利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

摘要

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。

摘要

细胞通过一种称为机械转导的过程，将机械刺激转化为生物化学上可检测的信号，从而感知并响应其周围环境中的物理信号。机械转导中的一个关键步骤是细胞内外环境之间力的传递。为了实现力的传递，必须通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用形成持续且连续的物理连接。对于特定的蛋白质-蛋白质相互作用而言，机械负荷可能对相互作用无影响，也可能导致相互作用更快解离，甚至可能稳定该相互作用。理解分子水平上的力学负荷如何决定活细胞中蛋白质的周转，可提供有关蛋白质力学状态的重要信息，进而阐明其在机械转导中的作用。目前用于测量力敏感性蛋白质动态的技术，要么缺乏对蛋白质受力的直接测量，要么依赖于非细胞环境下的测量。本文中，我们描述了一种荧光共振能量转移-光漂白后荧光恢复（FRET-FRAP）技术的操作方案，该技术能够在活细胞内测量力敏感性蛋白质的动态变化。该技术原则上适用于任何基于FRET的张力传感器，有助于在多种亚细胞结构和不同细胞类型中研究力敏感性蛋白质的动态行为。

引言

细胞外环境富含调控细胞行为的生化和物理信号。特别是，微环境的物理特性可介导细胞生长、迁移和分化等关键细胞功能^1,2,3,4。微环境力学特性的失调是多种尚无有效治疗方法的疾病的重要组成部分，例如癌症⁵、动脉粥样硬化⁶和纤维化⁷。要全面理解细胞如何将物理刺激转化为生化可检测信号（该过程称为机械转导），需要阐明介导力传递的分子机制，包括细胞内外以及多种亚细胞结构内部的力传递过程。

在亚细胞结构内部，蛋白质持续发生着动态更替，其与结合伙伴之间的结合与解离取决于相互作用的强度⁸。为了使力能够成功跨越物理距离传递，必须存在一条连续不断的蛋白质-蛋白质相互作用链，这意味着蛋白质的周转速率必须足够缓慢，以维持并将其所受的力传递给其结合伙伴⁹。尽管蛋白质-蛋白质相互作用通常由蛋白质结构域之间的多个非共价键组成，但这种相互作用常被概念化为一种可在不同条件下从结合态转变为非结合态的状态

方案

1. 制备用于成像的样本

1. 在目标细胞类型中稳定表达张力传感器构建体。
   1. 将张力传感器构建体克隆至pRRL载体或其他病毒表达质粒中。
      注意：可采用多种不同的分子克隆工具完成此步骤，包括限制性内切酶、重叠延伸和Gibson Assembly方法³⁵pRRL 载体用于慢病毒转导，可通过人巨细胞病毒（CMV）启动子实现较高水平的蛋白质表达。在特定情况下可能需要使用不同的载体。例如，CMV 启动子在某些细胞类型中会被沉默⁴⁹此外，只有包含荧光蛋白且序列同源性较弱的基于FRET的传感器（如mTFP1和Venus A206K）可用于构建稳定细胞系。包含青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的传感器则可能发生同源重组⁵⁰.
   2. 使用标准病毒生产方法，利用psPax2和pMD2.G包装质粒在人胚胎肾（HEK）293T细胞中生成慢病毒⁵¹.
      警告：慢病毒只能由经过适当培训的人员在生物安全二级实验室环境中操作。
      注意：此细胞与包装质粒的组合适用于 与 pRRL 联用。其他载体可能需要使用其他系统。
   3. 使用标准转导方案将病毒转导至目的细胞⁵² 并使用流式细胞术分选细胞

结果

FRET-FRAP 结合了两种荧光技术，即 FRET 和 FRAP。由于我们关注的是蛋白负载的影响，因此采用了基于 FRET 的张力传感器^34,46。这类传感器通常包含一个由两个荧光蛋白（如 mTFP1 和 VenusA206K）通过鞭毛状连接肽相连构成的张力感应模块（图 1A）。当该模块被插入蛋白的头部与尾部结构域之间时，即可测量跨越该蛋白所受的力学负载。在分析 FRET 数据时，使用受体通道采集的图像来评估张力传感器的定位及其浓度，因为该信号不受 FRET 效应的影响（图 1B）。在计算出 FRET 效率后，可通过色度标尺可视化蛋白负载：FRET 效率降低并趋向冷色调表示蛋白负载增加，而 FRET 效率处于红色范围则表明蛋白负载较低（图 1B）。FRAP 成像通过激光对单个亚.......

讨论

FRET-FRAP 方法能够直接测量对力敏感的蛋白质动态，这一特性在活细胞内一直难以直接探测。蛋白质动态对分子载荷的敏感性对其作为力传递或力转导分子的功能至关重要。载荷的存在是传递细胞内产生或外界施加的力（称为力传递）以及将这些力转化为可被生物化学检测的信号（称为力转导）所必需的。然而，载荷的变化会影响蛋白质结合状态的持续时间；因此，蛋白质承受载荷的时间越短，力传递给其他蛋白质或转化为可检测生化信号并被感知的机会就越少。FRET-FRAP 方法通过在更广泛的细胞背景下实现对力敏感动态的分子尺度测量，弥合了分子水平与细胞水平之间的鸿沟。此外，该方法允许在通过生化或机械方式扰动细胞内或细胞外环境的同时进行这些测量。该技术适用于任何基于 FRET 的张力传感器，可用于研究多种亚细胞结构及细胞外环境中蛋白质的力学状态。

确保获得理想FRET-FRAP测量结果的关键步骤包括优化成像参数以及进行数据分析与解释。如本实验方案所述，优化成像参数对于限制样品的光损伤至关重要，同时可区分目标结构与动态过程，并为FRET计算提供足够的信号强度。在特定细胞系和目标蛋白的研究初期即确立这些成像参数，将有助于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔科技	25300062
16% 多聚甲醛	电子显微镜科学公司	30525-89-4
60倍物镜，数值孔径1.35	Olympus	UPLSAPO 60XO
抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩）	Gibco	15240-062
自动载物台	Prior Scientific	H117EIX3
定制二向色镜	Chroma Technology Corp		T450/514rpc
定制 mTFP1 发射滤光片	Chroma Technology Corp		ET485/20m
定制 mTFP1 激发滤光片	Chroma Technology Corp		ET450/30x
定制 Venus 激发滤光片	Chroma Technology Corp		ET514/10x
DMEM-gfp 活细胞成像培养基	蓝宝石	MC102
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Sigma Aldrich	D5796	含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠
胎牛血清	HyClone	SH30396.03
人纤维连接蛋白	康宁	47743-654
FRAPPA 校准片	Andor		与 FRAPPA 装置一并提供
带有515 nm激光器的FRAPPA系统	安道尔
玻璃底荧光培养皿	世界精密仪器公司	FD35
HEK293-T细胞	ATCC	CRL-3216
六亚甲基溴化物，Polybrene	Sigma Aldrich	H9268-5G
高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基	Sigma Aldrich	D6429
倒置荧光显微镜	Olympus	IX83
JMP Pro 软件	SAS
Lambda 10-3 电动滤光轮	Sutter Instruments	LB10-NW
LambdaLS 弧光灯，配备 300W 无臭氧氙灯泡	Sutter Instruments	LS/OF30
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
MATLAB 软件	Mathworks
MEM非必需氨基酸	赛默飞世尔科技	11140050
Olympus 的 MetaMorph	Olympus
微型加湿系统	Bioptechs	130708
MoFlo Astrios EQ 细胞分选仪	Beckman Coulter	B25982
目标加热培养基	Bioptechs	150819-13
OptiMEM	赛默飞世尔科技	31985070
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	D8537
pMD2.G 包膜质粒	Addgene	12259
pRRL 载体			Kam Leong 博士（哥伦比亚大学）惠赠
psPax2 包装质粒	Addgene	12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 相机	滨松光子学	C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF 离心机	赛默飞世尔科技	75004505
稳定的Z轴载物台加热器	Bioptechs	403-1926
Venus 发射滤光片	Semrock	FF01-571/72