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Summary

我们提出了一个评估循环微 rna (mirna) 在癌症患者血浆样本中的表达水平的方案。特别是, 我们使用了商业上可用的循环 mirna 提取和逆转录酶试剂盒。最后, 我们使用实时预斑探针自定义板分析了一个由24个选定 mirna 组成的面板。

Abstract

人们对用于癌症诊断、预后和治疗监测的液体活检越来越感兴趣, 因此需要可靠和有用的生物标志物用于临床实践。在这里, 我们提出了一个方案, 提取, 逆转录酶和评估循环 mirna 的表达水平从血浆样本的结直肠癌 (crc)。微 rna (mirna) 是一类长度为18-25 核苷酸的非编码 rna, 它调节目标基因在平移水平上的表达, 并在生理病理中发挥重要作用, 包括促红细胞生成和抗血管生成功能。各种器官。mirna 在血清和血浆等生物液体中是稳定的, 这使得它们成为癌症诊断、预后和治疗决策及监测的理想循环生物标志物。循环 mirna 提取是使用一种快速有效的方法进行的, 该方法涉及有机方法和基于列的方法。对于 mirna 逆转录酶, 我们使用了一个多步骤的程序, 考虑了成熟 mirna 的 3 ‘ 时的多腺苷酸和 5 ‘ 处的适配器结扎, 然后是随机 mirna 预扩。我们选择了一个 24 mirna 自定义面板, 通过定量实时聚合酶链反应 (qrt-pcr) 进行测试, 并在阵列定制板上发现 mirna 探针。我们在实时 pcr 系统上进行了 qrt-pcr 板运行。使用 genorm 软件选择了用于规范化的家政中心 (第3.2 节)。使用表达套件软件 (v 1.1) 对数据进行分析, 并进行了统计分析。该方法被证明是可靠的和技术上稳健的, 可用于评估液体样品, 如血浆和血清中的生物标志物水平。

Introduction

crc 是全世界第三大最常见的恶性肿瘤和第四大癌症相关死亡原因。迄今为止, 贝伐单抗 (b), 一种针对血管内皮生长因子 (vegf) 和西妥昔单抗 (c) 或 panitumab (p) 的单克隆抗体, 已被批准用于一线治疗联合化疗 (ct) 方案。

k-ras和n-ras基因的突变是唯一能够识别最不可能从抗 egf ct 中受益的患者的临床有用生物标志物。虽然已经进行了几项研究, 以寻找生物标志物, 预测反应的基于 b 的 ct, 仍然严重缺乏可靠和有效的药物用于临床^{实践 1}。

mirna 是小型 rna (长度为18-25 核苷酸), 调节目标基因的翻译, 并在包括胚胎和致癌在内的众多生理病理过程中发挥着至关重要的作用。这些分子在血浆血清、尿液和痰等生物液体中具有高度稳定性, 使其成为用于非侵入性取样的坚固生物标志^{物 2}。利用参与血管生成途径的 mirna 面板, 我们的目标是确定新的循环生物标志物, 能够预测转移性 crc (mcrc) 患者的临床结果, 使用 b 基 ct 方案治疗。

我们分析了在前瞻性多中心随机三期试验 “意大利晚期结直肠癌试验” (itaca) 中使用 b 基 ct 治疗的52例 mcrc 患者。本议定书于^{2007年9月19日}获得地方道德委员会 (comitato etico 地区 vasta e iestito 科学 romagnolo per lo studio e la cura dei tumori (irst) ircs, 第674号)。所有患者在采集血样前都给予了知情同意。对于每个患者, 在治疗前和第一次临床评估 (8周后) 收集静脉血液样本, 以评估基线 mirna 的表达及其在治疗过程中与患者结果相关的调节。

通过对文献的研究, 我们选择了21个与已知在人类血浆中检测到的血管生成过程相关的 mirna: has-msr-107, has-msr-126-3p, has-mil5-5p, has-mil-194-5p, has-mil-595-5 p, has-msr-200b-3p, has-myr-20b-5 p, has-mr-5p, has-m30-3p, has-mir-21-1 p, has-mir-24-3p, has-mra-27a-3p, has-m9b-3p, has-msr-5p, has-msr-424-5p, has-mid9-5p, has-mir-520d-3p, has-mir-92a-3p, has-m1-17-5p 和 has-mir-155 页。我们还选择了 has-mir-223p 和 has-miR-用于内源性^{归一化3、4、5}、⁶和 cel-miR-, 从线虫中纯化, 作为外源归一化的尖峰。所有数据归一化都是使用 2 (ct) 方法执行的。

循环 mirna 的检测带来了一些技术上的困难, 因为分子在等离子体中的含量很低, 而且由于其序列较短, 其扩增具有化学挑战性。出于这些原因, 我们选择了一个既考虑苯酚有机萃取的程序, 也考虑了玻璃纤维柱学方法。循环 mirna 提取是液体活检领域的一个热门话题, 我们选择了一个商业试剂盒, 在恢复的 7^,8的数量和质量方面已经被证明是最可靠的^.我们选择了一种逆转转录 mirna 的协议, 在成熟的 mirna 的 5 ‘ 和 3 ‘ 的聚 (a) 尾添加一个适配器 (a) 尾, 以提高反应的选择性和特异性。

考虑到该方法的鲁棒性, 我们为 rt-pcr 设计了带有预斑探针的定制板, 以评估每个样本一式两份, 并分析了每个板内的2名患者, 如图 1所示。

Protocol

请注意:根据良好实验室规范 (glp), 在灭菌的烟罩下执行以下所有步骤。

1. 等离子体收集和储存

1. 在 k3e edta 管中收集3毫升外周血样本。
2. 在室温下离心管, 温度为 1, 880 x g , 15分钟。
3. 以450μl 的等价物回收上清液等离子体。
4. 将样品存放在-80°c, 直至使用。
   请注意:在收集2小时内处理外周血管。从试管中恢复血浆时, 不要打扰淋巴细胞层。

2. 从等离子体样品中提取循环 mirna (材料表)

1. 准备所有所需的溶液, 并解冻提取步骤的样品。
   1. 在2倍变性溶液中加入375μl 的 2-硫醇, 搅拌均匀。
   2. 在 mirna 洗涤液 i 中加入21毫升 acs 级100% 乙醇, 搅拌均匀。
   3. 在洗涤液中加入40毫升 acs 级100% 乙醇, 搅拌均匀。
   4. 允许血浆脂肪在室温下解冻, 然后开始提取步骤。
2. 有机萃取
   1. 将等离子体样品的400μl 转移到无 rnase 的 2 ml 管中。
   2. 加入400μl 的2倍变性溶液, 通过涡流混合, 并短暂离心。
   3. 加入4μl 的 1 nm 尖峰, 通过涡流混合, 并短暂离心。
   4. 加入800μl 的酸性酚-氯仿。
   5. 涡流为 60秒, 离心机以最大速度 (≥10, 000 x g) 为15分钟。
   6. 将上水相转移到新鲜的管。不要打扰中间阶段。请注意已恢复的体积, 并丢弃含有非释放相的管子。
      请注意:2倍变性溶液保存在 4°c, 并可在此温度下凝固。使用前, 将溶液加热至 37°c, 偶尔搅拌 10-15, 小心提取含有酸性酚-氯仿的底相, 而不是混合物顶部的白色缓冲液。将洗脱溶液或无核酸水预热至95°c。请注意加热足够数量的溶液 (每个样品 100μl + 过量 10%)。
3. 小 rna 富集
   1. 从步骤 2.2.6, 100% 在水相中加入半体积乙醇, 并进行彻底混合。
   2. 将滤芯放入每个样品的新收集管中。
   3. 以 10, 000 x g 的速度将多达700μl 的裂解液从步骤2.3.1 和乙醇输送到滤芯和离心机中, 时间为 30 x s。
   4. 如果有 & gt;700 μL of mixture left, place the filtrate in a fresh tube and repeat step 2.3.3;重复, 直到所有混合物都通过滤芯。
   5. 测量流经的总体积。
   6. 100% 加入 2/体积乙醇, 进行过滤和充分混合。
   7. 将第二个滤芯放入新鲜的收集管中。
   8. 以 10, 000 x g 的速度将高达700μl 的样品体积转移到墨盒和离心机中, 时间为30秒。
   9. 重复步骤 2.3.8, 直到所有混合物都通过滤芯。
   10. 将700μl 的 mirna 洗涤溶液1涂在滤芯上, 并以 10, 000 x g的方式将滤芯离心, 共15秒。将滤芯放在同一收集管中。
   11. 在滤芯上涂500μl 洗涤液, 并以 10, 000 x g 的方式将滤芯离心, 共 15秒 。将滤芯放入新鲜的收集管中。
   12. 将滤芯放入新鲜的收集管中, 用500μl 的洗涤液 2/重复步进2.3.11。丢弃流经, 并将滤芯转移到新鲜的收集管中。
   13. 用 10, 000 x g 的滤芯离心管 1分钟 。
   14. 将滤芯转移到新鲜的 1.5 ml 收集管中, 加入100μl 的预热 (95°c) 洗脱液或无核酸水。
   15. 离心机以 10, 000 x g为 30秒, 以恢复 mirna, 并存储在-80°c。
       注: 在洗涤溶液中可能会形成白色沉淀物。这是从解决方案中释放的多余 edta。避免在移液步骤中绘制这些晶体。

3. 进行反向转录和 mirna 预扩增 (材料表)

1. 进行多腺化反应
   1. 在冰上解冻所有试剂, 然后短暂地旋转和离心以旋转下的内容物。此外, 解冻 50% peg 8000, 使其达到室温。
   2. 在 0.5 ml 离心管中制备反应混合物, 为每个样品获得3微米的反应混合物的最终体积。使用以下卷, 加上每个试剂10% 的多余卷。
   3. 加入1.7μl 的无 rnase 水, 0.5 微米的 10x poly (a) 缓冲液, 0.5μl 的 10mm atp, 最后为 0.3μl 5μμl 多聚 a 酶。
   4. 简单的涡旋和离心鸡尾酒混合旋转下来的内容。
   5. 将样品的2μl 转移到反应板或反应管的每个井, 并加入3μl 的反应混合物。短暂的涡旋和离心机旋转下来的内容。
   6. 将平台管放入热循环器中, 并执行以下步骤。
   7. 在37°c 下孵化 45分钟 (多腺苷酸化步骤)。
   8. 在65°c 下孵化 10分钟 (停止反应), 在4°c 下保持以下。
2. 进行结扎反应。
   1. 在离心管中准备反应混合物, 每个样品的体积如下, 体积超过10%。
   2. 加入0.4μl 的无 RNase-free 水, 3μl 的 5倍 dna 连接酶缓冲液, 0.6μl 的25x 结扎适配器, 4.5μl 的 50% peg 8000, 最后1.5 μl 的 rna 连接酶。
   3. 简单的涡旋和离心鸡尾酒混合旋转下来的内容。
   4. 在每个含有聚 (a) 尾矿产物的井/反应管中加入10μl 的混合物。在 1, 900 转/分的情况下, 通过板振动台混合 1分钟, 或通过短暂的涡流和旋转下来的内容。
   5. 将 plate/反应管放置在具有以下设置的热循环器中: 在60°c 孵育 60分钟, 在4°c 时保持以下。
      注: 50% peg 8000 是高度粘性的。在室温下使用, 吸气和点胶缓慢。在每个抽吸和点胶步骤后 , 将插入器保持 10 秒 , 以使试剂上动。
3. 执行逆转录酶反应。
   1. 在离心管中制备反应混合物, 每个样品有以下体积和10% 的多余体积。
   2. 加入3.3 微米的无 rnach 水, 6μl 的 5倍 rt 缓冲液, 1.2μl 的 dntp 混合 (每个 25 mm), 1.5μl 的20x 通用 rt 引物, 最后3μl 的 10倍 rt 酶混合物。
   3. 简单的涡旋和离心鸡尾酒混合旋转下来的内容。
   4. 在每个含有结扎产物的井/反应管中加入15μl 的混合物。在 1, 900 转/分的情况下, 通过板振动台混合 1分钟, 或通过短暂的涡流和旋转下来的内容。
   5. 将平台/反应管置于具有以下设置的热循环器中。
   6. 在42°c 下孵化 15分钟 (逆转录酶)。
   7. 在85°c 下孵化 5分钟 (停止反应), 在4°c 下保持以下。
      请注意:rt 产品现在可以存储在-20°c, 并将保持稳定长达2个月。
4. 执行 mir-amp 反应 (材料表)。
   1. 在离心管中准备反应混合物, 每个样品的体积如下, 体积超过10%。
   2. 加入17.5μμl 的无 rnase 水, 25μl 的 2x mir-ap 主混合, 2.5μl 的 20x mir-ap 底漆混合。
   3. 简单的涡旋和离心鸡尾酒混合旋转下来的内容。
   4. 对于每个样品, 将反应混合物的45μl 转移到新反应板或反应管的每个井。在每个井或反应管中加入5μl 的 rt 产品。在 1, 900 转/分的情况下, 通过板振动台混合 1分钟, 或通过短暂的涡流和旋转下来的内容。
   5. 将平台/反应管放入热循环器中运行, 如表 1所示。

4. 执行实时 pcr

1. 将每个 cdna 样本稀释为 0.1 x te 缓冲液中的 1:10。
2. 计算每个样本的井次复制数。在离心管中为每个样品准备具有以下体积的反应混合物, 加入10% 的多余体积。
3. 加入4μl 的无 rnase 水, 加入10倍快速高级主混合物 (材料表), 最后加入5μl 的稀释 cdna。
4. 混合涡流和短暂离心旋转下来的内容。
5. 将19μl 的反应混合物输送到每口井, 密封板并进行短暂离心。
6. 在 rt-pcr 系统上执行热协议 (表 2)。

Representative Results

Discussion

mirna 是小型非编码 rna (长度为18-25 核苷酸), 能够结合其目标信使 rna 的 3 ‘ utr 区域并抑制和降解它。因此, 它们可以被认为是翻译水平上的基因表达调节剂。在过去的十年中, 一些 mirna 与癌症的发生和发展有关, 使其成为诊断、预后和治疗的有用临床生物标志物。在 rnase 的保护下, mirna 以稳定的形式存在于血液、血浆、血清、尿液和唾液等生物液体中, 这使得人们对其在临床实践^中的潜在用途越来越感兴趣。

尽管如此, 对循环 mirna 的评估是一项具有挑战性的任务, 在样本采集、目标提取、平台选择和全球规范化方面的困难是科学界热议的话题。

对于样品收集和存储, 预分析变量与等离子体处理和处理密切相关。我们关注的是血浆而不是血清样本, 因为有充分的证据表明, 后者中的 mirna 浓度较高, 这可能是由于这些分子在凝固过程中释放的^{原因是 10,11,12}.为了解决血细胞裂解产生的细胞核酸的释放问题, 我们在血液采集2小时内对样本进行了离心。我们还使用 k3e edta 管, 因为其他抗凝剂已知会干扰扩增步骤 (即肝素), 并可能引发溶血 (即柠檬酸)。由于在分析前阶段避免血小板和淋巴细胞污染至关重要, 我们慢慢地从试管中取出血浆, 没有从试管中取出最后一个 ~ 50μl 的样本。

各种研究表明, 以柱状提取方法优于鸟苷/氯酚基方案^11,13, 但 khoury 等人有效地从血清中分离出质量良好的小 rna。无污染的试剂¹⁴。我们使用的商业试剂盒按顺序执行两种提取方法, 允许适当的 mirna 产量在尖峰浓度方面。我们只对制造商的说明进行了一次修改, 即在每个滤芯清洗步骤后, 总是使用新鲜的收集管, 以消除试剂污染的风险。为了确定样品中的最佳尖峰浓度, 从而避免对后续反应的干扰, 我们首先执行了整个协议, 而在提取步骤中没有添加 cel-miR-, 以评估我们的目标。然后, 我们使用细胞 mir-39 的连续稀释法从同一患者的血浆样本中提取新 mirna, 以确定添加到我们病例系列血浆样本中的最佳浓度 (图 4)。但是, 必须强调的是, 只为一个样本确定的最佳 cel-miR-浓度不一定是整个病例系列的最佳浓度, 因为有一系列内部变量, 如年龄、性别或生活习惯,会影响血液中绝对的 mirna 表达

mirna 逆转录酶和扩增代表2个关键步骤。在 mirna 检测的两种主要技术 (即qrt-pcr 和微阵列) 中, 我们选择了 qrt-pcr, 因为它的灵敏度很高, 我们只需要评估选定的 mirna 面板 (这种方法的一个主要限制是它的低吞吐量)¹⁵。我们使用基于 3 ‘ 聚 a 尾矿和 5 ‘ 结扎适配器序列的逆转录酶化学来扩展成熟的 mirna, 并允许普遍 rt 引物退火。基于单基对识别, 5 ‘ 结扎适配器可以帮助避免常见的偏差, 如那些链接到 5 ‘ 不匹配。该试剂盒还包括低产量样品 (如等离子体) 所需的预放大步骤。虽然有必要, 但此步骤可能会在检测步骤之前引入一些放大偏差。

在该协议中, 我们分析了一个小组的24个选定 mirna 相关的血管生成。特别是, 我们选择了预发现探针定制板, 并按照制造商的说明进行 qrt-pcr 运行。与 mirna qrt-pcr 相关的主要问题是参考基因的选择及其随后的数据分析正常化。

尽管已经进行了大量的研究, 以确定用于正常化的最佳 mirna, 但尚未达成统一的共识。为了解决这一限制, 我们进行了文献搜索, 以确定在我们的案例系列中可以作为参考基因的循环 mirna。

我们还选择了 4个 mirna, 有有力的证据表明 mcrc 患者血浆样本中的表达稳定, 并在我们的病例系列中的一个较小的部分对它们进行了测试。通过 genorm 分析, 将2个最稳定的 mirna 确定为参考家务基因。

总之, 外周血样本中循环 mirna 的评价存在一些已知的困难。然而, 我们认为, 我们使用的方法是可靠和稳健的, 允许深入和准确的研究这些生物标志物, 有可能改变结直肠癌的治疗方案。

Materials

Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes