文件 > 打开并选择一个TLM。使用图像 > 颜色 > 拆分通道拆分颜色通道。
- 通过点击插件 > 配准 > MultiStackReg加载MultiStackReg插件。将Action 1设置为Load Transformation File。
- 保持变换方式为刚体，点击确定。选择之前保存的变换文件，再次点击确定。
- 合并图像通道，并按照图像 > 颜色 > 合并通道将配准后的TLM保存为.tiff文件。通过点击文件 > 另存为 > Tiff保存文件。
注意：在Fiji中校正组织漂移还有其他方法，例如通过插件 > 配准 > StackReg/校正3D漂移。
- 对TLM进行漂白校正，以补偿荧光标记的强度衰减
- 在LCS下使用表面管理器分析肌动球蛋白脉冲
注意：此步骤允许科研人员识别所分析组织中是否存在肌动球蛋白脉冲，并理解肌动球蛋白信号的详细行为及其方向性。- 打开Fiji，并确保TLM及其对应的细胞掩膜已在表面管理器中打开。
注意：确保已安装并更新Fiji软件，并已安装表面管理器插件（步骤1.1.3.1）。 - 通过文件 > 打开打开一个TLM并选择要打开的TLM（例如，TestMovie1_bleach.tif）。通过插件 > 分割 > 表面管理器(3D)加载表面管理器插件。通过文件 > 打开并选择一个细胞掩膜（例如，ParticlesStack1.tif），加载本教程中创建的已保存细胞掩膜（例如，ParticlesStack1.tif）。加载对应的感兴趣区域（ROI，例如TestMovie1_RoiSet.zip）。参见图3A。
- 切换到所选TLM中的目标通道。
注意：为区分通道，请参考TLM周围的颜色编码。 - 在表面管理器中，点击统计按钮，打开名为逐片平均灰度值的窗口（图3B）。注意，将显示在定义的细胞轮廓内，随时间变化的特定分析通道中肌动球蛋白信号的平均/中位强度值，以及其他与细胞面积和细胞形状相关的参数。
注意：强度值单位为任意单位（A.U.）；细胞面积单位为像素，需转换为平方微米。 - 将获得的数值保存为电子表格文件。点击统计窗口中的文件 > 另存为。
注意：可通过以下方式后续验证获得的统计值：在Fiji中打开漂白校正后的TLM并打开表面管理器。通过点击从磁盘加载按钮并打开文件，将对应的RoiSet.zip加载到TLM中。保存的带有细胞轮廓的掩膜将被上传，细胞名称将显示在表面管理器左侧窗口中。点击统计按钮以获取统计值。
- 打开Fiji，并确保TLM及其对应的细胞掩膜已在表面管理器中打开。
- 在LCS下手动分析单个亚细胞肌动球蛋白信号
注意：此协议需要高度集中注意力，且耗时较长。通常，一个采集的TLM可在1天内完成分析。此时间不包括果蝇准备、解剖及图像采集的时间。- 在最新版本的Fiji软件中打开一个选定的、经过漂白校正和配准（漂移校正）的TLM。使用经过漂白校正和漂移校正的TLM（例如，TestMovie1_bleach_reg.tif）作为测试示例。
- 使用图像 > 调整 > 亮度/对比度调整亮度和对比度，以便观察单个肌动球蛋白信号。
- 将TLM相对于组织/身体轴对齐。对于卵室，分析前应始终将卵室的前端对齐至图像/子电影/TLM的左侧。
- 将选定的电影划分为多个30秒的子电影，并对每个子电影进行时间投影。将未时间投影和已时间投影的子电影以相应名称保存。保留原始源文件。
注意：可通过首先删除不需要的帧来从原始TLM创建子电影，操作路径为图像 > 堆栈 > 切片移除器。定义要移除的切片并设置增量。当增量=1时，在使用切片移除器前需转换为RGB。要对30秒子电影进行时间投影，请点击图像 > 堆栈 > Z投影 > 最大强度，针对定义的帧（切片）点击确定。为避免在两个连续的30秒子电影中重复计数肌动球蛋白信号，请跳过每隔一个的30秒子电影。 - 将时间投影图像放置在对应的30秒子电影旁边（图4A,B）。在时间投影的子电影中识别信号线。通过手动播放子电影，在原始子电影中识别肌动球蛋白信号沿该线的移动方向（0°–360°）。使用Fiji工具栏中的角度工具手动测量信号移动方向相对于定义的组织轴的方向，或使用类似可用工具。
注意：Fiji仅支持0°–180°范围（图4C），因此需要将获得的值重新计算到0°–360°范围。信号线对应于一个肌动球蛋白信号随时间的运动轨迹。 - 为避免肌动球蛋白信号分析中的重复，请在时间投影的子电影中标记细胞内已分析的信号线（图4B,D）。
- 分析30秒子电影中的所有选定细胞，并保存获得的角度。
注意：仅分析在整个TLM中具有清晰轮廓的细胞中的亚细胞胞质肌动球蛋白信号。排除在整个TLM中检测到少于15–20个信号的单个细胞。忽略跨细胞移动的肌动球蛋白信号，因其来源未知。一个分析细胞在30秒子电影中的信号计数示例见图4D。 - 持续分析一个TLM的所有30秒长子电影，并将该TLM中所有测量的肌动球蛋白信号角度保存在一个电子表格文件中。
- 汇总相关数量TLM中所有测量的角度（取决于实验）。使用合适的软件绘制分析的肌动球蛋白信号方向的百分比，例如绘制范围为0°至360°的玫瑰图。
注意：为获得具有统计学意义的结果，建议分析五个至十个任意卵室阶段的独立卵室。
2. 组织尺度
注意：如需解剖并成像体外培养的Drosophila卵室，请遵循补充文件2中的实验方案。如需分析获取的透射光显微图像（TLM），请继续执行以下实验步骤。配套的TLM测试文件已放置在补充文件3中。
- 弯曲上皮组织的曲面选择性提取
注意：本方案允许用户随时间选择性地提取弯曲上皮组织中一层薄的肌动球蛋白层。该方案步骤用户友好，基于直观的图形界面，可轻松分析（提取曲面）多个时序成像图（TLM）。使用 补充文件3 中的 TestMovie2.czi 作为测试用 TLM 示例。- 打开最新版本的 Fiji 应用程序（Fiji > 帮助 > 更新 > 应用更改 > 确定）。
- 确保已安装椭球面投影插件15。请参考 Viktorinova 等.16。
- 打开一个 TLM，并通过点击插件 > 大数据查看器 > 将当前图像导出为 XML/HDF5 文件 将其导出为 XML/HDF5 文件。
注意：需要定义导出路径。导出过程可能需要数分钟，具体时间取决于 TLM 的长度。 - 通过点击 插件 > 大数据查看器 > 椭球面投影 > 选择 XML 文件，在椭球面投影中打开已导出的文件。
注意：将出现一个显示卵室矢状视图的新窗口，以及一个引导用户完成处理流程的对话框。有关在切片视图中导航的详细信息，请访问 https://imagej.net/BigDataViewer。 - 名为“卵巢投影”的对话窗口包含多个标签页。在第一个名为“边界框”的标签页中，定义 TLM 中卵室的 x 和 y 边界，以及边界框的 z 宽度（即 z 堆栈/卵室的深度），然后点击 设置（图5A）。
- 要定义边界，可拖动 x、y 和 z 旁边的按钮，或在 x、y 和 z 框中输入数值坐标。确保边界足够宽，以将感兴趣的卵室部分包含在曲面提取范围内。所选卵室部分将以粉红色高亮显示。
- 切换到“卵巢投影”窗口中名为 查找斑点 的标签页。定义 sigma 和最小峰值，然后点击“计算”以识别肌动球蛋白信号（图5B），这些信号将以绿色斑点形式显示。使用不同参数重复此步骤，直到找到足够多的斑点（约100个）。
注意：对于第6至8阶段的卵室，sigma 值为1‒3、最小峰值为20‒100时效果最佳。识别肌动球蛋白信号是关键步骤，其效果取决于信号质量和大小。确认现有斑点的大小是否正确非常重要。若图像中无可见绿色斑点/斑点，则下一步将无法进行。请浏览所选的 z 平面以查看斑点。 - 要设计椭球面，请继续切换到名为 拟合椭球面 的标签页。将 随机采样 设置为 10,000，内外截断距离 设置为 1‒10，然后点击 计算（图5C）。
注意：截断距离越低，所需椭球面越精确。之后，名为 投影 的标签页将自动打开，允许定义曲面提取。需要对设置进行优化。 - 继续切换到名为 投影 的标签页（图5D）。设置最小和最大投影距离（即所需椭球面的宽度）。必须设置最小和最大投影距离，以使粉红色定义的椭球区域包含卵室的整个外层。定义切片距离（推荐值为1）。
注意：在 图6A,C 中展示了因椭球面拟合不正确和最优拟合导致的不正确和最优投影参数示例。感兴趣的薄周向层可在后续定义。在点击“计算”前，确保卵室上定义宽度的椭球粉红色区域可见。为获得最佳结果，所需椭球面（粉红色单线）必须很好地贴合卵室的椭球面。若椭球面拟合不佳，请调整不同设置，直至获得所需的曲面提取。- 设置椭球面的输出宽度（≥800）和高度（≥400）。设置从哪个时间点到哪个时间点进行曲面提取（即定义 TLM 提取的长度）。选择球面或柱面投影。如需要，翻转 Z 并对齐 Y。
- 点击“计算”以在名为 图像 的新窗口中获得两个通道的曲面提取结果。通过点击图像 > 调整 > 亮度/对比度 调整所得图像窗口的亮度和对比度，以便观察投影的肌动球蛋白信号。
注意：在 图6B,D 中展示了因椭球面拟合不正确和最优拟合导致的投影结果对比示例。
- 若曲面提取效果良好，将图像（两个通道分别）保存为 .tiff 格式。此外，为便于将来参考，保存日志窗口文件，以记录该特定卵室曲面的提取方式。
注意：若需将提取的薄层恢复为原始展开形状（仅限开发者），此信息尤为重要。 - 在 Fiji 中使用首选颜色代码合并通道。
注意：如有必要，对包含肌动球蛋白信号的选定 z 堆栈层进行投影。当 TLM 中采集焦点随时间略有变化时，需要对选定 z 堆栈层进行投影。为获得最佳结果，最多投影一到两个 z 堆栈层。 - 将结果保存为 .tiff 文件。
注意：在 图8 中可找到代表对照组和 fat2 突变体卵室滤泡上皮中肌球蛋白 II（MRLC::GFP）信号的薄层（选择性基底和顶面）的代表性示例。
- 选择性提取组织曲面的数据处理
- 对 TLM 进行漂白校正，以补偿荧光标记的强度衰减。
- 打开 Fiji。使用 文件 > 打开 打开一个 TLM（例如，来自 补充文件3 的 TestMovie2_extraction.tif），选择要打开的图像。
- 如有必要，拆分颜色通道并将其转换为 16 位图像：点击 图像 > 颜色 > 拆分通道。使用图像 > 类型 > 16 位 将通道从 32 位图像转换为 16 位图像。
- 使用图像 > 调整 > 漂白校正 > 简单比率 > 背景强度 0.0 对两个通道进行漂白校正。
注意：若结果不理想，需探索该插件中哪种校正方法最适用（例如，使用直方图匹配代替简单比率）。 - 通过点击图像 > 颜色 > 合并通道 合并两个漂白校正后的图像的通道。通过点击文件 > 另存为 > Tiff 将合并后的图像保存为 .tiff 文件。
注意：如有需要，调整各通道的对比度和亮度。
- 细胞分割以生成 TLM 的细胞掩膜
- 若 Fiji 尚未打开，请重新打开（并通过点击 帮助 > 更新 > 应用更改 > 确定 确保其为最新版本）。
- 若尚未完成，请下载宏文件 TissueCellSegmentMovie.ijm（http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm）。
- 将此脚本拖放到 Fiji 中。打开漂白校正后的文件（例如，来自 补充文件3 的 TestMovie2_bleach.tif，参见 2.2.1）。
- 通过点击 图像 > 颜色 > 拆分通道 拆分漂白校正后文件的通道。通过点击 图像 > 调整 > 亮度/对比度 调整膜通道，以确保细胞轮廓清晰。
- 通过点击打开脚本中的 运行 图标，在选定 TLM 的活动细胞膜通道上运行上传的脚本。将高斯模糊设置为 1.500。将细胞检测灵敏度设置为 -1，然后点击 确定。将 估计噪声容差 设置为约 8（适用于使用 40x 物镜采集的 TLM），然后点击 确定。
注意：为获得良好的细胞掩膜，请勿更改上述参数。对于其他物镜，可能需要不同参数。TLM 中背景越干净，所需 估计噪声容差 越低。 - 生成的细胞掩膜将出现在分析的 TLM 中，以及一个名为 ParticleStack (G) 的新窗口中。此外，还会出现一个名为 需要操作 的小窗口。从 TLM 的细胞掩膜中，仅关注 TLM 中心的细胞，并选择那些在整个 TLM 中能提供完整且清晰轮廓的细胞。
- 若所选细胞包含人工/额外的细胞轮廓，请使用 TLM 中名为 需要操作 的合并工具窗口。具体操作请遵循窗口中的说明。
注意：确保细胞轮廓定义清晰，并与 TLM 中的真实细胞膜对应，因为任何不精确都可能影响后续分析。可使用表面管理器工具（如下文教程所述）在后续进行额外调整和修改，例如删除不需要的细胞。 - 当中心所选细胞与真实细胞膜良好对应时，通过 文件 > 另存为 > Tiff 将 ParticleStack 保存为 .tiff 文件。继续在表面管理器中加载生成的细胞掩膜并进行肌动球蛋白分析，方法如前文 1.1.3 和 1.2 节所述（在 2.2.3 和 2.3 节中也有详细描述）。
- 将生成的细胞掩膜加载到表面管理器中
- 若 Fiji 设置中已安装表面管理器插件，则继续执行第 2 步。否则，请参考 Viktorinova 等16。开发者也可获取源代码15。
- 通过点击 插件 > 分割 > 表面管理器(3D) 打开表面管理器。
注意：表面管理器窗口右侧显示多个操作按钮，左侧为一个空白窗口。为查看所有操作按钮，可能需要拉伸窗口的高度/宽度。请注意，时间帧将显示为 z 切片。 - 通过 文件 > 打开 将相应的 ParticleStack.tif 文件打开到表面管理器中，并选择要打开的图像（例如，来自 补充文件3 的 ParticleStack2.tif）。
- 在表面管理器中，点击 读取轮廓图像 按钮，并将 Jacquard 指数设置为 60%。
注意：加载 ParticleStack.tif 文件可能需要数分钟，具体时间取决于计算机性能。 - 加载完成后，每个细胞将被分配一个 S 编号，并出现在表面管理器窗口的左侧（图7A）。
注意：要显示所有细胞的轮廓和名称，请勾选表面管理器窗口底部的 显示全部 和 显示标签 复选框。建议在检查细胞编号正确性后使用此功能。 - 点击第一个 S 编号；从 ParticleStack.tif 导入的细胞轮廓将出现在 TLM 上。检查每个导入的 S 编号在整个 TLM 中的细胞轮廓质量，并删除显示不正确轮廓的不需要的细胞。为此，高亮显示细胞轮廓并点击 删除 按钮。
注意：也可修正不精确的细胞轮廓并添加新的细胞轮廓。这将在讨论部分中描述。 - 通过点击 保存到磁盘 按钮，将所有修正后的细胞保存为 RoiSet.zip 文件。
注意：若需中断会话，可稍后将 RoiSet.zip 文件加载到表面管理器中：通过 文件 > 打开 在 Fiji 中打开一个 TLM 并选择 TLM。按如下方式打开表面管理器：插件 > 分割 > 表面管理器(3D)。通过点击 从磁盘加载 按钮并选择相应的 RoiSet.zip 文件（例如，TestMovie2_RoiSet.zip）加载对应的 RoiSet.zip。请再次确认加载的细胞掩膜与加载的 TLM 对应。
- 对 TLM 进行漂白校正，以补偿荧光标记的强度衰减。
- 在表面管理器中分析肌动球蛋白脉冲
注意：打开 Fiji，确保 TLM 及其对应的细胞掩膜已在表面管理器中打开。确保 Fiji 已安装并为最新版本，且已安装表面管理器插件（https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager）。- 使用 文件 > 打开 打开一个 TLM 并选择要打开的 TLM（例如，TestMovie2_bleach.tif）。通过 插件 > 分割 > 表面管理器(3D) 加载表面管理器插件。通过 文件 > 打开 加载本教程中创建的已保存细胞掩膜（例如，ParticlesStack2.tif），并选择一个细胞掩膜（例如，ParticlesStack2.tif）。加载对应的 ROI（例如，TestMovie2_RoiSet.zip）。
- 切换到选定 TLM 中感兴趣的通道。
注意：为区分通道，请遵循 TLM 周围指示的颜色代码。 - 在表面管理器中，点击 统计 按钮，以获得名为 逐切片平均灰度值 的窗口（图7B）。注意，将显示在定义的细胞轮廓内随时间变化的给定分析通道中肌动球蛋白信号的平均/中位强度值，以及其他与细胞面积和细胞形状相关的参数。
注意：强度值单位为任意单位（A.U.）；细胞面积单位为像素，需转换为平方微米。 - 将获得的值保存为电子表格文件：点击统计窗口，文件 > 另存为。
注意：可按如下方式稍后验证获得的统计值：在 Fiji 中打开漂白校正后的 TLM。打开表面管理器。通过点击 从磁盘加载 按钮加载对应的 RoiSet.zip 到 TLM 并打开文件。保存的带细胞轮廓的掩膜将被上传，细胞名称将出现在左侧表面管理器窗口中。点击 统计 按钮以获取统计值。
注意：关于 亚细胞肌动球蛋白信号的手动分析，无法在组织尺度上对亚细胞肌动球蛋白信号进行手动分析。如讨论部分所述，需对半组织尺度上的单个肌动球蛋白信号分析进行优化。
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结果
本实验方案使科研人员能够研究上皮组织中肌动球蛋白网络的行为。只有当在局部细胞尺度（数个细胞）对肌动球蛋白行为进行详细分析，并与在组织尺度（大量细胞）进行的类似分析相结合时，才可能实现这一研究。然而，上皮组织通常具有曲面结构，此前难以有效分离出这些组织的薄层，果蝇卵室的研究即为此例（Drosophila egg chambers，图1）。本文提供的实验方案为使用者给出了简明的操作步骤，用于在上述两个尺度上分析肌动球蛋白的行为（图2）。
本方案的第一部分重点介绍如何使用Surface manager插件分析肌动球蛋白脉冲（图3），并描述如何在局部细胞尺度上手动分析单个肌动球蛋白的行为（图...
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讨论
卵室解剖与培养的关键步骤及故障排除
若将过多的果蝇放入一个小瓶中，由于大量幼虫取食以及成虫被困在果蝇食物中，2–3天后果蝇食物可能变得泥泞。在这种情况下，应将剩余果蝇转移至含有新鲜食物的新瓶中，并减少果蝇数量。特别需要剔除那些被困在食物中的雌蝇。
应提前配制 Schneider 培养基（SM），并在 4 °C 下保存约 14 天。需注意，存放过久的培养基可能产生晶体，从而损伤卵室表面。每次使用时，务必用新加入胰岛素的 SM 充分混匀，并使其有足够时间恢复至室温。这可保护卵室免受冷休克损伤，冷休克会对微管的生长以及细胞骨架的平面排列产生不利影响（如在发育中的Drosophila翅中所见19）。
卵泡和选定的卵管非常脆弱，且由于体积微小，可能在含胰岛素的SM培养基（SMI）中漂浮。建议让它们在SMI中自然沉降。它们也常会粘附在解剖镊子或仙人掌针工具上。若发生此种情况，可轻轻在S...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者非常感谢Miriam Osterfield分享了关于使用源自Celeste Berg实验室方法进行卵室体外活体成像的宝贵建议4。 我们还感谢Sebastian Tosi提供了用于细胞分割的Fiji脚本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 施奈德培养基 | Gibco | 21720-024 | [+]-谷氨酰胺 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 单位/毫升 青霉素 [+] 10.000 µg/mL 链霉素 |
| 胎牛血清 | Sigma | F135 | 热灭活 |
| 人胰岛素溶液 | Sigma | I9278 | |
| 50 mL Falcon管 | Eppendorf | 无菌的 | |
| Millex-GV 滤器 | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| 玻璃底小孔培养皿 | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm 培养皿，14 mm 微孔，No. 1.5 盖玻片 |
| 镊子 | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red（细胞膜染料） | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64（细胞膜染料） | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| 抑郁解剖载玻片 | Fisher Scientific | 12-560B | |
| 显微设备 | |||
| 体视显微镜 | 例如 Zeiss | Stemi SV 6 | |
| 倒置共聚焦显微镜 | 例如 Zeiss/Olympus | ||
| 旋转盘显微镜 | 例如 Zeiss/Andor | ||
| 显微镜用玻璃/盖玻片 | 例如：Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus 工具 | |||
| Wironit 针持 | Hammacher | 9160020 | |
| 仙人掌刺 | 金琥/仙人球 | ||
| 果蝇 文稿中使用的品系 | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | 详情请参见 Rauzi 等：平面极化肌动球蛋白收缩流调控上皮细胞连接重塑。Nature 2010，第468卷，第1110-1115页。 | ||
| AX3/AX3；sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP；fat258D/fat2103C | 详情参见 Viktorinova 等：上皮旋转先于肌动球蛋白平面的对称性破缺，并保护上皮组织免受细胞形变。《PLoS 遗传学》2017 年，第 13 卷，第 11 期，页码 e1007107。 |
参考文献
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