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使用酸消化法估算全肾肾单位数量

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DOI：

10.3791/58599

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2019年5月22日

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1Department of Pharmacology and Toxicology, The University of Mississippi Medical Center, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Rush University Medical Center, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, The University of Mississippi Medical Center, 4Department of Neurology, The University of Mississippi Medical Center

本文内容

摘要

总体肾单位数量的估算在临床和实验研究中具有重要意义，因为肾单位数量与肾脏及心血管疾病风险增加呈负相关。本文展示了酸消化法的应用，该方法可快速且可靠地估算总体肾单位数量。

摘要

肾单位数量（nephron endowment）是指个体出生时所具有的肾单位总数，因为人类的肾发生（nephrogenesis）在妊娠36周时即已完成，出生后不再形成新的肾单位。肾单位数目（nephron number）则是指出生后任意时间点所测得的肾单位总数。遗传和环境因素均可影响肾单位数量及其后续变化。了解特定基因或因素如何影响肾发生过程以及肾单位的丢失或退化具有重要意义，因为肾单位数量较低的个体被认为更易罹患肾脏或心血管疾病。同时，明确个体一生中环境暴露如何影响肾单位数目，对于评估未来疾病风险也至关重要。因此，能够快速、可靠地评估全肾肾单位数目的方法，是深入理解促进或导致肾发生及肾单位丢失机制的基本实验需求。本文介绍一种基于Damadian、Shawayri和Bricker所描述方法并略作修改的酸消化法，用于估算全肾肾单位总数。酸消化法通过计数肾小球来快速、可靠地估算肾单位数目，其结果与磁共振成像等更先进但昂贵的方法所获得的数据相比，误差在5%以内。此外，酸消化法是一种适用于大量样本或多种实验条件下肾单位数目评估的高效高通量方法。

引言

肾单位是肾脏的基本结构和功能单位1。从结构上看，肾单位由位于肾小囊内的肾小球（毛细血管和足细胞）以及肾小管组成，肾小管包括近端小管、亨利氏袢和远端小管，远端小管最终汇入集合管。从功能上看，肾单位的作用是滤过并重吸收水和电解质，同时分泌代谢废物。通常情况下，人类的肾单位发生过程在妊娠36周时完成，而在小鼠和大鼠等若干物种中则在出生后不久完成2。肾单位储备量（nephron endowment）指个体出生时所具有的肾单位总数，而肾单位数量（nephron number）则指出生后任意时间点测得的肾单位总数3。术语“肾单位数量”与“肾小球数量”常可互换使用。由于每个肾单位仅含有一个肾小球，因此对肾小球数量的评估是估算肾单位数量的重要替代指标。

评估肾单位储备和肾单位数量具有临床意义，因为已有研究证明，肾单位储备减少和肾单位数量降低与心血管疾病发病率升高相关4,5,6,7,8,

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方案

以下列出的试剂和耗材适用于一只小鼠（即两个肾脏）的全肾肾单位数量测定。适用于大鼠的酸消化法修改步骤以星号标出。所有实验方案均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求，并已获得密西西比大学医学中心机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 肾脏分离步骤

  1. 称量小鼠（或其他物种）体重，并通过异氟烷（5% - 8%）过量吸入或戊巴比妥钠（150 mg/kg 腹腔注射）实施安乐死。
  2. 小鼠安乐死后，沿腹中线使用精细手术剪刀切开腹腔。
  3. 小心将肠道和生殖脂肪组织移至腹腔右侧。通过肉眼解剖分离左肾，使用精细手术剪刀剪断左肾动脉和静脉，小心取出左肾，并将其放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的已标记（小鼠编号/标识符）称重皿中。
  4. 对右肾重复相同操作。
  5. 将每侧肾脏从对应的称重皿中取出，置于预先用 PBS 润湿的手术纱布上。
  6. 将肾脏保留在手术纱布上，迅速去除附着的非肾组织（如肾周脂肪或肾上腺），随后去除肾包膜。分别称量每侧肾脏，并在实验记录本中单独记录左肾和右肾的重量。

2. 匀浆、孵育和过滤步骤

  1. 称重每个肾脏后，倒掉每个称重皿中的 PBS，将肾脏放回相应标记的称重皿中。使用干净的刀片沿长轴将肾脏纵向切成两半。将每半肾脏切面朝下，切成厚度为 2 mm 或更小的组织块。
    2. ....

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结果

以下是来自已建立的高血压小鼠模型和一种年龄相关性慢性肾病遗传大鼠模型的全肾肾单位数量的代表性估算结果。对于刚接触酸消化法的研究人员，图中重点标出了肾小球的关键鉴别特征，例如球形结构以及是否存在附着的入球或出球小动脉或小管结构（图1）。

在第一个实验示例中，测定了经溶剂（生理盐水）或血管紧张素II输注14天的小鼠（雄性C57BL/6，6周龄）的总肾单位数量。在溶剂输注的小鼠中，通过酸消化法测定每只肾脏的肾单位数量为12,411 ± 248个（图2）。该估算值与先前报道的小鼠全肾肾单位数量范围一致（Table 1）。血管紧张素II输注14天后，心房压力升高约40 mmHg，并伴随肾单位数量显著减少至每只肾脏9,122 ± 193个，降幅接近26%（图2

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讨论

采用良好的实验技术，酸消化法是估算完整肾脏肾单位数量的理想方法。尽管肾脏在酸中被溶解，肾小球仍能保持基本完整且易于识别，使得单个肾小球的计数相对容易且直接。酸消化法具有多个优势。首先，该方法快速便捷，所需经费和体力投入均较少。实施酸消化法所需的所有试剂和耗材在大多数基础实验室中均可方便获得，唯一的主要条件是具备一台用于肾小球计数的倒置显微镜。从成本来看，估计每只动物的酸消化法成本仅为数百美元，与其它全肾肾小球计数方法（如磁共振成像）相比成本较低，后者每只动物的扫描时间和技术投入费用可达数千美元。

其次，与全肾肾单位计数的其他方法（如分割器/分数法）相比，酸消化法涉及的组织处理时间显著更短24。从开始到结束，酸消化法总共所需时间不足24小时，其中每只实验动物的肾脏处理及单个肾小球计数仅需1至2小时。相比之下，分割器/分数法劳动强度大，每只肾脏约需15小时的人工操作时间（切片4至6小时，染色2至3小时，计数4至5小时），此外还需48至72小时使用甲基丙烯酸甲酯处理肾脏24。由于在成本和时间方.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（R01HL107632）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷麻醉雅培实验室05260-05
异氟烷蒸发器系统 &和流量计Braintree ScientificVP I包含医用级氧气供应
徕卡倒置显微镜 DMIL LED徕卡显微系统DMIL LED任何品牌均可适用
数字水浴锅Fisher Scientific2239任何品牌均可适用
ToughCut 精细手术剪Fine Science Tools14058-1125 mm 切割刃，11.5 cm 长度；尖端类型：尖-尖；尖端形状：直形
微型解剖镊子 4 1/4 英寸Biomed Res Instruments, Inc10-1760弯曲尖端
5 英寸 × 7 英寸的有机玻璃板任何合适的来源n/a任何品牌均可适用
六边形聚苯乙烯称量皿Fisher Scientific02-2002-100任何品牌均可适用
剃刀刀片Fisher Scientific12-640单刃碳钢 0.009
4 英寸 × 4 英寸 8 层纱布敷料Fisher ScientificMSD-1400250
10倍浓缩磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma AldrichP5493-4L稀释至1倍浓度 
6 N 盐酸溶液Sigma Aldrich3750-32
15 mL 锥形离心管Fisher Scientific14-959-70C任何品牌均可适用
50 mL 锥形离心管Fisher Scientific14-959-49A任何品牌均可适用
一次性5 mL注射器Cole PalmerEW-07944-06任何品牌均可适用
18G1.5 一次性针头Fisher Scientific14-826-5D任何品牌均可适用
21G1.5 一次性针头Fisher Scientific14-826-5B任何品牌均可适用
带盖12孔细胞培养板Cole Palmer#FW-01959-06任何品牌均可适用
聚丙烯模块化试管架Cole Palmer#EW-06733-00可容纳 15 和 50 mL 离心管；任何品牌的离心管均适用

参考文献

  1. Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
  2. Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics.....

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