本文介绍了一种利用遗传耦合的、光谱可区分的光激活蛋白与荧光蛋白的实验方案。这些荧光蛋白嵌合体可用于定量分析经光激活后转变为荧光态的光激活荧光蛋白（PA-FP）组分。 即， 光激活效率。该方案表明，不同的光激活模式会产生不同的光激活效率。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
光可激活和光可转换荧光蛋白（PA-FPs）已被用于荧光活细胞显微镜中，以分析细胞和蛋白质群体的动力学。迄今为止，尚无方法可在活细胞内对表达的PA-FPs中被光激活而产生荧光的数量进行大规模定量分析。
此处，我们介绍一种涉及内部标尺的实验方案， 即， 基因连锁的光谱可区分的（光激活型）荧光蛋白，用于通过比率法定量细胞中所有表达的光激活荧光蛋白（PA-FPs）被激活为荧光状态的比例。利用本方案，我们证明了不同的光激活模式会产生不同的光激活效率。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行短时间高功率光激活，其效率比通过CLSM施加数百次低强度曝光或通过宽场照明施加短脉冲光激活低至四倍。尽管本方案以（PA-）GFP和（PA-）Cherry为例进行说明，但原则上可适用于任何光谱可区分的光激活型或光转化型荧光蛋白对，以及任何实验装置。
引言
2002年，首个广泛适用的光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）1）和光可转换蛋白（Kaede2荧光蛋白被描述。这些光学标记荧光蛋白在紫外光照射下会改变其光谱特性， 即， 它们会变亮（光激活荧光蛋白， 即， 光激活荧光蛋白（PA-FPs）或改变其颜色（光转化荧光蛋白）。迄今为止，已开发出多种可逆和不可逆的光激活及光转化荧光蛋白。3,4在群体或整体研究中，光学标记物已被用于研究整个细胞或蛋白质的动力学，以及亚细胞区室之间的连接性。此外，光学标记物还实现了基于单分子的超分辨率成像技术，如光激活定位显微镜（PALM）5 和FPALM6.
尽管照片化学 许多光学标记物在光激活或光转化过程中的机制已被描述，甚至已有光激活/光转化前后的晶体结构被解析并提供。7,8，底层照片物理的 光激活和光转化的机制尚未完全阐明。此外，迄今为止，对于光激活和光转化的效率——即实际被光转化或光激活而产生荧光的荧光蛋白所占的比例——仅有粗略的估算。 体外 已有文献报道通过整体研究定量分析了凝胶中吸收光谱的变化以及天然蛋白和激活蛋白的含量9,10,11.
本文介绍了一种利用荧光蛋白嵌合体评估整体及活细胞中光激活荧光蛋白比例的实验方案。在使用基因编码荧光蛋白时，细胞间表达的蛋白绝对量存在差异且未知。若一个表达光激活荧光蛋白（PA-FP）的细胞在光激活后信号强于另一个细胞，无法判断该更强信号是源于PA-FP表达量更高，还是PA-FP光激活效率更高。为标准化细胞中的表达水平，我们引入了基因耦联的、光谱可区分的荧光蛋白作为内部参照。通过将光激活荧光蛋白的遗传信息与光谱不同的持续发光荧光蛋白耦联，构建出内部参照，其总表达量虽未知，但两者表达比例固定且已知，为1:1。该策略可实现对不同紫外光光激活方案的定量表征。 即， 评估不同光激活模式下可被光激活的光激活荧光蛋白（PA-FPs）的相对含量，从而能够确定比其他方案更有效的光激活策略。此外，该策略原则上允许对被光激活的PA-FP组分进行绝对定量分析。为此，需要认识到本方案中所介绍的集合研究是基于荧光强度的，这使得分析过程更为复杂，如本实验方案所述。影响所测荧光强度的参数， 即， 在比较不同荧光蛋白的荧光强度时，需要考虑其分子亮度、吸光度和发射光谱以及FRET效应的差异。
本文以活细胞中的PA-GFP和PA-Cherry为例，展示了基于比率强度的光激活效率定量方法，该方法在原则上具有广泛的适用性，可用于任何实验条件下任意光可激活荧光蛋白的分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 质粒构建
- 生成双色融合探针。使用哺乳动物细胞表达载体（参见 材料表）中表达 mCherry112 和 PA-mCherry113 已使用限制性酶切位点插入 AgeI 和 BsrGI
- 订购定制寡核苷酸，用于扩增含有 A206K 突变的 eGFP 和 PA-eGFP 单体变异体， 即， mEGFP 和 PA-mEGFP14 没有终止密码子的 SalI-BamHI 片段。使用N端引物5’-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3’和C端引物5’-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3’，并将该片段插入 SalI-BamHI 将片段插入表达载体的多克隆位点。这将在绿色和红色荧光蛋白之间形成由五个氨基酸RNPPV组成的连接序列。在本文后续部分，我们将荧光蛋白嵌合体分别称为GFP—Cherry、PA-GFP—Cherry和GFP—PA-Cherry。
注意：可使用任意光谱不同的荧光团组合进行荧光团偶联及构建内部标尺，以评估光激活效率， 例如 超折叠 PA-GFP 15/ PA-TagRFP 16, 等等。 许多光激活荧光蛋白源自GFP。因此，上述提供的引物序列可用于多种荧光蛋白，以在哺乳动物细胞表达载体中构建荧光团嵌合体。
2. 细胞培养与转染
- 使用标准细胞系（如 HeLa、NRK、Cos-7）或特定光激活实验所需的特定细胞系。使用 DMEM 培养基（添加 10% 胎牛血清和 2 mM 谷氨酰胺）及胰蛋白酶 无 酚红（参见 材料表以降低背景荧光。
- 使用胰蛋白酶消化汇合培养的细胞，用血细胞计数板（Neubauer 计数室）对细胞悬液中的细胞进行计数，每孔接种 5,000 – 10,000 个细胞。或者，取 T25 细胞培养瓶中汇合生长的细胞制成 10 mL 细胞悬液，用 2 mL 移液器吸取 1 滴加入每孔；或取 T12.5 细胞培养瓶中汇合培养的细胞制成 5 mL 细胞悬液，吸取 3 滴加入每孔。
- 在8孔培养板中使用1.0号盖玻片培养细胞（参见 材料表用于荧光活细胞显微镜观察。
- 转染细胞：铺板后24小时，使用商用试剂进行转染（参见 材料表按照供应商的说明书，使用GFP—Cherry、PA-GFP—Cherry和GFP—PA-Cherry嵌合体进行分配。
- 转染后共20小时进行细胞成像，以确保蛋白表达、折叠和成熟。
3. 成像与光激活
- 在37摄氏度的加湿加热环境培养箱中对细胞进行成像。为使细胞培养基缓冲至生理pH值并使其含有CO2-不依赖，添加 20 mM HEPES，或使用 CO2 气体设定为5%流速。
- 首先，对表达 GFP-Cherry 构建体的细胞进行成像。在共聚焦图像中设置参数，以定义每个像素的时间积分激光强度， 即， 像素驻留时间（微秒）、声光可调滤波器（AOTF）透光率（百分比）和数字放大倍数。
注意：使用60倍物镜和3倍数字放大可对细胞进行完整成像，同时提供足够的放大倍数。将像素驻留时间设置为2–4 μs，并调节488 nm和561 nm激光的声光可调滤光器（AOTF）透射率，使图像具有良好的信噪比，且无光漂白现象，无荧光强度饱和的像素。 - 使用设定的激光功率、声光可调滤波器（AOTF）透射率、像素驻留时间和数字放大倍数，对15–20个表达GFP-Cherry的细胞进行成像。
- 然后，使用相同的激光功率、像素驻留时间、AOTF 透射率和数字放大倍数，对表达 GFP—PA-Cherry 和 PA-GFP—Cherry 的细胞进行成像。分别在绿色通道或红色通道中寻找表达目标蛋白的细胞。在搜索表达细胞时，应避免长时间曝光，以防止荧光蛋白被漂白。
- 设置一个微型时间序列，包括一张激活前图像和三张激活后图像。激活后图像有助于识别由于暴露于紫外光而可能产生的瞬时暗态。
注意：据我们观察，由于瞬时暗态导致的检测荧光强度变化 <1% 且可忽略不计，但每种实验装置均应评估这些暗态。 - 为了确定光激活效率， 即， 在已建立的特定光激活实验中，被激活并产生荧光的光激活荧光蛋白（PA-FPs）的比例，需对表达本文所引入的内部标尺的15-20个细胞应用相同的光激活条件，并继续进行图像分析（第4节）。若刚开始建立光激活实验，可参考本文基于PA-GFP和PA-Cherry实验经验提供的几种不同设置，并根据需要进行调整。
- 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对PA-GFP和PA-Cherry进行瞬时光激活时，分别应用90 μW的405 nm激光照射3次或5次。
注意：在我们的显微镜设置下，使用38% AOTM透射率和2 μs像素驻留时间，我们在物镜处以线扫描模式测量了405 nm激光功率。在这些参数条件下，表达的PA-GFP和PA-Cherry分别约有8%和16%可被光激活产生荧光。利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行瞬时光激活的完整滴定系列此前已有发表17. - 如果光激活的PA-GFP和PA-Cherry荧光基团具有更高的比例是有利的 例如 为获得更高的信噪比，且光激活无需立即完成，可使用40 μW的405 nm激光，像素驻留时间为2 μs，AOTF透射率为6%，进行450次迭代。此时光激活将耗时长达4分钟，而非仅1-2秒，但PA-GFP的光激活效率将从8%提升至29%，从而实现更高的信噪比。
- 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对PA-GFP和PA-Cherry进行瞬时光激活时，分别应用90 μW的405 nm激光照射3次或5次。
- 如果具备包含微镜阵列的空间光调制器的马赛克数字照明系统，可使用405 nm激光进行宽场光激活，从而在毫秒内实现高效的光激活。
注意：在物镜处测得激光功率为1.6 mW、曝光时间为250 ms的条件下，可使29%的PA-GFP被光激活而产生荧光。 - 分别对15-20个表达PA-GFP-Cherry和GFP-PA-Cherry的细胞，使用任意设定的光激活参数进行成像。
- 由于pH、活性氧及其他环境因素可能影响光激活效率，因此评估光激活荧光蛋白（PA-FPs）在目标蛋白所处的特定亚细胞微环境中的光激活效率可能具有重要意义。通过将荧光团嵌合体与目标蛋白偶联，如作者对质膜蛋白VSVG所进行的操作 18，可以在特定的亚细胞区域中评估光激活效率。
4. 基于比率强度的光激活效率定量分析图像分析与算法
- 图像分析可使用开源图像处理平台 ImageJ 或 Fiji 进行。在未转染细胞的绿色（B1）和红色（B2）通道。避免选择核周区域或任何自发荧光增强的区域。
- 为测定转染细胞中的荧光强度，使用手绘选区工具勾勒细胞轮廓。同样需避开核周区域或显示自发荧光的其他区域。
- 从每个通道测得的荧光强度中减去背景值。
我G = I绿色测量值 – B1
我R = I红色测量值 – B2 - 使用GFP—Cherry构建体计算红绿荧光比值（RtoGr），并校正由荧光共振能量转移（FRET）引起的供体荧光淬灭。在先前的实验中，采用相同氨基酸连接子的GFP—Cherry构建体测得的FRET效率E为0.3。18.
RtoGr = (I红色测量值 – B2) / (I绿色测量值 – B1)
RtoGrcorr = RtoGr × (1 – E)
注意：在此基于强度的方法中，由于mEGFP和PA-mGFP可能存在尚未表征的不同光谱特性，其作为供体的淬灭程度可能有所不同。FRET速率（kET）和福斯特距离（R0）取决于供体的量子产率，而mEGFP和PA-mGFP的量子产率尚未确定。 - 使用GFP—PA-Cherry质粒评估光激活PA-Cherry的比例。通过将测得的GFP—PA-Cherry质粒未淬灭的绿色荧光强度乘以相应系数，确定PA-Cherry的预期荧光强度 之前 进行光激活，并校正红绿比（RtoGr）相关性).
我红色预期 = (I绿色测量值 – B1RtoGr*corr
注意：如上所述，持续发光的荧光蛋白与光激活荧光蛋白的分子亮度可能存在差异。有关如何校正这些差异的更多信息，请参见讨论部分。 - 将测得的红色荧光强度作为PA-Cherry光激活效率的分数进行计算 之后 光激活及红色通道中的预期荧光强度。
（FPA-Cherry) = (I红色测量值 – B2) / I红色预期 - 使用 PA-GFP—Cherry 构建体评估光激活 PA-GFP 的比例。通过将测得的 PA-GFP—Cherry 构建体的红色荧光强度除以 PA-GFP 的预期荧光强度来确定 之前 通过红绿比值（RtoGr）进行光激活。此处，RtoGr 无需校正供体淬灭，因为 GFP 和 PA-GFP 受到的供体淬灭程度相同。
我绿色预期 = (I红色测量值 – B2）/ RtoGr - 将测得的绿色荧光强度作为PA-GFP光激活效率的分数进行计算 之后 光激活及绿色通道中的预期荧光强度。
（FPA-GFP) = (I绿色测量值 – B1) / I绿色预期
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本文所示方案展示了对被光激活而产生荧光的荧光蛋白比例进行比率定量的方法（图1）。该比例因光激活模式的不同而有所差异。
使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行短时间高功率光激活的典型结果如图2c所示。通过像素驻留时间和声光可调滤光器（ATOF）透射率调节物镜处测得的激光功率后，PA-GFP的最大光激活效率约为8%，而PA-Cherry约为16%。PA-GFP和PA-Cherry相对较低的光激活效率可能归因于在CLSM提供的连续确定性光子流照射下，同时发生了光激活和光破坏。较短的荧光寿命以及红色光激活荧光蛋白（PA-FPs）不同的、红移的吸收光谱，可能是PA-Cherry光激活效率高于PA-GFP的原因。
使用低激光...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
迄今为止，尚无方法能够批量测定在活细胞中表达的光激活荧光蛋白（PA-FPs）中有多少比例被光激活而产生荧光。本方案适用于任何光谱上可区分的荧光蛋白对。尽管本文以不可逆光激活荧光蛋白PA-GFP和PA-Cherry为例进行说明，但该方法原则上也可应用于光转化蛋白。然而，必须谨慎选择光谱上可区分的荧光蛋白，以尽量减少光谱重叠，因为光转化荧光蛋白会改变其吸收和发射光谱。 例如 从绿色荧光变为红色荧光。
如上所述，需要强调的是，该方法是基于比率和强度的。该方法可用于标准化细胞中未知的表达水平，并通过不同的光激活模式来定义光激活效率的相对差异。该方案还可用于评估光激活型光激活荧光蛋白（PA-FPs）被绝对激活的比例。此时，需要考虑不同荧光蛋白（FPs）的不同光谱特性。
分子亮度（MB）是量子产率（QY）、消光系数（EC）以及在给定激发波长下相对于吸收峰的吸光度百分比三者的乘积。对于Cherry12和PA-Cherry13，其...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢斯坦福大学医学院Dorigo实验室和神经科学影像服务中心为本项目提供设备和空间。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pEGFP-N1 哺乳动物细胞表达载体 | Clontech | ||
| 不含酚红的 DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| 不含酚红的胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8 孔腔室载玻片 #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
参考文献
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Renz, M., Lippincott-Schwartz, J. Ch. 9. The Fluorescent Protein Revolution Series in Cellular and Clinical Imaging. Day, R. N., Davidson, M. W. , CRC Press. 201-228 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Sengupta, P., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Photocontrollable fluorescent proteins for superresolution imaging. Annual Review of Biophysics. , 303-329 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Henderson, J. N., et al. Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (12), 4176-4177 (2009).
- Subach, F. V., et al. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21097-21102 (2009).
- Wiedenmann, J., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3 (12), e3944(2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6 (2), 153-159 (2009).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Slocum, J. D., Webb, L. J. A Double Decarboxylation in Superfolder Green Fluorescent Protein Leads to High Contrast Photoactivation. Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (13), 2862-2868 (2017).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6481-6491 (2010).
- Renz, M., Wunder, C. Internal rulers to assess fluorescent protein photoactivation efficiency. Cytometry A. , (2017).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), E2989-E2997 (2012).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
