需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58619

⸱

2018年11月2日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University

本文内容

摘要

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。

摘要

细胞通过一种称为机械转导的过程，将机械刺激转化为生物化学上可检测的信号，从而感知并响应其周围环境中的物理信号。机械转导中的一个关键步骤是细胞内外环境之间力的传递。为了实现力的传递，必须通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用形成持续且连续的物理连接。对于特定的蛋白质-蛋白质相互作用而言，机械负荷可能对相互作用无影响，也可能导致相互作用更快解离，甚至可能稳定该相互作用。理解分子水平上的力学负荷如何决定活细胞中蛋白质的周转，可提供有关蛋白质力学状态的重要信息，进而阐明其在机械转导中的作用。目前用于测量力敏感性蛋白质动态的技术，要么缺乏对蛋白质受力的直接测量，要么依赖于非细胞环境下的测量。本文中，我们描述了一种荧光共振能量转移-光漂白后荧光恢复（FRET-FRAP）技术的操作方案，该技术能够在活细胞内测量力敏感性蛋白质的动态变化。该技术原则上适用于任何基于FRET的张力传感器，有助于在多种亚细胞结构和不同细胞类型中研究力敏感性蛋白质的动态行为。

引言

细胞外环境富含调控细胞行为的生化和物理信号。特别是，微环境的物理特性可介导细胞生长、迁移和分化等关键细胞功能1,2,3,4。微环境力学特性的失调是多种尚无有效治疗方法的疾病的重要组成部分，例如癌症5、动脉粥样硬化6和纤维化7。要全面理解细胞如何将物理刺激转化为生化可检测信号（该过程称为机械转导），需要阐明介导力传递的分子机制，包括细胞内外以及多种亚细胞结构内部的力传递过程。

在亚细胞结构内部，蛋白质持续发生着动态更替，其与结合伙伴之间的结合与解离取决于相互作用的强度8。为了使力能够成功跨越物理距离传递，必须存在一条连续不断的蛋白质-蛋白质相互作用链，这意味着蛋白质的周转速率必须足够缓慢，以维持并将其所受的力传递给其结合伙伴9。尽管蛋白质-蛋白质相互作用通常由蛋白质结构域之间的多个非共价键组成，但这种相互作用常被概念化为一种可在不同条件下从结合态转变为非结合态的状态10,11。对于特定的蛋白质-蛋白质相互作用而言，外力可能对其相互作用寿命无影响，称为"理想键"；也可能缩短其寿命，称为"滑脱键"；或延长其寿命，称为"捕获键"10。因此，蛋白质所受载荷与其动力学行为之间存在着复杂的关联，我们将这种关系称为力敏感性动力学。

为了理解载荷对键合动力学的影响，研究人员已在单分子水平上开展了一系列信息丰富的实验。通过使用分离的蛋白质或蛋白质片段，结合磁镊、光镊和原子力显微镜等操纵技术，这些研究已证明多种相关蛋白质存在力敏感的蛋白质-蛋白质相互作用11,12。整合素13和钙黏蛋白14均为跨膜蛋白，分别在细胞-基质和细胞-细胞相互作用的形成中起重要作用，其动力学行为均已被证实会因受力而发生改变。在细胞内，黏着斑蛋白（vinculin）以依赖于力学的方式被招募至踝蛋白（talin）15和α-连环蛋白（α-catenin）16，并可与肌动蛋白形成捕获键（catch bond）17，表明在载荷条件下，黏着斑蛋白在黏着斑（FAs）和黏附连接（AJs）中均发挥关键作用。单分子研究能够分离特定的蛋白质-蛋白质相互作用，获得明确的结果，但无法反映细胞环境的复杂性。

标志性实验表明，多种亚细胞结构（包括黏着斑（FAs）和黏附连接（AJs））具有力学敏感性，并会在细胞自身产生或外界施加的力学负荷下表现出增强的组装效应18,19,20,21,22。此外，多个理论模型提示，这种力学敏感性组装可能由力敏感的蛋白质动态过程所驱动23,24,25。为了在活细胞内研究这些力敏感的动态过程，已有若干间接方法被采用。荧光漂白恢复技术（FRAP）及其相关技术为测量细胞内蛋白质动态提供了相对简便的方法26,27,28,29。然而，对蛋白质所受负荷的测量则较为有限。一种典型方法是将暴露于细胞骨架抑制剂（用于降低细胞整体收缩力）的细胞与未暴露的细胞进行蛋白质动态比较8,30,31。从概念上讲，这相当于在高负荷与低负荷状态之间进行比较。但该方法并未对两种状态下蛋白质所承受的负荷进行量化，且抑制剂可能带来非预期的生化效应，例如导致F-肌动蛋白丝上关键结合位点的丢失。另一种针对黏着斑（FAs）的方法是利用牵引力显微镜测量黏着斑对基底施加的总作用力，以估算分子水平的负荷，并分析其与黏着斑内单一蛋白质动态之间的关系32。尽管该方法可实现对总作用力的量化，却无法提供分子特异性的信息。黏着斑由超过200种不同蛋白质组成，其中许多蛋白均可承受力学负荷33。因此，仅测量黏着斑的总力输出可能掩盖了多种力传递通路并存的可能性，也无法可靠地反映特定蛋白质所受的负荷。

与以往的力学生物学方法不同，基于FRET的张力传感器的出现使得能够直接测量活细胞内特定蛋白质所承受的力学载荷34,35,36。本文介绍了一种将基于FRET的张力传感器与基于FRAP的蛋白质动力学测量方法相结合的实验方案，我们将该技术称为FRET-FRAP。该方法可同时测量蛋白质所受力学载荷及其动力学行为，从而实现对活细胞中力敏感性蛋白质动力学的评估（图1）。目前，FRET-FRAP技术已成功应用于机械连接蛋白vinculin的力敏感性动力学研究37。研究人员已开发出多种针对不同亚细胞结构中关键蛋白质的张力传感器。例如，针对黏着斑（FAs）中的vinculin34和talin38,39，黏附连接（AJs）中的cadherin和catenin40,41,42，细胞核LINC复合物中的nesprin43，细胞骨架中的α-actinin44和filamin36，以及糖萼中的MUC-145等均已有相应的传感器被开发46。同样，FRAP技术也已被广泛用于研究局灶性黏附8,31、黏附连接47、肌动蛋白皮层26以及细胞核48中力敏感蛋白的动力学行为。未来，FRET-FRAP技术可广泛适用于上述已有的或新开发的各类张力传感器，从而在多种亚细胞结构和生理背景下实现对力敏感性动力学的测量。为此，我们提供了一个详细且通用的FRET-FRAP技术实施方案，适用于不同生物系统。希望该方案能够推动开展多种实验，深入阐明各类力敏感蛋白在调控力传递及介导细胞行为中的作用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 制备用于成像的样本

  1. 在目标细胞类型中稳定表达张力传感器构建体。
    1. 将张力传感器构建体克隆至pRRL载体或其他病毒表达质粒中。
      注意：可采用多种不同的分子克隆工具完成此步骤，包括限制性内切酶、重叠延伸和Gibson Assembly方法35pRRL 载体用于慢病毒转导，可通过人巨细胞病毒（CMV）启动子实现较高水平的蛋白质表达。在特定情况下可能需要使用不同的载体。例如，CMV 启动子在某些细胞类型中会被沉默49此外，只有包含荧光蛋白且序列同源性较弱的基于FRET的传感器（如mTFP1和Venus A206K）可用于构建稳定细胞系。包含青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的传感器则可能发生同源重组50.
    2. 使用标准病毒生产方法，利用psPax2和pMD2.G包装质粒在人胚胎肾（HEK）293T细胞中生成慢病毒51.
      警告：慢病毒只能由经过适当培训的人员在生物安全二级实验室环境中操作。
      注意：此细胞与包装质粒的组合适用于 与 pRRL 联用。其他载体可能需要使用其他系统。
    3. 使用标准转导方案将病毒转导至目的细胞52 并使用流式细胞术分选细胞53 选择表达每种构建体且水平接近内源性表达的均一细胞群体37细胞筛选后，可立即进行实验，或将其进行深低温冻存以备后续使用。对于特定的稳定细胞系，冻融循环次数不得超过两次。
      注意：应使用所研究蛋白缺陷的细胞系（例如，使用vinculin -/- MEFs与张力传感器联用）可提高FRET实验的信噪比，并减少过表达带来的假象。此类稳定的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）系在出现明显表达下降或传感器降解前，可传代约15次。若不希望采用基于病毒的方法，可根据制造商说明书，使用多种商业转染试剂，将张力传感器以合适的质粒（如pcDNA3.1）瞬时转染至多种细胞类型中。转染后24–48小时为最佳表达时间。
  2. 准备用于细胞接种的基质
    1. 获取4个35 mm玻璃底培养皿。
    2. 在细胞培养超净台内，于15 mL标准离心管中，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）配制4 mL浓度为10 µg/mL的纤连蛋白（fibronectin）溶液。轻轻倒置混匀一次，于细胞培养超净台中静置5分钟。
      注意：其他细胞类型的 ECM 蛋白浓度或类型可能需要调整。所提供的条件适用于 MEFs。
    3. 将1 mL纤连蛋白溶液移液至每个玻璃底培养皿中。
    4. 将纤连蛋白溶液在室温下孵育1小时，或在4 °C下孵育过夜。
    5. 吸除纤连蛋白溶液，用 PBS 洗涤一次，加入 1 mL PBS。
  3. 将细胞接种到预先准备好的基质上。
    1. 从处于适合传代的汇合度百分比的6 cm培养皿中获取目标细胞。
      注意：不同细胞类型需要不同的细胞培养条件和传代培养方案。本节提供适用于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的指导原则。通常，MEFs在传代前应培养至85%汇合度。
    2. 在细胞培养罩内操作，用 3 mL PBS 将细胞冲洗一次。加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 培育 5 分钟。
    3. 向6 cm培养皿中加入3 mL完全培养基，收集细胞，并转移至15 mL锥形管中。
      注意：完全培养基的成分取决于所使用的细胞类型。对于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），完全培养基通常定义为含10%胎牛血清、1%抗生素-抗真菌素溶液（含两性霉素B、青霉素和链霉素）以及1%非必需氨基酸（NEAA）溶液的高糖型杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
    4. 以1000 × g离心5分钟，沉淀细胞。
    5. 吸弃培养基，将细胞沉淀重悬于1 mL完全培养基中。
    6. 从纤连蛋白包被的玻璃培养皿中移除 PBS。计数细胞，并将 30,000 个细胞接种至每个纤连蛋白包被的玻璃培养皿中，加入适量完全培养基，终体积为 1.5 mL。
      注意：此细胞密度适用于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），可获得细胞间不接触但不过于稀疏的细胞群体。对于其他细胞类型或成像腔室，具体的细胞数量可能需要相应调整。
    7. 接种后让细胞铺展4小时。在铺展2小时时，吸去生长培养基，用成像培养基冲洗一次，并留下1.5 mL成像培养基。
      注意：该铺板时间适用于MEFs，但其他细胞可能需要调整。然而，培养时间超过6-8小时将导致完全培养基中的血清显著沉积细胞外基质蛋白。成像培养基应含有与完全培养基相同的添加成分，但必须光学透明，且不含在成像通道中产生自发荧光的化合物（如黄素）或淬灭荧光的化合物（如酚红）。一种常用的成像培养基是DMEM-gfp活细胞可视化培养基，添加10% FBS和1%非必需氨基酸溶液。如果背景自发荧光过高，可减少血清用量。如果在初始接种后无法更换培养基，可将细胞直接重悬于含有胰蛋白酶抑制剂的成像培养基中。

2. 设置显微镜进行成像

  1. 打开显微镜。
    1. 首先打开弧光灯。
      注意：弧光灯会释放电磁脉冲，可能损坏其他已开启的设备。
    2. 打开滤光轮控制器、自动载物台控制器、显微镜-计算机接口以及相机。
    3. 打开FRAP激光器和激光位置控制器。
      警告：高功率激光器若被直接观察，可能对眼睛造成损伤。建议配置显微镜系统，使激光激发光无法进入目镜。可通过在漂白过程中将一面反射镜移入FRAP光路，将激光反射至样品方向，从而阻止其传输至目镜。
    4. 打开计算机并启动显微镜控制软件。
    5. 等待15分钟，使弧光灯和FRAP激光器充分预热。
  2. 校准FRAP激光器。
    1. 打开激光配置窗口。将照明设置（脉冲期间）设为适用于样品激光照射的适当FRAP照明参数。将照明设置（成像期间）设为仅用于成像受体荧光团的合适照明条件。
    2. 在坐标系设置下选择待校准的物镜。取消勾选手动点击校准点，并勾选校准期间显示图像。
    3. 将驻留时间设为10,000 µs，脉冲次数设为100。
    4. 将校准载玻片（由溴化乙锭密封于载玻片与盖玻片之间制成）放入载物台适配器中，盖玻片朝下。
      警告：溴化乙锭为诱变剂，操作时应佩戴手套。若载玻片破损，请依照机构规定妥善处理。
    5. 使用受体照明设置对焦至载玻片表面，该表面可识别为信号最亮的焦平面。涂层中的微小缺陷可见，有助于对焦。
    6. 移动载玻片至成像平面上荧光均匀的区域。
    7. 点击创建设置。软件将启动校准程序，自动完成漂白并检测漂白点的位置。
    8. 通过最终图像评估校准是否成功，图像应为一个3×3排列的漂白点阵列，各点应分布均匀且处于焦点内。保存校准图像以供后续参考。
    9. 取出校准载玻片并安全存放。每次实验开始前应进行校准，但不同样品之间无需重复校准。

3. 选择 FRET 成像参数

  1. 用4%多聚甲醛固定表达张力传感器的细胞样本之一，固定时间为10分钟。多聚甲醛溶液应不含甲醇，通常称为电镜级（EM-grade），以防止荧光蛋白变性。固定后将样本置于PBS中。
    警告：多聚甲醛溶液具有毒性。此步骤应在通风橱中进行，并根据机构规定妥善处理废液。
    注意：该优化过程不依赖于蛋白质动力学，使用固定样本可最大限度延长成像时间，无需担心细胞状态。
  2. 用PBS清洗样本三次，之后保持在PBS中。
    注意：使用大多数市售封片剂会影响荧光团的性质，导致样本不适合进行FRET成像54。理想情况下应立即成像，但也可在4 °C下保存过夜。长时间存放会导致样本质量下降。
  3. 将样本放入显微镜载物台固定装置中以进行成像。
  4. 打开多维采集（MDA）工具。设置三个通道的顺序成像：仅受体激发与发射（受体通道）、供体激发与受体发射（FRET通道）、仅供体激发与发射（供体通道）。
    注意：FRET样本的成像方法有多种。推荐采用三通道或“三滤光片”法结合系统校准手段来测量FRET效率，适用于基于FRET的张力传感器55,56。该方法快速、简单、非破坏性，仅需标准荧光显微镜，且便于在不同日期和成像系统之间比较实验结果。
  5. 使用500 ms的曝光时间及10%中性密度（ND）滤光片扫描样本。寻找一个张力传感器清晰定位于目标结构的细胞。
  6. 为每个成像通道选择500 ms或所需长度的曝光时间，并将ND滤光片设为100%，采集一组FRET图像序列。
  7. 估算每个成像通道中亚细胞结构上传感器的平均强度。信号过低可能导致校正估计不准确、探测器非线性响应或背景信号干扰显著，从而产生错误结果。一般建议信号强度应高于相机动态范围的10%（i.e., 对于16位相机，强度应高于6,000）。
    注意：所有需相互比较的FRET实验必须使用相同的光学设置（曝光时间、滤光片、物镜及其他变量如相机增益或像素合并）。任何设置的改变都会影响显微系统中产生和/或检测到的FRET量。虽然FRET效率测量本身与这些设置无关，但用于确定FRET效率的校准因子却依赖于这些设置。理论上， 可使用不同光学设置对应的多组校准 因子来计算FRET效率，但不推荐这样做。不同设置之间的漂白或光毒性可能存在差异，从而导致虚假结果。
  8. 对同一视野采集第二组FRET图像序列。通过比较各成像通道中传感器的平均强度来评估帧间的光漂白情况。应尽量减少光漂白，理想情况下信号损失应低于1–5%。
  9. 调整成像参数，在最大化信号强度的同时最小化光漂白。粗调时可更改采集过程中使用的ND滤光片；精细调节时可以250 ms为步长调整曝光时间。
  10. 重复步骤3.5 – 3.8，直至在最小化光漂白的前提下获得足够信号。
    注意：通常情况下，在vinculin -/- MEFs细胞中使用vinculin张力传感器时，供体、FRET和受体通道的设置分别为1,500 ms、1,500 ms和1,000 ms。最佳参数值会因照明系统类型、物镜、滤光片组以及传感器表达水平的不同而有所变化。

4. 选择 FRAP 成像的参数

  1. 优化激光设置，以确保对目标区域（ROI）实现完全漂白，同时避免漂白周围区域或造成光损伤。
    1. 用4%多聚甲醛固定一份表达张力传感器的细胞样品，固定时间为10分钟。
      注意：此优化步骤不依赖于蛋白质动力学，使用固定样品可最大限度延长成像时间，无需担心细胞状态。此外，固定可防止可移动蛋白导致的漂白后荧光恢复，从而单独评估漂白效应，避免在漂白发生后至采集第一张漂白后图像之间因快速扩散介导的荧光恢复而产生干扰。
      警告：多聚甲醛溶液具有毒性，该步骤应在通风橱中进行，并根据机构规定妥善处理废液。
    2. 用PBS冲洗样品3次，并将样品置于PBS中保存。
      注意：大多数市售封片剂会影响荧光团的性质，导致样品不适合进行FRAP成像54。理想情况下应立即成像，但样品可在4 °C下保存过夜。长时间存放将导致样品质量下降。
    3. 将样品放入显微镜载物台固定装置中以进行成像。
    4. 打开激光配置窗口。初始设置建议为激光驻留时间为1,000 µs，脉冲数为10次，即扫描ROI区域内每个点将接受10,000 µs的全功率激光照射。
      注意：本实验采用500 mW、515 nm的激光进行漂白，该波长可高效选择性地漂白Vinculin张力传感器中的受体Venus A206K。若使用其他荧光蛋白构建的基于FRET的张力传感器，则可能需要更换不同类型的激光器。
    5. 寻找一个张力传感器在目标结构上定位清晰的细胞，并采集一张图像。
    6. 绘制一个矩形ROI以界定漂白区域，并保存ROI位置。触发激光脉冲，随后再拍摄一张样品图像。
      注意：矩形大小应大致与整个黏着斑（FA）相当。实验间应尽量保持ROI大小一致。对于扩散性影响其动力学的蛋白，需谨慎监控漂白区域。跨膜蛋白（如钙黏蛋白47）或扩散较慢的蛋白27,57尤其需要注意此问题。
    7. 通过检查ROI内是否完全漂白至接近背景荧光水平，评估光漂白质量。同时确认ROI以外区域未发生漂白。
    8. 根据需要调整激光参数，使ROI内实现显著漂白，同时避免在ROI外产生明显漂白。进行粗调时，以100 µs为步长增减驻留时间；进行微调时，以5个脉冲为步长增减脉冲数。
    9. 重复步骤4.1.5 – 4.1.8，直至找到可在无非靶向光漂白的前提下使ROI完全漂白的最低激光设置。
      注意：在不引发光毒性的情况下实现充分的初始漂白，是FRAP分析的关键环节。应采用在固定样品中实现完全漂白的激光设置。通常应使用最少数量的光子达到所需的漂白程度。此外，实验过程中漂白方案应保持相对一致，因为参数变动可能影响蛋白质动力学的测量结果58。
  2. 优化时间序列参数，在充分捕捉目标蛋白动力学的同时，尽量减少光漂白。
    1. 准备适用于活细胞成像的显微镜系统，建议配备加热载物台、加热物镜以及CO2控制装置。预热平衡20分钟。
      注意：为维持成像细胞的健康状态，必须在成像容器中保持适宜的温度和pH值。多种加热载物台和物镜加热器可有效将细胞温度维持在37 °C。对于多数培养基，可通过蠕动泵以15 mL/min流速向样品通入加湿的5% CO2来控制pH。若无法实现CO2控制，建议使用含HEPES的活细胞成像培养基，以防止pH发生较大波动。
    2. 将一份表达张力传感器的细胞样品放入显微镜载物台固定装置中进行成像，平衡10分钟。
    3. 使用MDA工具设置时间序列程序：漂白前采集3–5张图像，随后漂白ROI，并继续采集10–60张图像。
      注意：对于黏着斑处的Vinculin，漂白后每5秒成像一次，持续5分钟，足以观察其动力学变化且不会引入过度光漂白31。其他多种蛋白的成像速率与持续时间的合理起始参数可参考相关文献47,48,59,60。
    4. 采用受体成像设置，在保持足够信噪比的前提下，尽量减少样品的光照暴露。一个良好的起始设置是使用FRET成像时所需中性密度（ND）滤光片和曝光时间的一半。
    5. 寻找一个张力传感器在目标结构上定位清晰的细胞，并拍摄一张图像。
    6. 绘制矩形ROI以标示漂白位置，并保存ROI坐标。启动时间序列成像。
    7. 检查所得图像序列是否存在潜在问题。
      1. 若帧间荧光恢复出现显著跳跃（超过初始强度的10%），应减小帧间时间间隔。
      2. 若随时间推移出现明显的全局荧光衰减（超过初始强度的5–10%），应减少漂白后采集的图像数量和/或调整成像参数以降低样品的光照暴露。
      3. 若在时间序列结束时荧光恢复尚未达到平台期，应延长总成像时长。
    8. 相应调整时间序列参数，并重复步骤4.2.5 – 4.2.7，直至在无全局光损伤的前提下充分捕捉到荧光恢复过程。

5. 获取FRET-FRAP数据

  1. 准备用于活细胞成像的显微镜系统，最好配备加热载物台、加热物镜以及 CO2 控制装置。让系统平衡 20 分钟。
    1. 为确保成像细胞的健康状态，需在成像过程中将成像腔室的温度维持在 37 °C。使用蠕动泵以 15 mL/min 的流速向样品通入加湿的 5% CO2，以维持 pH 值。
    2. 若无法实现 CO2 控制，可改用含有 HEPES 的活细胞成像培养基，以防止 pH 值发生较大波动。
  2. 打开 MDA 工具，并设置 FRET 成像参数，包括不同的滤光片组。
  3. 将此 MDA 保存至实验文件夹中，命名为 MDA_FRET_Date。
  4. 设置另一个 MDA，包含 FRAP 成像参数，包括不同的滤光片组、时间序列设置，以及在预漂白采集后触发激光脉冲的实验记录（journal）。
  5. 将此 MDA 保存至实验文件夹中，命名为 MDA_FRAP_Date。关闭 MDA 窗口。
  6. 在屏幕顶部的工具栏中，选择 Journal | Start Recording。
  7. 打开 MDA 窗口，加载 MDA_FRET_Date 状态并点击 Acquire。然后加载 MDA_FRAP_Date 状态并点击 Acquire。
  8. 在采集结束后，在屏幕顶部的工具栏中选择 Journal | Stop Recording。
  9. 将此实验记录保存至实验文件夹中，命名为 FRETFRAP_Date，并将其添加到工具栏以便快速访问。关闭 MDA 窗口。
  10. 将表达张力传感器的细胞样本之一放入显微镜样品 holder 中进行成像。让样本平衡 10 分钟。
  11. 使用 Acquire | Acquire 下的图像采集功能，以最低曝光时间和中性密度（ND）滤光片观察样本，定位目标细胞。
  12. 通过导航至 Devices | Focus 设置连续自动对焦。手动对焦至样本，直至达到正确的成像平面。
  13. 点击 Set Continuous Focus，等待系统调整完毕后，点击 Start Continuous Focusing。
    注：此步骤非必需，但可显著提高 FRAP 恢复曲线的质量，因为它能防止样本失焦漂移。
  14. 寻找一个张力传感器清晰定位于目标结构的细胞，并拍摄一张图像。
  15. 绘制一个矩形 ROI 以标示漂白区域。保存该 ROI 的位置。
  16. 运行 FRETFRAP_Date 实验记录，系统将开始采集 FRET 图像，随后启动 FRAP 时间序列成像。
  17. 重复步骤 5.14–5.16，直至获得 10–15 组图像。
    注：同一细胞中无法重复测量。一旦发生光漂白，FRET 数据将不可靠。

6. 分析 FRET-FRAP 数据

  1. 使用选定的软件分析FRET图像。
    注意：成像和定量FRET的方法有多种61，包括比值法FRET62和FRET指数法34,35。然而，强烈建议使用FRET效率的估算值55,63来解释FRET-FRAP数据。有关此主题的进一步探讨，请参见讨论部分。对于敏化发射及FRET效率的计算，Hoffman实验室提供了定制软件，获取地址为 https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public。
  2. 对每个被漂白的亚细胞结构量化相关参数。应包括平均FRET指数/效率和平均初始受体强度（与浓度成正比），也可包括ROI大小等物理参数。
  3. 使用选定的软件分析FRAP图像。
    注意：定量FRAP的方法有多种26,27,28,29。关键的实验考虑因素包括校正漂白后成像过程中的额外漂白效应、背景强度的变化，以及高度动态亚细胞结构（如黏着斑）的转位。可通过分析图像中未漂白区域和非荧光区域来实现漂白校正和背景照明变化的校正。高度动态的亚细胞结构，特别是表现出过度生长或解聚动态的结构，不适合标准FRAP分析，不应进行分析。此外，数据归一化有多种方法。本指南提供的是最简单的分析方法。
  4. 对恢复数据进行漂白效应校正，然后归一化至漂白前强度。根据以下方程量化恢复半衰期和可移动组分比例28,34：
    MF - (MF - Ro)e-kt
    其中MF为可移动组分比例，Ro为初始恢复值，k为恢复速率。恢复半衰期由下式确定：
    τ1/2 = ln 2/k。
    注意：有多种公开可用的软件包可用于完成此类分析64，以及多种ImageJ插件。Hoffman实验室提供了定制软件，获取地址为 https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public。当扩散影响目标蛋白的动力学、恢复过程中表现出多个时间尺度，或使用非标准漂白几何形状时，应采用更复杂的分析方法。

7. 解读FRET-FRAP数据

  1. 汇总每个 ROI 的相关信息，包括：FRET 指数/效率、受体强度、FRAP 半恢复时间、FRAP 可移动组分。
    注：FRET 指数或效率用于确定 ROI 内蛋白质所承受的平均载荷。受体强度用于测量蛋白质的局部浓度。恢复半时间用于评估蛋白质的动力学特性，半时间越短，表明周转速度越快。FRAP 可移动组分用于衡量 ROI 内正在活跃周转的蛋白质比例，可移动组分越大，表明 ROI 内有更大比例的蛋白质处于周转状态。
  2. 为探究局部浓度对蛋白质周转速率和周转量的影响，将 FRAP 半恢复时间与可移动组分分别对初始受体强度作图。
  3. 为探究蛋白质载荷对蛋白质周转速率和周转量的影响，将 FRAP 半恢复时间与可移动组分分别对 FRET 指数/效率作图。
    注：根据具体蛋白质或结构的不同，还可进一步考察物理参数（如结构大小或偏心率）对蛋白质载荷或周转特性的影响。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

FRET-FRAP 结合了两种荧光技术，即 FRET 和 FRAP。由于我们关注的是蛋白负载的影响，因此采用了基于 FRET 的张力传感器34,46。这类传感器通常包含一个由两个荧光蛋白（如 mTFP1 和 VenusA206K）通过鞭毛状连接肽相连构成的张力感应模块（图 1A）。当该模块被插入蛋白的头部与尾部结构域之间时，即可测量跨越该蛋白所受的力学负载。在分析 FRET 数据时，使用受体通道采集的图像来评估张力传感器的定位及其浓度，因为该信号不受 FRET 效应的影响（图 1B）。在计算出 FRET 效率后，可通过色度标尺可视化蛋白负载：FRET 效率降低并趋向冷色调表示蛋白负载增加，而 FRET 效率处于红色范围则表明蛋白负载较低（图 1B）。FRAP 成像通过激光对单个亚...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

FRET-FRAP 方法能够直接测量对力敏感的蛋白质动态，这一特性在活细胞内一直难以直接探测。蛋白质动态对分子载荷的敏感性对其作为力传递或力转导分子的功能至关重要。载荷的存在是传递细胞内产生或外界施加的力（称为力传递）以及将这些力转化为可被生物化学检测的信号（称为力转导）所必需的。然而，载荷的变化会影响蛋白质结合状态的持续时间；因此，蛋白质承受载荷的时间越短，力传递给其他蛋白质或转化为可检测生化信号并被感知的机会就越少。FRET-FRAP 方法通过在更广泛的细胞背景下实现对力敏感动态的分子尺度测量，弥合了分子水平与细胞水平之间的鸿沟。此外，该方法允许在通过生化或机械方式扰动细胞内或细胞外环境的同时进行这些测量。该技术适用于任何基于 FRET 的张力传感器，可用于研究多种亚细胞结构及细胞外环境中蛋白质的力学状态。

确保获得理想FRET-FRAP测量结果的关键步骤包括优化成像参数以及进行数据分析与解释。如本实验方案所述，优化成像参数对于限制样品的光损伤至关重要，同时可区分目标结构与动态过程，并为FRET计算提供足够的信号强度。在特定细胞系和目标蛋白的研究初期即确立这些成像参数，将有助于...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了美国国家科学基金会职业奖（NSF-CMMI-14-54257）、美国心脏协会资助（16GRNT30930019）和美国国立卫生研究院资助（R01GM121739-01）的支持，上述资助授予Brenton Hoffman博士，此外Katheryn Rothenberg还获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金。 本内容完全由作者负责，不代表美国国家科学基金会或美国国立卫生研究院的官方观点。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA赛默飞世尔科技25300062
16% 多聚甲醛电子显微镜科学公司30525-89-4
60倍物镜，数值孔径1.35OlympusUPLSAPO 60XO
抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）Gibco15240-062
自动载物台Prior ScientificH117EIX3
定制二向色镜Chroma Technology CorpT450/514rpc
定制 mTFP1 发射滤光片Chroma Technology CorpET485/20m
定制 mTFP1 激发滤光片Chroma Technology CorpET450/30x
定制 Venus 激发滤光片Chroma Technology CorpET514/10x
DMEM-gfp 活细胞成像培养基蓝宝石MC102
杜尔贝科改良伊格尔培养基 Sigma AldrichD5796含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠
胎牛血清HyCloneSH30396.03
人纤维连接蛋白康宁47743-654
FRAPPA 校准片Andor与 FRAPPA 装置一并提供
带有515 nm激光器的FRAPPA系统安道尔
玻璃底荧光培养皿世界精密仪器公司FD35
HEK293-T细胞ATCCCRL-3216
六亚甲基溴化物，PolybreneSigma AldrichH9268-5G
高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基Sigma AldrichD6429
倒置荧光显微镜OlympusIX83
JMP Pro 软件SAS
Lambda 10-3 电动滤光轮Sutter InstrumentsLB10-NW
LambdaLS 弧光灯，配备 300W 无臭氧氙灯泡Sutter InstrumentsLS/OF30
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
MATLAB 软件Mathworks
MEM非必需氨基酸赛默飞世尔科技11140050
Olympus 的 MetaMorphOlympus
微型加湿系统Bioptechs130708
MoFlo Astrios EQ 细胞分选仪Beckman CoulterB25982
目标加热培养基Bioptechs150819-13
OptiMEM赛默飞世尔科技31985070
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichD8537
pMD2.G 包膜质粒Addgene12259
pRRL 载体Kam Leong 博士（哥伦比亚大学）惠赠
psPax2 包装质粒Addgene12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 相机滨松光子学C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF 离心机赛默飞世尔科技75004505
稳定的Z轴载物台加热器Bioptechs403-1926
Venus 发射滤光片SemrockFF01-571/72

参考文献

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101(2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283(2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586(2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549(2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491(2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610(2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

FRET-FRAP 技术机械信号转导蛋白质-蛋白质相互作用黏着斑Vinculin 张力传感器FRAP 成像FRET 成像
利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。