转移性结直肠癌患者循环microRNA定制 panel 的检测

摘要

我们介绍了一种用于评估癌症患者血浆样本中循环微小RNA（miRNA）表达水平的实验方案。具体而言，我们采用了一种市售的试剂盒进行循环miRNA的提取和逆转录。最后，利用实时荧光定量PCR预点样探针定制板，对24种选定的miRNA进行了检测分析。

摘要

人们对液体活检在癌症诊断、预后评估及治疗监测中的应用兴趣日益增加，这促使临床实践中需要可靠且具有实用价值的生物标志物。本文介绍了一种从结直肠癌（CRC）患者血浆样本中提取、逆转录并检测循环miRNA表达水平的实验方案。microRNA（miRNA）是一类长度为18-25个核苷酸的非编码RNA，可在翻译水平调控靶基因的表达，在多种器官的生理病理过程中发挥重要作用，包括促血管生成和抗血管生成功能。miRNA在血清和血浆等生物体液中具有良好的稳定性，使其成为理想的循环生物标志物，可用于癌症的诊断、预后判断以及治疗决策与疗效监测。循环miRNA的提取采用了一种快速且高效的方法，结合了有机溶剂法和柱式法。对于miRNA的逆转录，我们采用了一种多步骤流程，包括在成熟miRNA的3'端进行多聚腺苷酸化、5'端连接接头，随后进行随机miRNA预扩增。我们选用了一个包含24种miRNA的定制面板，通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行检测，并将miRNA探针点样于定制的阵列板上。qRT-PCR反应在实时PCR系统上运行。使用GeNorm软件（v. 3.2）筛选用于数据归一化的看家miRNA。数据采用Expression Suite软件（v 1.1）进行分析，并进行了统计学处理。该方法具有良好的可靠性与技术稳健性，可用于血浆和/或血清等液体样本中生物标志物水平的评估。

引言

结直肠癌（CRC）是全球范围内第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大原因。迄今为止，已批准贝伐珠单抗（B）——一种靶向血管内皮生长因子（VEGF）的单克隆抗体，以及西妥昔单抗（C）或帕尼单抗（P）——两种靶向表皮生长因子受体（EGFR）的单克隆抗体，与化疗（CT）方案联合用于一线治疗。

K-RAS 和 N-RAS 基因的突变是目前唯一具有临床实用性的生物标志物，可用于识别那些最不可能从抗EGFR为基础的化疗（CT）中获益的患者。尽管已有若干研究致力于寻找可预测患者对B为基础的化疗（CT）反应的生物标志物，但在临床实践中仍严重缺乏可靠且有效的药物¹。

miRNA 是一类小分子 RNA（长度为 18-25 个核苷酸），可调控靶基因的翻译，在包括胚胎发生和癌变在内的多种生理病理过程中发挥关键作用。这些分子在血浆/血清、尿液和痰液等生物体液中具有高度稳定性，因此可作为非侵入性取样的可靠生物标志物²。通过采用一组参与血管生成通路的 miRNA，我们旨在鉴定新的循环生物标志物，以预测接受以 B 为基础的化疗方案治疗的转移性结直肠癌（mCRC）患者的临床结局。

我们分析了在一项前瞻性多中心随机Ⅲ期临床试验中接受基于B的化疗的52例mCRC患者 "晚期结直肠癌意大利临床试验" （ITACa）。本方案已获得当地伦理委员会（Comitato Etico Area Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori（IRST）IRCCS，编号674）于19日批准^th 2007年9月。所有患者在采集血样前均签署知情同意书。对每位患者，在治疗前及首次临床评估时（治疗8周后）采集静脉血样本，以评估基线miRNA表达水平及其在治疗期间的调控变化，并分析其与患者临床转归的关系。

通过文献检索，我们筛选出21种与血管生成过程相关且已知可在人血浆中检测到的miRNA：hsa-miR-107、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-17-5p和hsa-miR-155-5p。此外，我们选择hsa-miR-223-3p和hsa-mir-484用于内源性标准化^3,4,5,6，并选用来自C. elegans的cel-miR-39作为外源性标准化的加标对照。所有数据标准化均采用2 ̂ ̄(ΔΔCt)法进行。

循环miRNA的检测存在一定的技术难点，因为这些分子在血浆中的含量极低，且由于其序列较短，扩增过程在化学上具有挑战性。基于这些原因，我们选择了一种结合苯酚有机提取与玻璃纤维柱纯化技术的方法。循环miRNA的提取是液体活检领域的一个研究热点，我们选用了一款商业试剂盒，该试剂盒在回收得率的数量和质量方面已被证明是目前最可靠的方法之一^7,8。我们采用了一种在成熟miRNA的5'端添加接头、3'端添加poly(A)尾的逆转录方案，以提高反应的选择性和特异性。

鉴于该方法的稳健性，我们设计了带有预点样探针的定制板，用于RT-PCR，以对每个样本进行双份检测，并在每块板中分析2名患者，如图1所示。

方案

注意：所有以下步骤均须在符合优良实验室规范（GLP）的无菌通风橱中进行。

1. 血浆采集与保存

1. 在K3E EDTA管中采集3 mL外周血样本。
2. 在室温下以1,880 × g离心15分钟。
3. 将上清液血浆分装为每份450 µL。
4. 将样本储存于-80 °C直至使用。
   注意：采集后2小时内处理外周血样本。收集血浆时，避免扰动淋巴细胞层。

2. 从血浆样本中提取循环miRNA（材料表）

1. 准备提取步骤所需的所有溶液，并将样品解冻。
   1. 向2倍变性溶液中加入375 µL的2-巯基乙醇，并充分混匀。
   2. 向miRNA洗涤溶液I中加入21 mL分析纯级100%乙醇，并充分混匀。
   3. 向洗涤溶液2/3中加入40 mL分析纯级100%乙醇，并充分混匀。
   4. 将一份血浆样品在室温下解冻，随后开始提取步骤。
2. 有机提取
   1. 将400 µL血浆样品转移至无RNase的2 mL离心管中。
   2. 加入400 µL 2倍变性溶液，涡旋混匀后短暂离心。
   3. 加入4 µL 1 nM的外参 spike-in，涡旋混匀后短暂离心。
   4. 加入800 µL酸性酚-氯仿溶液。
   5. 涡旋振荡60秒，然后以最大速度（≥10,000 × g）离心15分钟。
   6. 将上层水相转移至新离心管中，注意不要扰动中间相。记录回收体积，并丢弃含有非水相的离心管。
      注意：2倍变性溶液储存于4 °C，可能在此温度下发生凝固。使用前需将其在37 °C水浴中加热10–15分钟，期间偶尔摇动使其溶解。吸取下层含酸性酚-氯仿的相时需小心，避免吸取位于混合物上层的水相缓冲液。将洗脱液或无核酸酶水预热至95 °C。注意加热足够体积的溶液（每份样品100 µL + 10%过量）。
3. 小RNA富集
   1. 向第2.2.6步所得水相中加入1/3体积的100%乙醇，并充分混匀。
   2. 为每个样品将一个滤芯放入新的收集管中。
   3. 将最多700 µL第2.3.1步的裂解液与乙醇混合物转移至滤芯中，于10,000 × g离心30秒。
   4. 若剩余混合物体积>700 µL，将滤过液转移至新离心管中，并重复第2.3.3步；重复操作直至全部混合物通过滤芯。
   5. 测量滤过液的总体积。
   6. 向滤过液中加入2/3体积的100%乙醇，并充分混匀。
   7. 将第二个滤芯放入新的收集管中。
   8. 将最多700 µL样品体积转移至滤芯中，于10,000 × g离心30秒，弃去滤过液。
   9. 重复第2.3.8步，直至全部混合物通过滤芯。
   10. 向滤芯中加入700 µL miRNA洗涤溶液1，将滤芯与收集管一起于10,000 × g离心15秒，弃去滤过液。将滤芯放回同一收集管中。
   11. 向滤芯中加入500 µL洗涤溶液2/3，将滤芯与收集管一起于10,000 × g离心15秒，弃去滤过液。将滤芯转移至新的收集管中。
   12. 将滤芯放入新的收集管中，用500 µL洗涤溶液2/3重复第2.3.11步。弃去滤过液，并将滤芯转移至另一新的收集管中。
   13. 将装有滤芯的收集管于10,000 × g离心1分钟。
   14. 将滤芯转移至新的1.5 mL收集管中，加入100 µL预热（95 °C）的洗脱液或无核酸酶水。
   15. 于10,000 × g离心30秒以回收miRNA，并于-80 °C保存。
       注意：洗涤溶液2/3中可能出现白色沉淀，此为溶液中析出的过量EDTA。在移液操作中应避免吸入这些晶体。

3. 进行逆转录和miRNA预扩增（材料表）

1. 进行多聚腺苷酸化反应
   1. 将所有试剂在冰上解冻，短暂涡旋并离心，使管内物质沉至管底。同时将50% PEG 8000解冻至室温。
   2. 在0.5 mL离心管中配制反应体系，每份样品最终反应体积为3 µL。各试剂用量应额外增加10%的过量体积。
   3. 加入1.7 µL无RNase水、0.5 µL 10x Poly(A)缓冲液、0.5 µL 10 mM ATP，最后加入0.3 µL 5 U/µL PolyA酶。
   4. 短暂涡旋并离心反应混合物，使管内物质沉至管底。
   5. 将2 µL样品转移至反应板或反应管的每个孔中，加入3 µL反应混合物。短暂涡旋并离心，使管内物质沉至管底。
   6. 将反应板或反应管放入热循环仪中，执行以下步骤。
   7. 在37 °C孵育45分钟（多聚腺苷酸化步骤）。
   8. 在65 °C孵育10分钟（终止反应），随后在4 °C保持。
2. 进行连接反应。
   1. 在离心管中配制反应体系，每份样品按以下体积配制，并额外增加10%的过量体积。
   2. 加入0.4 µL无RNase水、3 µL 5x DNA连接酶缓冲液、0.6 µL 25x连接接头、4.5 µL 50% PEG 8000，最后加入1.5 µL RNA连接酶。
   3. 短暂涡旋并离心反应混合物，使管内物质沉至管底。
   4. 向每孔或反应管中含有多聚(A)尾产物的样品中加入10 µL混合液。使用板式振荡器在1,900 rpm下混匀1分钟，或短暂涡旋后离心使管内物质沉至管底。
   5. 将反应板或反应管放入热循环仪，设置如下程序：在60 °C孵育60分钟，随后在4 °C保持。
      注意：50% PEG 8000黏度较高，使用时应保持室温，吸液和排液需缓慢进行。每次吸液和排液后，保持移液器活塞按压状态10秒，以使试剂充分上下流动。
3. 进行逆转录反应。
   1. 在离心管中配制反应体系，每份样品按以下体积配制，并额外增加10%的过量体积。
   2. 加入3.3 µL无RNase水、6 µL 5x RT缓冲液、1.2 µL dNTP混合液（各25 mM）、1.5 µL 20x通用RT引物，最后加入3 µL 10x RT酶混合液。
   3. 短暂涡旋并离心反应混合物，使管内物质沉至管底。
   4. 向每孔或反应管中含连接产物的样品中加入15 µL混合液。使用板式振荡器在1,900 rpm下混匀1分钟，或短暂涡旋后离心使管内物质沉至管底。
   5. 将反应板或反应管放入热循环仪，设置如下程序。
   6. 在42 °C孵育15分钟（逆转录）。
   7. 在85 °C孵育5分钟（终止反应），随后在4 °C保持。
      注意：逆转录产物现可于-20 °C保存，可稳定保存长达2个月。
4. 进行miR-Amp反应（见材料表）。
   1. 在离心管中配制反应体系，每份样品按以下体积配制，并额外增加10%的过量体积。
   2. 加入17.5 µL无RNase水、25 µL 2x miR-Amp预混液，以及2.5 µL 20x miR-Amp引物混合液。
   3. 短暂涡旋并离心反应混合物，使管内物质沉至管底。
   4. 每份样品中，将45 µL反应混合物转移至新的反应板或反应管的每个孔中。向每孔或反应管中加入5 µL逆转录产物。使用板式振荡器在1,900 rpm下混匀1分钟，或短暂涡旋后离心使管内物质沉至管底。
   5. 将反应板或反应管放入热循环仪，按表1所示程序运行。

4. 进行实时荧光定量 PCR

1. 用0.1x TE缓冲液将每个cDNA样品稀释1:10。
2. 计算每个样品所需的孔数/重复数。在离心管中配制反应体系，每个样品按以下体积配制，并额外增加10%的过量体积。
3. 加入4 µL无RNase的水、10 µL 2x快速高级预混液（材料表），最后加入5 µL稀释后的cDNA。
4. 涡旋混匀，短暂离心以收集管壁液体。
5. 将19 µL反应体系转移至每个孔中，密封反应板并短暂离心。
6. 在RT-PCR系统上运行热循环程序（表2）。

结果

我们分析了一组与血管生成相关的循环miRNA在52例接受B方案化疗的转移性结直肠癌患者中的无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）和客观缓解率（ORR）中的意义。由于技术上的困难，对血浆样本中此类生物标志物的评估具有挑战性。我们采用了已建立的方法从患者血浆样本中提取miRNA，并进行逆转录和预扩增。根据制造商的说明，仅对提取步骤等少数环节进行了微调，即成功地在患者群体中完成了所有目标miRNA的检测（图 2）。

特别是，我们分析了每位患者2份血浆样本，将基线水平和治疗后改变的miRNA表达与患者的临床结局进行关联分析。

我们在800 µL血浆样本（400 µL血浆加400 µL 2倍变性溶液）中对cel-miR-39进行了0.05 nM、0.5 nM、5 nM和5 pM的系列稀释，以确定应使用的外参...

讨论

miRNA是一类小分子非编码RNA（长度为18-25个核苷酸），能够与其靶标信使RNA的3'非翻译区（3' UTR）结合，从而抑制和/或降解该mRNA。因此，miRNA可被视为在翻译水平上调控基因表达的因子。在过去十年中，多种miRNA被发现与肿瘤的发生和发展相关，使其成为用于诊断、预后评估和治疗的潜在临床生物标志物。由于受到核糖核酸酶（RNase）的保护，miRNA在血液、血浆、血清、尿液和唾液等生物体液中以稳定的形式存在，这使其在临床实践中的应用潜力日益受到关注¹⁰。

尽管如此，循环miRNA的评估仍是一项具有挑战性的工作，有关样本采集、靶标提取、平台选择以及全局标准化等方面的问题在科学界仍存在广泛争议。

在样本采集与储存过程中，分析前变量与血浆的处理和制备密切相关。我们选择血浆而非血清样本，因为已有充分证据表明后者中miRNA浓度更高，这可能是由于凝血过程中这些分子的释放所致^10,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无RNase安全锁1.5 mL离心管	Eppendorf	0030 123.328
无RNase安全锁2 mL离心管	Eppendorf	0030 123.344
无RNase 20 µL吸头	Starlab	S1123-1810
无RNase 200 µL吸头	Starlab	S1120-8810
无RNase 1,000 µL吸头	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA与天然蛋白纯化试剂盒	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA合成试剂盒	Thermo Fisher	A28007
100%无水乙醇（ACS级）	Carlo Erba Reagents	414605
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced预混液	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA检测引物探针组	Thermo Fisher	A25576
7500实时荧光定量PCR系统	Applied Biosystems	4406984
0.2–2、1–10、2–20、20–200、100–1,000 µL移液器
台式微量离心机
涡旋振荡器
台式加热模块
通风橱
0.2 mL PCR管