本文介绍了一种利用遗传耦合的、光谱可区分的光激活蛋白与荧光蛋白的实验方案。这些荧光蛋白嵌合体可用于定量分析经光激活后转变为荧光态的光激活荧光蛋白（PA-FP）组分。 即， 光激活效率。该方案表明，不同的光激活模式会产生不同的光激活效率。
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摘要
摘要
光可激活和光可转换荧光蛋白（PA-FPs）已被用于荧光活细胞显微镜中，以分析细胞和蛋白质群体的动力学。迄今为止，尚无方法可在活细胞内对表达的PA-FPs中被光激活而产生荧光的数量进行大规模定量分析。
此处，我们介绍一种涉及内部标尺的实验方案， 即， 基因连锁的光谱可区分的（光激活型）荧光蛋白，用于通过比率法定量细胞中所有表达的光激活荧光蛋白（PA-FPs）被激活为荧光状态的比例。利用本方案，我们证明了不同的光激活模式会产生不同的光激活效率。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行短时间高功率光激活，其效率比通过CLSM施加数百次低强度曝光或通过宽场照明施加短脉冲光激活低至四倍。尽管本方案以（PA-）GFP和（PA-）Cherry为例进行说明，但原则上可适用于任何光谱可区分的光激活型或光转化型荧光蛋白对，以及任何实验装置。
引言
2002年，首个广泛适用的光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）1）和光可转换蛋白（Kaede2荧光蛋白被描述。这些光学标记荧光蛋白在紫外光照射下会改变其光谱特性， 即， 它们会变亮（光激活荧光蛋白， 即， 光激活荧光蛋白（PA-FPs）或改变其颜色（光转化荧光蛋白）。迄今为止，已开发出多种可逆和不可逆的光激活及光转化荧光蛋白。3,4在群体或整体研究中，光学标记物已被用于研究整个细胞或蛋白质的动力学，以及亚细胞区室之间的连接性。此外，光学标记物还实现了基于单分子的超分辨率成像技术，如光激活定位显微镜（PALM）5 和FPALM6.
尽管照片化学 许多光学标记物在光激活或光转化过程中的机制已被描述，甚至已有光激活/光转化前后的晶体结构被解析并提供。7,8，底层照片物理的 光激活和光转化的机制尚未完全阐明。此外，迄今为止，对于光激活和光转化的效率——即实际被光转化或光激活而产生荧光的荧光蛋白....
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方案
1. 质粒构建
- 生成双色融合探针。使用哺乳动物细胞表达载体（参见 材料表）中表达 mCherry112 和 PA-mCherry113 已使用限制性酶切位点插入 AgeI 和 BsrGI
- 订购定制寡核苷酸，用于扩增含有 A206K 突变的 eGFP 和 PA-eGFP 单体变异体， 即， mEGFP 和 PA-mEGFP14 没有终止密码子的 SalI-BamHI 片段。使用N端引物5’-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3’和C端引物5’-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3’，并将该片段插入 SalI-BamHI 将片段插入表达载体的多克隆位点。这将在绿色和红色荧光蛋白之间形成由五个氨基酸RNPPV组成的连接序列。在本文后续部分，我们将荧光蛋白嵌合体分别称为GFP—Cherry、PA-GFP—Cherry和GFP—PA-Cherry。
注意：可使用任意光谱不同的荧光团组合进行荧光团偶联及构建内部标尺，以评估光激活效率， 例如 超折叠 PA-GFP
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结果
本文所示方案展示了对被光激活而产生荧光的荧光蛋白比例进行比率定量的方法（图1）。该比例因光激活模式的不同而有所差异。
使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行短时间高功率光激活的典型结果如图2c所示。通过像素驻留时间和声光可调滤光器（ATOF）透射率调节物镜处测得的激光功率后，PA-GFP的最大光激活效率约为8%，而PA-Cherry约为16%。PA-GFP和PA-Cherry相对较低的光激活效率可能归因于在CLSM提供的连续确定性光子流照射下，同时发生了光激活和光破坏。较短的荧光寿命以及红色光激活荧光蛋白（PA-FPs）不同的、红移的吸收光谱，可能是PA-Cherry光激活效率高于PA-GFP的原因。
使用低激光.......
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讨论
迄今为止，尚无方法能够批量测定在活细胞中表达的光激活荧光蛋白（PA-FPs）中有多少比例被光激活而产生荧光。本方案适用于任何光谱上可区分的荧光蛋白对。尽管本文以不可逆光激活荧光蛋白PA-GFP和PA-Cherry为例进行说明，但该方法原则上也可应用于光转化蛋白。然而，必须谨慎选择光谱上可区分的荧光蛋白，以尽量减少光谱重叠，因为光转化荧光蛋白会改变其吸收和发射光谱。 例如 从绿色荧光变为红色荧光。
如上所述，需要强调的是，该方法是基于比率和强度的。该方法可用于标准化细胞中未知的表达水平，并通过不同的光激活模式来定义光激活效率的相对差异。该方案还可用于评估光激活型光激活荧光蛋白（PA-FPs）被绝对激活的比例。此时，需要考虑不同荧光蛋白（FPs）的不同光谱特性。
分子亮度（MB）是量子产率（QY）、消光系数（EC）以及在给定激发波长下相对于吸收峰的吸光度百分比三者的乘积。对于Cherry12和PA-Cherry13，其.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢斯坦福大学医学院Dorigo实验室和神经科学影像服务中心为本项目提供设备和空间。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pEGFP-N1 哺乳动物细胞表达载体 | Clontech | ||
| 不含酚红的 DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| 不含酚红的胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8 孔腔室载玻片 #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 |
参考文献
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A.
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