使用酸消化法估算全肾肾单位数量

摘要

总体肾单位数量的估算在临床和实验研究中具有重要意义，因为肾单位数量与肾脏及心血管疾病风险增加呈负相关。本文展示了酸消化法的应用，该方法可快速且可靠地估算总体肾单位数量。

摘要

肾单位数量（nephron endowment）是指个体出生时所具有的肾单位总数，因为人类的肾发生（nephrogenesis）在妊娠36周时即已完成，出生后不再形成新的肾单位。肾单位数目（nephron number）则是指出生后任意时间点所测得的肾单位总数。遗传和环境因素均可影响肾单位数量及其后续变化。了解特定基因或因素如何影响肾发生过程以及肾单位的丢失或退化具有重要意义，因为肾单位数量较低的个体被认为更易罹患肾脏或心血管疾病。同时，明确个体一生中环境暴露如何影响肾单位数目，对于评估未来疾病风险也至关重要。因此，能够快速、可靠地评估全肾肾单位数目的方法，是深入理解促进或导致肾发生及肾单位丢失机制的基本实验需求。本文介绍一种基于Damadian、Shawayri和Bricker所描述方法并略作修改的酸消化法，用于估算全肾肾单位总数。酸消化法通过计数肾小球来快速、可靠地估算肾单位数目，其结果与磁共振成像等更先进但昂贵的方法所获得的数据相比，误差在5%以内。此外，酸消化法是一种适用于大量样本或多种实验条件下肾单位数目评估的高效高通量方法。

引言

肾单位是肾脏的基本结构和功能单位¹。从结构上看，肾单位由位于肾小囊内的肾小球（毛细血管和足细胞）以及肾小管组成，肾小管包括近端小管、亨利氏袢和远端小管，远端小管最终汇入集合管。从功能上看，肾单位的作用是滤过并重吸收水和电解质，同时分泌代谢废物。通常情况下，人类的肾单位发生过程在妊娠36周时完成，而在小鼠和大鼠等若干物种中则在出生后不久完成²。肾单位储备量（nephron endowment）指个体出生时所具有的肾单位总数，而肾单位数量（nephron number）则指出生后任意时间点测得的肾单位总数³。术语“肾单位数量”与“肾小球数量”常可互换使用。由于每个肾单位仅含有一个肾小球，因此对肾小球数量的评估是估算肾单位数量的重要替代指标。

评估肾单位储备和肾单位数量具有临床意义，因为已有研究证明，肾单位储备减少和肾单位数量降低与心血管疾病发病率升高相关^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}。根据尸体解剖中对肾脏的研究结果，Brenner 发现高血压个体的肾单位总数低于血压正常个体¹⁶。因此，Brenner 提出假设：肾单位数量与日后发生高血压的风险之间存在负相关关系。Brenner 还假设，肾单位数量的减少会由剩余的肾单位进行代偿。为了维持肾脏正常的滤过率，残存的肾单位通过增加肾小球表面积（即肾小球肥大）来进行代偿，从而减轻肾单位丢失对肾功能造成的不利影响^4,16。

尽管短期内具有保护作用，但长期而言，肾小球肥大会导致钠和液体潴留增加、细胞外液容量增加以及动脉血压升高，从而形成恶性循环，进一步加剧肾小球毛细血管压力升高、肾小球高滤过状态，以及肾单位瘢痕形成（硬化）和损伤^4,16。

获得肾单位数量的估算值或计数具有若干实验优势：1）可提供关于肾发生过程的信息，进而将这些信息与胚胎或母胎环境中的特定基因或影响因素相关联；2）肾单位数量与心血管疾病存在关联，因此，肾单位数量的估算值有望用于预测未来心血管疾病风险^{2,17,18,19,20,21,22}除了母胎环境外，多种疾病会直接影响肾单位数量和肾功能，包括动脉粥样硬化、糖尿病、高血压，甚至正常的衰老过程。^{2,9,10,11,12,22,23}因此，评估整个肾脏的肾单位数量对于理解影响肾发生过程的遗传和环境因素至关重要（即，肾单位数量（nephron endowment）及其在人一生中的变化，以及对肾功能和心血管健康产生的影响。

目前，已有多种可用于肾单位数量测定与定量的方法，每种方法均有其各自的优势与局限性^{24,25,26,27,28,29,30}。用于测定全肾肾单位数量的先进技术包括体视学方法（如分割器/分数器法）以及磁共振成像^25,26。其中，分割器/分数器法通常被视为测定全肾肾单位数量的金标准，但其成本高昂且耗时较长。近年来磁共振成像及其图像处理技术的进步已提供了可对每一个肾单位进行单独计数的工具。然而，磁共振成像不仅耗时，而且费用极为昂贵。此外，分割器/分数器法与磁共振成像均需要高级的技术专长，因此限制了这些方法在大多数研究实验室中的应用。

大多数测定肾单位数量的方法都是基于肾小球的鉴定来进行计数或估算，因为肾小球在结构上易于识别。本文描述并演示了用于估算整个肾脏中肾单位数量的酸消化法²⁷。酸消化法快速、可靠，且显著低于其他方法（如分割器/分数器法和磁共振成像）的成本。此外，酸消化法提供的肾单位数量估算结果具有高度可重复性，据报道其结果范围与磁共振成像所测定的结果相当²⁶。

方案

以下列出的试剂和耗材适用于一只小鼠（即两个肾脏）的全肾肾单位数量测定。适用于大鼠的酸消化法修改步骤以星号标出。所有实验方案均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求，并已获得密西西比大学医学中心机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 肾脏分离步骤

1. 称量小鼠（或其他物种）体重，并通过异氟烷（5% - 8%）过量吸入或戊巴比妥钠（150 mg/kg 腹腔注射）实施安乐死。
2. 小鼠安乐死后，沿腹中线使用精细手术剪刀切开腹腔。
3. 小心将肠道和生殖脂肪组织移至腹腔右侧。通过肉眼解剖分离左肾，使用精细手术剪刀剪断左肾动脉和静脉，小心取出左肾，并将其放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的已标记（小鼠编号/标识符）称重皿中。
4. 对右肾重复相同操作。
5. 将每侧肾脏从对应的称重皿中取出，置于预先用 PBS 润湿的手术纱布上。
6. 将肾脏保留在手术纱布上，迅速去除附着的非肾组织（如肾周脂肪或肾上腺），随后去除肾包膜。分别称量每侧肾脏，并在实验记录本中单独记录左肾和右肾的重量。

2. 匀浆、孵育和过滤步骤

1. 称重每个肾脏后，倒掉每个称重皿中的 PBS，将肾脏放回相应标记的称重皿中。使用干净的刀片沿长轴将肾脏纵向切成两半。将每半肾脏切面朝下，切成厚度为 2 mm 或更小的组织块。
2. 使用同一把剃刀，小心收集切碎的肾脏组织，并将其放入已标记的15 mL锥形管中（小鼠编号/标识符；左侧 与 右肾
3. 对另一侧肾脏重复上述操作，使用新的刀片。将切碎的肾脏组织放入预先标记好的另一个15 mL锥形管中。
4. 在通风良好的通风橱中，向每个15 mL锥形管中加入5 mL 6 M盐酸（HCl）。
5. 盖上锥形管盖，轻轻振荡肾脏/HCl混合物，将15 mL锥形管放入预热至37 °C的水浴中孵育90分钟（大鼠肾脏为120分钟）。
6. 孵育期间，每隔15分钟轻轻振荡每个15 mL离心管，以确保所有组织均接触盐酸。
7. 将一支18号针头插入5 mL注射器中（大鼠使用10 mL注射器），小心取出注射器活塞。将注射器置于生物安全柜中的50 mL锥形管（管#1）内。
8. 从水浴中取出肾脏/HCl溶液，将组织溶液倒入注射器的开口端，并将15 mL圆底离心管置于试管架上备用。小心重新插入活塞，缓慢推动活塞，使溶液通过针头挤入1号管中。
9. 用5 mL PBS溶液清洗15 mL离心管。在15 mL离心管中轻轻旋转PBS，以溶解任何残留的肾组织。
10. 再次小心地从装有18-G针头的5 mL注射器中取出活塞，将15 mL锥形管中的内容物倒入注射器的开口端。小心地将活塞重新插入，并通过轻轻推动活塞将液体排入1号管中，以冲洗注射器。重复此过程2次（共进行3次）。
11. 将21号针头插入新的5 mL注射器（大鼠使用10 mL注射器）中，并小心取出注射器活塞。将带有21号针头的注射器放入一个新的50 mL离心管（管#2）中。
12. 将1号管中的内容物倒入含有21-G针头的注射器开口端。小心插入活塞，通过轻压注射器活塞，将挤出的溶液排入2号管中，以冲洗注射器。
13. 用5 mL PBS溶液清洗1号管。轻轻旋动1号管中的PBS，以溶解任何残留的肾组织。
14. 再次小心地从装有18号针头的5 mL注射器中取出活塞，将1号管中的内容物倒入注射器的开口端。小心地重新插入活塞，通过轻轻推动活塞冲洗注射器，将溶液排入2号管中。重复此过程2次（共进行3次）。
15. 通过向2号管中加入PBS，将总体积补至50 mL，达到2号管上的50 mL刻度线。
16. 将含有肾组织溶液的2号管置于摇床平台的试管架上，在4 °C冰箱中孵育过夜（至少8 - 10 h）。

3. 肾小球计数与肾单位数量的推算

1. 从冰箱中取出2号管，通过轻轻反复倒置管子使沉淀的组织重新悬浮，以形成均匀的溶液。建议在处理后5天内完成肾小球计数。
2. 将500 µL肾脏溶液小心地分装至12孔板中的一个孔内。重复此操作两次，将每份分装液分别加入不同的孔中，使每个肾脏的溶液共分布在三个孔中，以进行三复孔分析。
3. 向含有肾脏溶液的三个孔中各加入500 µL PBS，进行1:1稀释。
4. 使用倒置显微镜计数每孔中的肾小球数量。可在每个孔底部放置一个分为16个独立区域的网格辅助计数。分别计数每个网格区域内的肾小球数目，然后将每个网格的计数相加，得到每孔肾小球的总数。肾小球因其球形结构而易于识别，其他识别特征包括因毛细血管充血而呈现的微红色，以及仍附着在单个肾小球体上的入球或出球小动脉（图1）。
5. 将三个孔中计得的肾小球总数相加，再除以3，得到每500 µL肾脏溶液中肾小球的平均数量。若每孔肾小球平均数量的变异度大于10%，应重复肾单位计数步骤，并特别注意确保肾脏溶液的均匀性。将每孔计得的肾小球数量乘以100，即为每个肾脏中肾小球的平均总数。总肾单位数量可表示为每肾脏的数量，或根据肾脏重量表示为每毫克或每克组织中的数量。

结果

以下是一个已建立的高血压小鼠模型和一种与年龄相关的慢性肾病遗传性大鼠模型中全肾肾单位数量的代表性估算结果。对于初次使用酸消化法的研究人员，文中重点标出了肾小球的关键鉴别特征，例如球形结构，以及是否存在相连的入球或出球小动脉或小管结构。图1).

在第一个实验示例中，测定了经溶剂（生理盐水）或血管紧张素II输注14天的小鼠（雄性C57BL/6，6周龄）的总肾单位数量。在溶剂输注小鼠中，通过酸消化法测定每只肾脏的肾单位数量为12,411 ± 248个肾单位（图2）。这些估算值与先前报道的小鼠全肾肾单位数量范围一致（Table 1）。血管紧张素输注14天后使心房压升高约40 mmHg，并伴随肾单位数量显著减少至每只肾脏9,122 ± 193个，降幅接近26%（图2

讨论

采用良好的实验技术，酸消化法是估算完整肾脏肾单位数量的理想方法。尽管肾脏在酸中被溶解，肾小球仍能保持基本完整且易于识别，使得单个肾小球的计数相对容易且直接。酸消化法具有多个优势。首先，该方法快速便捷，所需经费和体力投入均较少。实施酸消化法所需的所有试剂和耗材在大多数基础实验室中均可方便获得，唯一的主要条件是具备一台用于肾小球计数的倒置显微镜。从成本来看，估计每只动物的酸消化法成本仅为数百美元，与其它全肾肾小球计数方法（如磁共振成像）相比成本较低，后者每只动物的扫描时间和技术投入费用可达数千美元。

其次，与全肾肾单位计数的其他方法（如分割器/分数法）相比，酸消化法涉及的组织处理时间显著更短²⁴。从开始到结束，酸消化法总共所需时间不足24小时，其中每只实验动物的肾脏处理及单个肾小球计数仅需1至2小时。相比之下，分割器/分数法劳动强度大，每只肾脏约需15小时的人工操作时间（切片4至6小时，染色2至3小时，计数4至5小时），此外还需48至72小时使用甲基丙烯酸甲酯处理肾脏²⁴。由于在成本和时间方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷麻醉	雅培实验室	05260-05
异氟烷蒸发器系统 &和流量计	Braintree Scientific	VP I	包含医用级氧气供应
徕卡倒置显微镜 DMIL LED	徕卡显微系统	DMIL LED	任何品牌均可适用
数字水浴锅	Fisher Scientific	2239	任何品牌均可适用
ToughCut 精细手术剪	Fine Science Tools	14058-11	25 mm 切割刃，11.5 cm 长度；尖端类型：尖-尖；尖端形状：直形
微型解剖镊子 4 1/4 英寸	Biomed Res Instruments, Inc	10-1760	弯曲尖端
5 英寸 × 7 英寸的有机玻璃板	任何合适的来源	n/a	任何品牌均可适用
六边形聚苯乙烯称量皿	Fisher Scientific	02-2002-100	任何品牌均可适用
剃刀刀片	Fisher Scientific	12-640	单刃碳钢 0.009
4 英寸 × 4 英寸 8 层纱布敷料	Fisher Scientific	MSD-1400250
10倍浓缩磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	P5493-4L	稀释至1倍浓度
6 N 盐酸溶液	Sigma Aldrich	3750-32
15 mL 锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-70C	任何品牌均可适用
50 mL 锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-49A	任何品牌均可适用
一次性5 mL注射器	Cole Palmer	EW-07944-06	任何品牌均可适用
18G1.5 一次性针头	Fisher Scientific	14-826-5D	任何品牌均可适用
21G1.5 一次性针头	Fisher Scientific	14-826-5B	任何品牌均可适用
带盖12孔细胞培养板	Cole Palmer	#FW-01959-06	任何品牌均可适用
聚丙烯模块化试管架	Cole Palmer	#EW-06733-00	可容纳 15 和 50 mL 离心管；任何品牌的离心管均适用