我们介绍了一种用于评估癌症患者血浆样本中循环微小RNA（miRNA）表达水平的实验方案。具体而言，我们采用了一种市售的试剂盒进行循环miRNA的提取和逆转录。最后，利用实时荧光定量PCR预点样探针定制板，对24种选定的miRNA进行了检测分析。
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摘要
摘要
人们对液体活检在癌症诊断、预后评估及治疗监测中的应用兴趣日益增加，这促使临床实践中需要可靠且具有实用价值的生物标志物。本文介绍了一种从结直肠癌（CRC）患者血浆样本中提取、逆转录并检测循环miRNA表达水平的实验方案。microRNA（miRNA）是一类长度为18-25个核苷酸的非编码RNA，可在翻译水平调控靶基因的表达，在多种器官的生理病理过程中发挥重要作用，包括促血管生成和抗血管生成功能。miRNA在血清和血浆等生物体液中具有良好的稳定性，使其成为理想的循环生物标志物，可用于癌症的诊断、预后判断以及治疗决策与疗效监测。循环miRNA的提取采用了一种快速且高效的方法，结合了有机溶剂法和柱式法。对于miRNA的逆转录，我们采用了一种多步骤流程，包括在成熟miRNA的3'端进行多聚腺苷酸化、5'端连接接头，随后进行随机miRNA预扩增。我们选用了一个包含24种miRNA的定制面板，通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行检测，并将miRNA探针点样于定制的阵列板上。qRT-PCR反应在实时PCR系统上运行。使用GeNorm软件（v. 3.2）筛选用于数据归一化的看家miRNA。数据采用Expression Suite软件（v 1.1）进行分析，并进行了统计学处理。该方法具有良好的可靠性与技术稳健性，可用于血浆和/或血清等液体样本中生物标志物水平的评估。
引言
结直肠癌（CRC）是全球范围内第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大原因。迄今为止，已批准贝伐珠单抗（B）——一种靶向血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体，以及西妥昔单抗（C）或帕尼单抗（P）——两种靶向表皮生长因子受体（EGFR）的单克隆抗体，与化疗（CT）方案联合用于一线治疗。
K-RAS 和 N-RAS 基因的突变是目前唯一具有临床实用性的生物标志物，可用于识别那些最不可能从抗EGFR为基础的化疗（CT）中获益的患者。尽管已有若干研究致力于寻找可预测患者对B为基础的化疗（CT）反应的生物标志物，但在临床实践中仍严重缺乏可靠且有效的药物1。
miRNA 是一类小分子 RNA（长度为 18-25 个核苷酸），可调控靶基因的翻译，在包括胚胎发生和癌变在内的多种生理病理过程中发挥关键作用。这些分子在血浆/血清、尿液和痰液等生物体液中具有高度稳定性，因此可作为非侵入性取样的可靠生物标志物2。通过采用一组参与血管生成通路的 miRNA，我们旨在鉴定新的循环生物标志物，以预测接受以 B 为基础的化疗方案治疗的转移性结直肠癌（mCRC）患者的临床结局。
我们分析了在一项前瞻性多中心随机Ⅲ期临床试验中接受基于B的化疗的52例mCRC患者 ....
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方案
注意：所有以下步骤均须在符合优良实验室规范（GLP）的无菌通风橱中进行。
1. 血浆采集与保存
- 在K3E EDTA管中采集3 mL外周血样本。
- 在室温下以1,880 × g离心15分钟。
- 将上清液血浆分装为每份450 µL。
- 将样本储存于-80 °C直至使用。
注意：采集后2小时内处理外周血样本。收集血浆时，避免扰动淋巴细胞层。
2. 从血浆样本中提取循环miRNA（材料表）
- 准备提取步骤所需的所有溶液，并将样品解冻。
- 向2倍变性溶液中加入375 µL的2-巯基乙醇，并充分混匀。
- 向miRNA洗涤溶液I中加入21 mL分析纯级100%乙醇，并充分混匀。
- 向洗涤溶液2/3中加入40 mL分析纯级100%乙醇，并充分混匀。
- 将一份血浆样品在室温下解冻，随后开始提取步骤。
- 有机提取
- 将400 µL血浆样品转移至无RNase的2 mL离心管中。
- 加入400 µL ....
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结果
我们分析了一组与血管生成相关的循环miRNA，探讨其与52例接受B为基础的化疗（B-based CT）治疗的转移性结直肠癌（mCRC）患者无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）及客观缓解率（ORR）之间的关系。由于技术上的困难，对血浆样本中此类生物标志物的评估具有挑战性。我们采用了已建立的方法，从患者血浆样本中提取miRNA，并进行逆转录和预扩增。根据制造商的说明，仅需少量修改（特别是在提取步骤中），我们成功地在患者群体中检测到了所有目标miRNA（图 2）。
具体而言，我们分析了每位患者 2 个血浆样本，将基线水平和治疗后改变的 miRNA 表达与患者的临床结局相关联。
我们在800 µL血浆样本（400 µL血浆加400 µL 2倍变性溶液）中对cel-miR-39进行了一系列稀释，浓度分别为.......
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讨论
miRNA是一类小分子非编码RNA（长度为18-25个核苷酸），能够与其靶标信使RNA的3'非翻译区（3' UTR）结合，从而抑制和/或降解该mRNA。因此，miRNA可被视为在翻译水平上调控基因表达的因子。在过去十年中，多种miRNA被发现与肿瘤的发生和发展相关，使其成为用于诊断、预后评估和治疗的潜在临床生物标志物。由于受到核糖核酸酶（RNase）的保护，miRNA在血液、血浆、血清、尿液和唾液等生物体液中以稳定的形式存在，这使其在临床实践中的应用潜力日益受到关注10。
尽管如此，循环miRNA的评估仍是一项具有挑战性的工作，有关样本采集、靶标提取、平台选择以及全局标准化等方面的问题在科学界仍存在广泛争议。
在样本采集与储存过程中，分析前变量与血浆的处理和制备密切相关。我们选择血浆而非血清样本，因为已有充分证据表明后者中miRNA浓度更高，这可能是由于凝血过程中这些分子的释放所致10,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究部分由罗氏制药有限公司（Roche S.p.A.）和意大利药品管理局（AIFA）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无RNase安全锁1.5 mL离心管 | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 无RNase安全锁2 mL离心管 | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| 无RNase 20 µL吸头 | Starlab | S1123-1810 | |
| 无RNase 200 µL吸头 | Starlab | S1120-8810 | |
| 无RNase 1,000 µL吸头 | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA与天然蛋白纯化试剂盒 | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100%无水乙醇（ACS级） | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced预混液 | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA检测引物探针组 | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2–2、1–10、2–20、20–200、100–1,000 µL移液器 | |||
| 台式微量离心机 | |||
| 涡旋振荡器 | |||
| 台式加热模块 | |||
| 通风橱 | |||
| 0.2 mL PCR管 |
参考文献
- Luo, H. -Y., Xu, R. -H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A.
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