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生物胞素回收及填充的海马CA2区中间神经元的三维重建

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DOI：

10.3791/58592

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2018年11月20日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University College London

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文所述方案介绍了在进行细胞内电生理记录后，对海马CA2区中间神经元进行免疫荧光分析、生物胞素回收以及高质量重建的方法。 体外 从而能够研究神经元的特征，并最终深入研究神经元的精细解剖结构。

摘要

皮层网络活动如何处理信息，对大量基础科学和临床科学问题具有重要意义。本文所述方案旨在识别该神经环路的基本组成单元。对皮层区域的深入研究最终将为其他科学家提供理解大脑如何获取、处理和存储信息以及疾病中哪些环节发生异常所需的环路元件，同时，电生理学和形态学数据被计算神经科学家广泛用于构建探索信息处理机制的模型网络。本文所述方案详细介绍了如何回收在海马CA2区记录到的含生物胞素的细胞，并在 3D中对其进行重建。此外，该方案还描述了如何检测所记录的中间神经元中钙结合蛋白或肽类物质的含量。

引言

大脑皮层和海马体是结构极为复杂的脑区，其神经元亚型的分类1,2,3,4，它们之间连接关系的图谱5,6,7,8,9,10,11 以及该神经环路如何支持认知功能12,13,14,15 仍在深入研究之中，并持续引发争论。例如，为了理解神经环路的细节与复杂性，并整合来自大量不同研究的数据，能够定义和描述其组成成分极为重要。然而，关于究竟存在多少种不同类型的神经元，甚至是否有可能将所有神经元归入特定类别，目前仍存在争议。研究人员正在开发能够构建和测试不同复杂程度神经环路的计算工具。16,17,18，但这些研究的核心在于需要对细胞类型及其相互连接的特性进行详细研究。利用本文所述方案，已获得大量关于成年大鼠新皮层局部环路的信息。10,19,20,21,22。尽管 "接线图" 远未完善，但已显现出一些清晰的模式或规律。此外，尽管某些细节存在差异，这些规律在两种哺乳动物（大鼠和猫）以及多个新皮层区域中具有共性，因而可构建出基本的结构单元，这些单元很可能同样适用于人类新皮层。本文所述技术旨在通过识别先前尚未深入研究的脑区中参与连接的突触前与突触后神经元，进一步拓展我们对皮层环路功能图谱的理解；该技术采用一种能够实现优异组织保存和显著染色回收效果的实验方案，特别适用于成年脑组织。通过结合细胞内电生理记录（锐电极配对记录）、生物胞素标记、免疫荧光、组织学处理以及高精度神经元形态重建，本方法已成功获取了CA2区局部环路及其神经元特性的相关数据，从而实现了与邻近CA区域的直接比较23,24,25.

本文所述技术经过多年发展，旨在获取详细的神经元解剖结构，从而实现对细胞的准确分类，并高质量、精确地重建其树突和轴突分支，这些数据可与使用锐电极进行成对记录所获得的电生理数据相关联。组织学方案经过优化，以保存神经元的超微结构，并实现树突（包括树突棘）和轴突分支的优异形态恢复。例如，双重固定技术的原理是先将组织浸入固定液中，再用四氧化锇进行后固定，从而为光学显微镜提供良好的对比度26。在固定液中添加少量戊二醛和苦味酸溶液，可增强抗体渗透性并更好地保存细胞超微结构，该方法借鉴了先前研究的建议27。与传统使用去污剂的方法不同，采用冻融法对脑片进行通透化处理，并结合蔗糖进行冷冻保护，有助于更优地保存组织，便于对记录细胞进行细致的形态学分析。此外，通过使用过氧化氢（H2O2）和硼氢化钠（NaBH4）孵育以降低背景染色，可显著改善对极细微结构的可视化效果。在辣根过氧化物酶（HRP）反应中加入氯化镍（NiCl2）以生成黑色反应产物，亦可增强染色对比度。

以下方案描述了用于确定优良组织保存效果及高细节神经元结构的实验步骤 细胞内记录后的三维重建 体外我们实验室此前已报道过脑片制备、使用锐电极进行的细胞内成对记录以及后续组织学处理方法的详细描述。28尽管该方案适用于用生物胞素在450–500 μm厚的脑片中进行细胞内灌注的细胞，但在全细胞记录后也可采用相同方案。然而，使用较薄的脑片将导致细胞重建不够完整。

方案

本研究中使用的所有操作程序均按照英国政府内政部关于《1986年动物科学程序法》的规定进行。

1. 电生理记录及生物胞素填充后中间神经元钙结合蛋白或蛋白含量的测定与生物胞素可视化

注意：电生理记录结束后，含有生物胞素标记细胞的脑片需在组织学处理前于固定液中过夜固定。若后续步骤在另一天进行，则次日早晨需更换一次0.1 M磷酸盐缓冲液，以防止组织损伤。固定液（4%多聚甲醛、0.2%饱和苦味酸溶液、0.025%戊二醛溶液溶于0.1 M磷酸盐缓冲液（PB））必须在记录当天新鲜配制，以获得最佳效果。

  1. 电生理记录结束后，用画笔小心拾起含有已记录细胞的脑片，放入盛有人工脑脊液（ACSF）的容器中。
    注意：用于脑片制备及使用锐电极进行细胞内记录的实验方案细节此前已有描述28.
  2. 在通风橱内，用画笔小心拾起脑切片，将其卷至一小片优质滤纸上。将另一片湿润的滤纸覆盖在切片上，把两张湿润的滤纸放入盛有5–10 mL固定液的小塑料容器中，于4 °C冰箱中过夜保存。
  3. 在烧杯中加入20 mL蒸馏水，置于加热板上加热至60 °C。逐渐加入2.4 g明胶，待其完全溶解后，冷却至35–40 °C再使用，以避免对组织造成损伤。
  4. 用2 mL的0.1 M磷酸缓冲液替换固定液。将脑片置于培养皿中，用手术刀片切除多余组织。将修整后的组织放入一个培养皿（直径9 cm，高1.4 cm）中，确保其平展无折叠或皱褶，并用干燥的画笔除去多余的缓冲液。
  5. 用预热的明胶溶液覆盖组织，然后将培养皿置于冷冻块上，以快速冷却溶液。
  6. 使用可调节角度的台灯提供对比光源，从培养皿侧面观察，同时用细画笔轻轻施加压力使组织切片保持平整，直至明胶开始凝固。
    注意：如果组织未能平整贴附，可将明胶重新熔化。明胶凝固过程中，移除画笔可能在明胶表面留下瑕疵，可通过将灯泡靠近表面数秒，轻轻熔化表层以去除。
  7. 将含有凝固明胶的培养皿放入冰箱，在 4 °C 下静置 30–60 分钟。
  8. 在通风橱中，使用手术刀片切取含有明胶包埋组织的小块样本（约 1 × 1 cm），用小刮铲轻轻挑起组织块，并小心转移至用于固定切片的相同但新鲜的固定液中，在 4 °C 下固定至少 30 分钟。
  9. 用 0.1 M 磷酸缓冲液（PB）洗涤明胶块 3 次，每次 5 mL，用滤纸吸干后将明胶块切面朝上粘附固定即，将组织朝上用超级胶水固定到振动切片机的样品夹上。
  10. 用滤纸擦去多余的胶水，并用解剖刀片切去样品块的四个角，使其呈菱形。
  11. 使用振动切片机将切片切成50 µm厚度，并将每一片小心放入含有10%蔗糖的玻璃小瓶中。
  12. 小心从离心管中取出一个组织切片，将其平放在培养皿盖内。在解剖显微镜下，使用新的手术刀刀片去除切片周围的明胶，然后将切片放回含有 2 mL 新鲜 10% 蔗糖溶液的离心管中
    注意：此步骤中必须尽可能去除明胶，以减少脱水步骤（步骤 1.37）期间的组织收缩。
  13. 在室温下，将切片置于基于0.1 M PB的蔗糖-甘油溶液中进行冷冻保护：先在10%蔗糖溶液中孵育10分钟，随后在20%蔗糖-6%甘油溶液中振荡孵育20分钟，重复两次，最后在30%蔗糖-12%甘油溶液中振荡孵育30分钟，重复两次。
  14. 使用画笔将切片平放在一小块锡箔纸上。去除切片上多余的液体，小心地将锡箔纸折叠成包裹状。
  15. 将样本包埋物靠近液氮表面但不接触液氮表面，保持30秒，然后让切片完全解冻约30秒。重复冻融过程两次。
  16. 用毛笔移除所有切片，并将其放入含有 2 mL 0.1 M PB 的玻璃小瓶中，在持续振荡条件下清洗以去除多余的蔗糖。
  17. 用巴斯德移液管移除 PB，将切片在 2 mL 1% 水溶液 H2O2 孵育30分钟。用2 mL 0.1 M磷酸缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
  18. 用巴斯德移液管移除 0.1 M PB，加入 1 % 硼氢化钠（NaBH₄）4) 于 0.1 M PB 中。
    注意：不要盖紧试管盖，因为 NaBH4 溶液释放出氢气。
  19. 用巴斯德移液管除去硼氢化钠，并用 2 mL 0.1 M 磷酸缓冲液彻底清洗切片，每次 5 分钟，共洗 5 次。
  20. 用含10%正常山羊血清（NGS）的0.1 M PB替代0.1 M PB，孵育30分钟。
  21. 除去山羊血清，将切片在ABC溶液中含小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的混合液中，4 °C孵育过夜。
    注意：先前研究中使用的一抗列表见于 表1 在博彻 等 (2014)29.
  22. 在避光条件下，将切片置于荧光标记的二抗混合液中孵育 2 h材料表).
  23. 将切片置于载玻片上的封片剂中，并加盖盖玻片。
  24. 以40倍放大倍数拍摄荧光标记图像（图1Bb).
  25. 荧光成像后，将载玻片放入盛有PBS的玻璃培养皿中，小心移除盖玻片。随后用巴斯德移液管轻轻吹打PBS，将切片从载玻片上冲洗下来。将切片转移至含有PBS的洁净玻璃小瓶中。
  26. 通过首先将切片在ABC溶液中孵育至少2小时以扩增HRP反应产物，从而进行亲和素-HRP反应。
  27. 将一片3,5-二氨基联苯胺（DAB）溶于5 mL蒸馏水中，配制DAB溶液。
  28. 用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟，然后用 Tris 缓冲液洗涤 2 次，每次 10 分钟。最后一次洗涤后移除 Tris 缓冲液。
  29. 快速加入一滴 8% NiCl2 将溶液加入DAB溶液中，用移液器吹打混合，迅速将1 mL该溶液加至切片上。将切片在DAB/NiCl中孵育2 溶液处理15分钟。
  30. 加入10 µL的1% H2O2 加入DAB溶液。在避光条件下持续振荡反应约1至2分钟，并在解剖显微镜下观察已填充细胞的标记情况。
  31. 通过移除DAB/NiCl终止反应2/2O2 溶液中孵育，并用Tris缓冲液洗涤切片两次，每次5分钟。
  32. 在通风橱中，将一小片滤纸放入培养皿内，并用 0.1 M PB 润湿。用画笔逐个从玻璃小瓶中取出切片，小心地将其平铺于滤纸上。
  33. 用另一张湿润的滤纸圆片覆盖组织切片，并用纸巾轻轻接触表面以去除多余的缓冲液。
  34. 在滤纸顶部加入8–9滴1%四氧化锇（osmium tetroxide）的0.1 M PB溶液，盖上培养皿，置于通风橱中孵育至少30分钟，但不超过1小时。
  35. 打开培养皿，掀开上层滤纸。用毛笔小心地依次拾取切片，放入玻璃小瓶中，并用蒸馏水冲洗两次。
  36. 妥善处理四氧化锇废液。冲洗所有一次性实验器材，并将其放入指定的废弃物容器中。
  37. 将每个切片平放于载玻片上，盖上盖玻片。将载玻片转移至培养皿中，用一个空的玻璃小瓶倒扣在盖玻片上以固定其位置，并用50%乙醇覆盖。15分钟后，将载玻片从溶液中取出，取下切片，再将切片重新放回载玻片上，随后将载玻片置于70%乙醇中15分钟。依次用95%和最终100%乙醇溶液重复相同步骤。
  38. 脱水步骤完成后，将切片转移至通风橱内摇床上的玻璃小瓶中，瓶内盛有100%乙醇。用丙烯氧化物（C3H6O）中清洗，每次5分钟，共清洗三次。最后一次清洗后，保留约2 mL丙烯酸甲酯于小瓶中，并加入树脂（体积比1:1）。确保树脂完全溶解，并将切片置于持续振荡条件下处理30分钟。
  39. 使用木棒将每个样本置于含有环氧树脂的铝制载片中，并过夜孵育。
    注意：切勿将切片在树脂中放置超过24小时，以免造成切片损伤。
  40. 将载片置于加热板上约10分钟。用木棒挑起每个切片，转移至干净的载玻片上。在解剖显微镜下保持每个切片的方向一致。将盖玻片覆盖在切片上。将载玻片放入56 °C的烘箱中孵育48小时以完成固化。

2. 三维神经元重建

注意：使用 Neurolucida 软件。以下提供的说明仅适用于特定的神经元重建系统（材料表）。在进行重建之前，需使用显微镜对切片获得的各部分进行匹配。

  1. 将载玻片放置在载物台上，用载物台夹固定，并打开神经元重建软件。点击 采集 选项卡，选择 实时图像。
  2. 使用100倍油镜测量每个切片的厚度。记录每个切片顶部和底部在z轴读数器上的数值，并通过两个数值之差计算切片厚度。
  3. 使用低倍物镜聚焦于包含胞体的 Home 切片。然后切换至100倍物镜，聚焦于细胞体，并 点击其中心位置以标记参考点。
  4. 在 Trace 选项卡中，选择 连续切片管理器。然后在 连续切片管理器 窗口中选择 创建新切片（+ 图标）。输入切片数量，按正确的Z轴顺序为每个切片命名，并输入步骤2.2中测得的切片厚度。
  5. 使用100倍物镜通过三维方式追踪胞体时，在 Trace 选项卡中选择 轮廓，然后选择 细胞体 轮廓。使用操纵杆将焦平面移至细胞体最顶端，通过点击当前焦点清晰部分的边缘来放置点。右键单击并选择 闭合轮廓 以完成第一个轮廓。重复此过程，逐层向下移动Z轴位置，直至到达细胞体底部（图2）。
    注意：在 Trace 选项卡中选择 3D可视化，可查看细胞体的三维结构。
  6. 使用100倍物镜以二维方式追踪细胞体时，在 Trace 选项卡的 神经元 菜单中选择 细胞体。将焦点置于细胞体中部，通过点击细胞体边缘周围来放置点。完成轮廓后，右键单击并选择 完成细胞体。
  7. 为追踪树突分支结构，在 神经元 菜单中选择 树突 或 顶树突。首先使用鼠标滚轮调节光标直径，使其与树突直径匹配，然后追踪每条树突的起始短段。在跨切片移动时使用操纵杆，并持续使用鼠标滚轮调整追踪路径的直径。
  8. 检查追踪路径与实时显微图像的对齐情况，并在必要时进行调整，尤其是在使用操纵杆移动后。在 Trace 选项卡中选择 对齐追踪，先点击追踪路径，再点击正确位置以完成对齐。
  9. 当到达树突分支的节点时，右键单击并从下拉菜单中选择 二分叉节点 或 三分叉节点。
  10. 当某一分支末端到达时，在 神经元 菜单的下拉菜单中选择一个终止类型。选择正确的终止类型，即，高终止、正常终止 或 低终止，以便在不同切片间进行准确匹配。
  11. 当前切片中所有树突追踪完成后，降低显微镜放大倍数，选择 Joy Free 选项卡，移动至紧邻上方或下方的下一个切片。
  12. 为识别当前切片与已完成切片之间树突的对应匹配点，点击 移动 选项卡并选择 匹配点。选择所需匹配点的数量（建议三个或以上），然后点击 确定。点击已完成分支的末端，再点击对应分支。对每个匹配点重复此操作。建议在100倍放大倍数下重复此过程，以确保匹配精度。
  13. 通过右键单击末端，直接将匹配的分支添加到前一切片中。当分支与已追踪的分支对齐时，选择 添加至末端，并按前述方法继续追踪。
  14. 当所有切片的树突均完成追踪后，从 神经元 菜单中选择 轴突，采用相同流程追踪轴突。
  15. 返回 Home 切片，重新对齐重建图像与实时显微图像，在 Trace 选项卡中选择 轮廓。选择预定义的轮廓/层边界/区域边界，点击以沿轮廓进行追踪。选择 结束开放轮廓。追踪所有需要的层和区域轮廓。
  16. 在 Trace 选项卡中使用 3D可视化 功能，查看重建结构的三维图像。
  17. 为录制三维重建的视频（视频1），打开三维重建图像并选择 创建视频。设置文件保存路径和期望的旋转速度，建议设置旋转角度为270°。点击 开始录制，录制数秒后点击 自动旋转，按需点击 停止录制。使用视频编辑软件（材料表）对视频进行后期编辑。
  18. 如需将文件导出为Tiff或JPEG格式，选择 文件 | 导出 | 将追踪结果导出为图像。选择µm/像素比例并点击 适应。选择背景颜色后点击 文件，命名文件，选择Tiff或JPEG格式，然后点击 保存。如需导出为矢量文件格式，选择 文件 | 导出 | 将追踪结果导出为矢量文件。
  19. 使用神经元重建分析软件进行形态计量学分析。
    1. 为分析树突树并生成树状图，在Neurolucida Explorer中打开文件。选择 分析 | 结构，然后从下拉菜单中选择 树状图（图3）。
    2. 为对三维重建结果进行全面的形态计量学分析（包括分支复杂性、分支和胞体体积、表面积等），在软件中打开文件。在 视图 选项卡中点击 全选，进入 分析 选项卡，然后选择 结构 和 分支结构分析。

3. 故障排除

  1. 调整相机设置。为获得最佳效果，将曝光时间设置为小于 100 ms，并将增益和偏移尽可能接近 0。
  2. 如果神经元重建软件未在 Trace 选项卡的 3D visualize 中自动将已追踪的轮廓显示为三维细胞体，请在 Trace 选项卡中选择 Select objects，按住键盘上的 Ctrl 键并点击所有已绘制的轮廓，右键单击，然后在下拉菜单中选择 Set cell body。
  3. 要调整单个分支的 z 参数，请在 Trace 选项卡中选择 Select objects 选中树结构，然后通过右键菜单下拉项设置所有点的 z 调整。选择 Modify z position，然后选择 Shift z value 并输入所需数值。
  4. 在需要跨越较大距离进行追踪时，使用“Move”选项卡中的“Go To”功能重新对齐重建结果。
  5. 在重建过程中的任意时刻均可添加额外节点。选择要插入节点的分支（在 Trace 选项卡中选择 Select Object 并点击该分支），右键单击，然后选择 Insert Node into Selected Tree，再在分支上的正确位置点击。
  6. 在重建复杂神经元时，可分别追踪匹配的分支，之后再进行拼接，以便更易于识别分支。在新切片中分别追踪各分支，然后将这些分支连接到前一切片中对应的分支：将鼠标悬停在待拼接分支的末端，右键单击并选择 Splice，再将鼠标悬停到目标连接末端并点击。
  7. 如果分支被追踪到了错误的树类型下，请选中该树，右键单击并选择 Change Tree Type，然后选择正确的树类型。
  8. 如果某个点放置错误，可执行 Ctrl + Z 或点击 Trace 菜单中的 Undo 按钮以删除最后一个点。但若在尝试删除点之前已使用操纵杆在切片间移动，则此操作无效。此时可在分支结束时删除该点：选择该分支（按下 Select Object 并点击分支），将鼠标悬停在要删除的点上，右键单击并选择“删除点”。
  9. 若不确定两个分支是否匹配，可采取以下任一方法：1）使用 Trace 选项卡中的 3D Visualize 功能检查分支在 z 平面上是否对齐；或 2）使用连续切片管理器中的 Show Flanking 功能，以灰色显示当前切片上下相邻的切片。
  10. 如果某切片发生翻转，请进入 Trace 选项卡中的 Tools，选择 Adjust XY Scaling 并将 X 轴设为 -1；然后选择 Correct Z-shrinkage 并将 z 轴设为 -1，之后按常规方式进行分支追踪。当切换回原始方向的切片时，请记得将这些设置恢复。更改 x 轴和 z 轴不会改变分支末端的标签，因此在进行拼接时需确保使用了正确的末端。
  11. 若切片切割厚度与实际安装测量厚度之间存在显著差异，可校正 Z 向收缩。在 Trace 选项卡中选择 Tools，然后选择 Correct Z-shrinkage，输入 z 轴的收缩因子，该因子为切割厚度除以安装厚度所得的小数形式。

结果

在进行电生理记录后，使用生物胞素对海马CA2区的神经元进行填充（图1Ac、Ad 和 1Bc、Bd）。记录完成后，脑片在固定液中固定过夜，随后按照本文所述方案进行神经化学染色及神经元形态学表征。

通过先将切片与一抗孵育，再与荧光标记的二抗孵育，来确定充填中间神经元中的钙结合蛋白或蛋白含量。记录过程中中间神经元的放电特性将决定所使用的一抗种类。采用Avidin-AMCA对生物胞素充填的中间神经元进行可视化，使用抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）和驴抗兔Texas Red（TR）来表征中间神经元的神经化学性质图1Bb).

荧光成像后，采用辣根过氧化物酶（HRP）染色法显示生物胞素标记的神经元（图1Ab）。随后使用神经元三维重建软件绘制CA2区中间神经元的精细解剖结构（图2 和 图3a）。视频展示了在CA2区记录并注入生物胞素的一个篮状细胞的三维重建过程。若神经元的树突和轴突分支均完整地位于450–500 μm厚的脑片深度范围内，则认为该神经元重建完整。轴突分支染色不佳的判断标准包括：轴突分支在脑片顶部或底部出现截断且末端开放，或染色仅局限于轴突起始段及极近端的分支。图4 展示了生物胞素标记后HRP染色良好与不佳的典型示例。

可通过三维重建的形态计量分析（图3）来展示分支复杂性、胞体表面积以及树突和轴突树突的表面积与体积。

神经元形态与电生理学，CA2区篮状细胞，示意图，活动数据，突触分析。
图1： 在体外通过细胞内记录获得的海马CA2区两种类型篮状细胞的神经元重建及其相关电生理数据体外。本图经修改自先前的研究23,24。SO 分子层，SP 锥体细胞层，SR 辐射层，SLM 漏斗分子层。（A）Aa：使用绘图仪（1000倍）重建的具有局限性树突和轴突分支的CA2区篮状细胞。树突以黑色表示，轴突以红色表示。Ab：按照本文所述亲和素-HRP方案染色后，生物胞素标记的篮状细胞图像。Ac：对具有局限性树突和轴突分支的CA2区篮状细胞施加超极化和去极化电流脉冲后，典型的电压反应轨迹。Ad：使用锐电极记录的CA2区锥体细胞与窄分支篮状细胞之间连接的示例。复合兴奋性突触后电位（EPSP）平均值显示，在三连串动作电位刺激期间出现短暂的突触抑制。（B）Ba：使用绘图仪（1000倍）重建的具有广泛树突和轴突分支的CA2区篮状细胞的二维重建图。该篮状细胞的树突（黑色）径向延伸穿过CA2区所有层，并在CA2和CA3区的SO与SP层中水平延伸。其中一条水平树突还延伸至CA1区。轴突（红色）延伸至CA3和CA1区。Bb：生物胞素标记（AMCA染色）的篮状细胞表现为PV免疫阳性（FITC染色）且CB免疫阴性（Texas-Red染色）。Bc：对具有广泛树突和轴突分支的CA2区篮状细胞施加超极化和去极化电流脉冲后，典型的电压反应轨迹。Bd：复合EPSP平均值显示，在三连串动作电位刺激期间出现短暂的突触易化。其他类型CA2区中间神经元的记录示例可参见先前的研究25,30。请点击此处查看该图的放大版本。

黄色3D结构建模；示意图（A：轮廓图，B：表面图，C：神经网络分析）
图2： 细胞体的3D重建。（A）细胞体的3D追踪。在聚焦穿过细胞体不同z位置时，所追踪的各个轮廓视图。（B）不同轮廓的3D视图。（C）从不同角度观察的细胞体3D视图。请点击此处查看此图的放大版本。

神经元投射示意图、树突分支图表、分支分布分析的直方图。
图3： 三维神经元重建的形态计量学分析。（A）CA2区窄型树突丛篮状细胞的三维重建图。每条树突分支以不同颜色表示（绿色、蓝色、红色和粉色），轴突为浅蓝色。（B）篮状细胞的树状图，显示位于以胞体为中心、每隔100 μm的同心球面内的树突分支数量及各段长度。树状图中的颜色与A图中树突颜色相对应。（C）对CA2区锥体细胞进行形态计量学分析的示例（改编自先前研究23）。图中绘制了CA2区锥体细胞树突分支数量随距胞体距离的变化关系。请点击此处查看该图的放大版本。

神经结构显微图像，标注区域对比；细胞细节的视觉分析。
图4： HRP染色良好（A）与较差（B）的示例。（A）生物胞素回收显示CA2区一个填充良好的中间神经元。胞体（CB）染色深，轮廓清晰。树突呈串珠状，并可见少量树突棘（以红色星号标示）。轴突分支（A）密集，具有小的突触小结。（B）CA2区两个锥体细胞树突和轴突染色较差的示例。胞体染色浅淡，轮廓不清晰。染色效果差通常与较短的电生理记录相关，导致生物胞素填充的分支极少。请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：一种树突分支受限的 CA2 篮状细胞（也称为 CA2 窄树突篮状细胞）的三维神经元重建，其胞体位于锥体细胞层，树突跨越所有层，轴突位于 CA2 锥体细胞层以及相邻的辐射层和始层。 极少数分支到达近端 CA3 始层和 CA3 锥体细胞层。该细胞在电生理记录后用生物胞素灌注，切片按照本文所述方案经亲和素-HRP 处理。由于切片原因，仅保留了切片深度范围内的轴突，而树突保持完整。树突显示为深粉色，轴突为白色。视频开头添加了层和区域边界。三维重建由 Georgia Economides 完成，三维视频由 Svenja Falk 制作。该视频按照步骤 2.17 中所述的神经元重建软件录制，并使用视频编辑软件进行编辑。视频链接：30。请点击此处下载该视频。

所用溶液成分/配制方法
固定液4% 多聚甲醛、0.2% 饱和苦味酸溶液、0.025% 戊二醛溶液，溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）中
0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.6取 100 mL 1 M 磷酸盐缓冲液原液，加入 900 mL 蒸馏水中
磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）pH 7.4/7.5将 10 mL 0.1 M 磷酸盐缓冲液、0.2 g KCl 和 8.76 g NaCl 加入 990 mL 蒸馏水中
TRIS 缓冲液 pH 7.5将 5.72 g 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris Hydrochloride）和 1.66 g 三羟甲基氨基甲烷碱基（Tris Base）溶于 50 mL 蒸馏水中，再用蒸馏水定容至 1 L
缓冲戊二醛与多聚甲醛固定液4% 多聚甲醛、0.2% 饱和苦味酸溶液、0.025% 戊二醛溶液，溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液中
ABC 溶液使用前至少 30 分钟由 ABC 试剂盒配制：将溶液 A 和溶液 B 各 1 滴加入 2.5 mL PBS 中
Durcupan 环氧树脂：配制 20 个样品杯用量：组分 A 20 g、组分 B 20 g、组分 C 0.6 g、组分 D 0.4 g
用圆形滤纸覆盖天平托盘，防止洒漏。按上述比例将试剂小心称量至三口烧杯中。用两根木棒剧烈搅拌至少 5 分钟，充分混匀，直至混合物呈均匀的深棕色。将烧杯置于约 50 °C 烤箱中，最多加热 10 分钟，以尽可能去除气泡。注意：若在烤箱中放置超过 10 分钟，树脂将开始固化。将树脂分装至塑料样品杯或 5 mL 注射器中，标注日期，并储存于 -20 °C 冰箱中备用。

表1：溶液配制表。 

讨论

电生理记录 体外 (图1 乙酰基,d 和 Bc,d）结合组织化学和免疫组织化学方法，能够揭示所记录的成年皮层中间神经元的详细形态、钙结合蛋白含量及其身份。在CA2区，该技术首次实现了对局部环路的研究，并揭示了此前在CA1或CA3区未被描述的中间神经元亚类：具有广泛树突和轴突分支的篮状细胞（图1B双层细胞和SP-SR中间神经元。

本文所述方案经过优化，可有效保存神经元的超微结构，并实现树突（包括树突棘）和轴突分支的优异形态恢复。关键步骤包括采用双重固定技术以增强光学显微镜下的对比度26，以及在固定液中添加戊二醛和苦味酸溶液，以增强抗体渗透性并维持神经元的超微结构27。温和的冻融透化处理有助于更好地保存细微结构，而锇酸处理及树脂包埋则可减少Z轴方向的收缩28。此外，通过将切片与H2O2和NaBH4孵育以降低背景染色，可改善对极细微结构（例如具有小突触小体的细小轴突）的观察效果。在HRP反应中加入NiCl2也可进一步增强对比度。

本文所述的组织学操作在可重复性和可靠性方面具有优良的效果。然而，电生理记录的持续时间将决定生物胞素/荧光染色的质量，通常记录时间较短会导致轴突染色效果较差。记录方案的选择（采用锐电极的细胞内记录与全细胞膜片钳记录）也可能影响生物胞素的保留以及精细解剖结构的保存。

尽管人们认识到，在组织学处理过程中保持精细结构的完整性存在困难，且在100倍放大下进行重建需要较长时间（根据轴突的复杂程度，耗时1至4周），但该方法能够准确呈现树突和轴突的直径。采用操作更简便的方案来显示生物胞素标记是可以理解的，然而这些方法往往难以清晰显示细小的轴突分支。在较厚切片中，通常需要使用去垢剂以促进亲和素-辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）进入组织从而显示生物胞素及抗体，但这可能破坏精细结构。神经科学家一直在不断探索半自动化的重建方法，但目前对于轴突而言，生物胞素-辣根过氧化物酶（biocytin-HRP）结合人工重建仍是金标准31。

高度详细的神经元重建，特别是轴突末梢和结节的精确绘图、有无髓鞘的存在，以及更普遍的完整轴突分支的绘制，包括沿其长度的轴突直径变化的准确呈现，为准确鉴定特定类型的中间神经元提供了进一步的信息。尽管许多中间神经元可能并不完全符合某一特定类别，但上述技术可提供神经元电生理特性、特定连接类型相关的短期可塑性以及详细的神经元重建之间的关联数据，从而能够对例如CA2区域的神经环路图进行深入研究。

精细的细节结构在计算模型中常常被简化。尽管这种简化可以理解，但却会导致可能在未来至关重要的信息丢失。对包含并行突触数据的详细三维重建进行分析，将有助于增加中间神经元分类的更多标准。这些数据可存入公共数据库，供建模人员用于计算探索轴突直径和髓鞘化程度的偶然变化对动作电位传导的影响。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得了诺华制药（巴塞尔）和授予亚历克斯·汤姆森教授的医学研究理事会、生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC- BB/G008639/1）、生理学会，以及欧盟“地平线2020”科研与创新框架计划下特定资助协议编号720270（人脑计划SGA1）和编号785907（人脑计划SGA2）的资助。我们非常感谢亚历克斯·汤姆森教授在其他皮质区域建立实验方案、争取经费以及对本项目持续的支持。谨此致谢实验室成员在优化恢复方案和重建CA2神经元方面所做出的贡献：J. Deuchars、H. Pawelzik、D. I. Hughes、A. P. Bannister、K. Eastlake、H. Trigg、N. A. Botcher。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
亲和素-7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸（Avidin-AMCA）抗体 - 20.8 mg/mL Vector laboratoriesA2008
生物胞素  ≥98%（薄层层析法）SigmaB4261
3,5-二氨基苯甲酸（DAB）片剂，用于配制5 mL溶液SigmaD4293
Durcupan 环氧树脂 ASigma44611
Durcupan 环氧树脂 BSigma44612
Durcupan 环氧树脂 CSigma44613
Durcupan 环氧树脂 DSigma44614
乙醇，特纯 p.a.，无水，≥99.8%Sigma32221
明胶Sigma48723
戊二醛溶液，I级，25% 水溶液（H2O）SigmaG5882
甘油，≥99% SigmaG5516
山羊血清SigmaG9023
山羊抗小鼠异硫氰酸荧光素（FITC）抗体 - 14.3 mg/mLSigmaF2653
山羊抗兔德克萨斯红（TR）抗体 - 3.3 mg/mLInvitrogenT2767
过氧化氢，30% 溶液SigmaH-1009
浸油，黏度 1.250 cSt（文献值）SigmaI0890
氯化镍（NiCl2 · 6H2O）Sigma N5756
四氧化锇，用于电子显微镜，4% 水溶液（H2O ）Sigma75632
多聚甲醛，试剂级，结晶状 SigmaP6148
苦味酸，以水润湿，≥98%Sigma197378
1 M 磷酸盐缓冲液SigmaP3619
环氧丙烷（C3H6O），99%Alfa Aesar 30765
四氢硼酸钠VWR27885.134
蔗糖Fisher scientificS/8600/53
Trizma 盐酸盐，≥99.0%SigmaT5941
Trizma 基础缓冲液，≥99.9%SigmaT6066
Vectashield 抗荧光淬灭封片剂，折射率 1.45 Vector laboratoriesH-1000
Vectastain Elite ABC HRP 试剂盒Vector laboratoriesPK6100
所用设备 
振动切片机Agar Scientific
C4A 凹形铝制样品杯 GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Leica DMR 显微镜 Leica Microsystems
X-Cite 120PC Q  荧光光源 Excelitas Technologies 
Leica DFC450 数码显微镜相机 Leica Microsystems 
0.18 mm 快线绘图笔 London graphics centre
0.18 mm 快线笔头London graphics centre
0.25 mm 快线绘图笔 London graphics centre
0.25 mm 快线笔头London graphics centre
Neurolucida 系统，包括 PC 工作站、载物台、相机和用于 XYZ 轴控制的操纵杆Microbrighfield (MBF) Bioscience
Neurolucida 软件版本 2017Microbrighfield (MBF) Bioscience
CorelDRAW 图形套件 X5Corel
视频编辑软件 Adobe Premiere Pro
14 mL 玻璃小瓶Fisher scientific 

参考文献

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生物胞素回收及填充的海马CA2区中间神经元的三维重建
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