小鼠肝脏消化用于淋巴管内皮细胞的流式细胞术分析

摘要

本实验方案的目的是利用已描述的标记物鉴定肝脏内的淋巴管内皮细胞群体。我们采用胶原酶IV和DNase对组织进行轻柔剪切，并结合流式细胞术，以鉴定出一群独特的淋巴管内皮细胞。

摘要

在肝脏中，淋巴管位于门管区，其已知功能是将肝内的组织液引流至淋巴结，在那里对细胞碎片和抗原进行监测。我们非常关注淋巴脉管系统在肝脏炎症及免疫细胞功能中可能发挥的作用。然而，目前关于分离肝脏淋巴管内皮细胞（LECs）的消化方案，或用于在单细胞水平评估肝脏 LECs 的特异性标志物的研究报道极少。因此，我们优化了一种用于肝脏消化和染色的方法，以评估肝脏中 LEC 群体。我们相信，本文所述方法将有助于识别和分离肝脏中的 LECs，并加深我们对 LECs 如何响应肝脏微环境的理解。

引言

肝内淋巴管及淋巴管内皮细胞（LECs）的作用尚不明确。尽管已发现淋巴管存在于肝脏门管区¹，并在疾病过程中发生扩张²，但关于肝内 LECs 的功能及其表型特征仍知之甚少。随着主要表达于 LECs 上的标志物被发现³，这些细胞在不同组织微环境中的稳态与疾病状态下的重要性将填补我们认知中的一个重要空白。LECs 在淋巴结及转移性肿瘤中通过直接与 T 细胞相互作用，在维持外周耐受中发挥关键作用^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}。淋巴结中的 LECs 还可通过与迁移性树突状细胞的相互作用促进保护性免疫应答^14,15,16。因此，LECs 的多种功能可能与其所处的特定组织环境及相互作用对象密切相关。然而，目前对 LECs 如何在组织中与免疫细胞相互作用，以及其在不同器官系统中的功能仍了解甚少；因此，对肝脏或其他器官中 LECs 进行单细胞水平的分析，可能推动我们对 LECs 调控组织特异性免疫机制的理解。尽管目前多数关于肝内 LECs 的研究主要依赖显微镜技术，通过一至两种标志物及形态学特征进行观察¹⁷，但极少有研究采用流式细胞术对 LECs 进行单细胞水平的特异性分析，仅有一项研究比较了肝窦内皮细胞（LSECs）与 LECs 的差异¹⁸。通过流式细胞术对肝脏中 LEC 群体进行分析，有助于深入研究其在正常稳态或疾病状态下的表型特征。

为了通过流式细胞术评估淋巴管内皮细胞（LEC），需要多种表面标志物。通常，可通过显微镜观察 prospero 相关同源框 1（Prox-1）、淋巴管内皮透明质酸受体 1（LYVE1）或血管内皮生长因子受体 3（VEGFR3）的表达来识别 LEC。然而，在肝脏中，这些标志物的表达并不局限于 LEC。Prox-1 在肝发育、再生和损伤过程中被肝细胞广泛表达¹⁹，而 LYVE1 和 VEGFR3 则由肝窦内皮细胞表达¹⁸。在淋巴结中，LEC 可通过流式细胞术鉴定为分化簇（CD）CD45-、CD31+ 和 podoplanin+（PDPN）的细胞群¹⁶。然而，该方法在肝脏中用于分离 LEC 时过于简单，因为 CD45- CD31+ 细胞群会包含内皮细胞，而肝脏中占主导地位的血管内皮细胞为肝窦内皮细胞（LSEC）。因此，需要其他标志物来区分稀有的 LEC 群体与丰富的 LSEC 群体。CD16/32（由成熟 LSEC 表达¹⁸）和 CD146（一种常见的血管内皮细胞标志物，在肝脏中主要由肝窦内皮细胞在肝窦内表达²⁰，而淋巴管内皮细胞几乎不表达或完全不表达²¹）均为候选标志物。

因此，我们优化了一种利用上述标记物CD45、CD31、CD146、CD16/32和PDPN通过流式细胞术分离和可视化肝脏淋巴管内皮细胞（LECs）的方法。我们描述了使用胶原酶IV、DNase 1及机械分离法将肝组织消化为单细胞悬液的操作步骤。我们还介绍了采用碘克沙醇密度梯度法分离非实质细胞（NPC）并去除细胞碎片的方法。最后，通过多种标记物的联合使用，我们确定了以PDPN为主要标志物，从肝脏中鉴定LECs的最优流式细胞术设门策略。

方案

本文所述所有方法均已获得科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 材料的准备

1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制浓度为 5 mg/mL 的 DNase I 溶液。
2. 将 5,000 U/mL 的胶原酶 IV 加入 Click’s EHAA 培养基中，制备消化液。
3. 使用前将消化液在 37 °C 下预热 30 分钟。
4. 在 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）中加入 4.8% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），制备分离缓冲液。
5. 在蒸馏水（H₂O）中加入 100 mM 氯化铵、10 mM KHCO₃ 和 0.1 mM EDTA，制备红细胞裂解缓冲液。

2. 小鼠肝脏单细胞悬液的制备

1. 使用 CO₂ 和颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。
2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠体表，使毛发湿润。将小鼠四肢用大头针固定于解剖板上。
3. 使用解剖剪在肛门上方约 1 cm 处剪开皮肤，注意仅切穿皮肤层（约 1 mm 深度）。用有齿镊将皮肤从体壁拉开，将剪刀插入皮肤与腹膜之间，撑开剪刀以分离皮肤与腹膜，然后从切口处向颈部方向剪开皮肤。
4. 在每侧腋下及每条腿上方用大头针将皮肤固定于解剖板上。提起腹膜囊并向颈部方向剪开。抓住肝脏叶，于胸骨稍下方剪开。
   注意：若肝脏组织将用于免疫组织化学（IHC），操作时应格外小心。
5. 围绕肝脏剪开并将其从小鼠体内取出，放入 4 mL Click’s EHAA 培养基中。
6. 使用手术刀将肝脏切成直径约 1 mm 的小块。
7. 向肝脏组织中加入 500 µL 消化液混合物和 500 µL DNase I（2 mg/mL）。
8. 将肝脏在 37 °C 下孵育 30 分钟。孵育 15 分钟后，用 5 mL 移液器混匀液体。
9. 孵育 30 分钟后，将消化后的样品通过 100 µm 细胞筛过滤至 50 mL 锥形管中。
10. 用 1 mL 注射器的推杆轻轻将残留组织块推过滤膜。
11. 用 5 mL 分离缓冲液冲洗滤膜，并用 1 mL 注射器推杆背面轻轻将组织推过细胞筛。重复此步骤，直至滤膜用 25 mL 分离缓冲液冲洗完毕。
12. 以 400 x g 离心 5 分钟，小心吸弃上清液。
13. 用 4 mL 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，室温孵育 5 分钟。
14. 用 10 mL 分离缓冲液洗涤细胞，并以 400 x g 离心 5 分钟。
15. 用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定全肝细胞总数。
16. 将细胞重悬于 5 mL 20% 碘克沙醇溶液中，并在其上方轻柔铺加 1 mL PBS。
17. 以 300 x g 离心 15 分钟，不启用刹车。
18. 收集 PBS 与碘克沙醇之间的界面层，通过 100 µm 细胞筛转移至新的 50 mL 锥形管中。
19. 用 10 mL 分离缓冲液洗涤细胞，并以 400 x g 离心 5 分钟。
20. 弃去上清液，将细胞重悬于含 2% 胎牛血清（FBS）的 500 µL PBS 中。

3. 肝脏单细胞的流式细胞术分析

1. 使用血细胞计数板和显微镜对细胞进行计数，采用台盼蓝排斥法检测活细胞。取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，立即加入血细胞计数板，在显微镜下计数未染色（非蓝色）的活细胞。随后计算每微升中的细胞数量。
2. 将约500万个剩余的非实质细胞分装至96孔板的一个孔中。
3. 以 400 x g 离心细胞 g 5 分钟。
4. 弃去上清液，将细胞重悬于90 µL含2% FBS的PBS中。
5. 加入用10 µL 10x 2.4G2或抗-CD16/32（1:200）稀释的抗-CD45（1:200）、抗-CD146（1:200）、抗-CD31（1:200）和PDPN（1:200）。
   注意： 使用抗CD16/32标记抗体时未使用Fc阻断剂（2.4G2）。
6. 为确定阳性与阴性门控的设置位置，应针对每种荧光染料设置荧光减一（FMO）对照，并使用同型对照抗体。
7. 确定活细胞 与 死细胞，使用活力标记物（如 Ghost Red 780）染色。4 °C 下孵育细胞 30 分钟。
8. 用含 2% FBS 的 PBS 100 µL 洗涤细胞。
9. 使用少量细胞调整流式细胞仪的激光和补偿设置。用针对每种单独荧光染料的抗体以及不加任何抗体的对照对细胞进行染色。
   注意： 根据所使用的流式细胞仪，应建立补偿矩阵以消除光谱重叠。
10. 将样本管置于细胞仪探针上，收集并记录所有事件。

4. 数据分析

1. 观察侧向散射面积 与 前向散射面积，根据细胞大小、颗粒度及活细胞标记染料对“活细胞”设门。
2. 接下来，使用CD45 Brilliant Violet 510和CD31 PerCp Cy5.5，结合同型对照和荧光减一对照（FMO）设门，圈定CD45- CD31+细胞群，以确定阳性与阴性细胞群体。
3. 最后，使用 CD146 v450 或 CD16/32 FITC 与 PDPN APC，结合同型对照和荧光减一对照（FMO）设门，分选 CD146- PDPN+ 或 CD16/32- PDPN+ 细胞，以确定阳性与阴性细胞群。这些细胞即为淋巴管内皮细胞（LECs）。

结果

以往对肝脏淋巴管的研究主要采用免疫组织化学方法来定量分析肝脏中淋巴管的数量和直径。然而，该方法无法在单细胞水平上评估淋巴管内皮细胞（LEC），也无法检测多种标志物、细胞因子、趋化因子或转录因子的表达。因此，我们探讨了是否可以从肝脏中分离出LEC，并通过流式细胞术进行分析。既往分离淋巴结LEC的研究采用Liberase DL（胶原酶I-II-分散酶）联合DNase 1，并结合针头机械分离淋巴结组织的方法^14,16。因此，本研究尝试在肝脏组织上使用相同的消化方案，或采用之前用于从肝脏中分离免疫细胞的胶原酶IV和DNase 1方案²²，并在消化后加入密度梯度离心（碘克沙醇）步骤，以去除肝细胞并提高肝脏中其他细胞类型的相对丰度（图1A）。肝脏组织经消化并使用密度梯度离心后，细胞被标记CD45、CD31、PDPN和CD16/32。已有文献报道CD16/32在成...

讨论

近年来，淋巴管内皮细胞（LECs）在免疫稳态与免疫调节中的整体重要性逐渐被揭示²⁵。目前已发表的关于淋巴系统的文献大多集中于皮肤和淋巴结；然而，淋巴系统遍布全身²⁶，因此我们有必要深入理解其在不同器官中的作用。本文介绍了一种可在单细胞水平上研究肝脏中淋巴管内皮细胞的方法，以更深入地了解这些细胞同时表达的不同表面标志物、细胞因子、趋化因子以及转录因子等细胞内蛋白的情况。该方法将有助于未来研究在健康与疾病状态下肝脏中淋巴管内皮细胞的表型与功能。

在肝脏中鉴定肝内淋巴管内皮细胞（LECs）的一个难点在于，与其他细胞类型相比，其频率相对较低。肝细胞约占肝脏细胞总数的80%，因此在对肝脏样本进行流式细胞术分析前，使用密度梯度（碘克沙醇）去除肝细胞可节省时间，从而获得更好的细胞活性。为了将肝脏中表达LYVE1的LECs与表达LYVE1的肝窦内皮细胞（LSECs）区分开来，我们利用了LSECs表达而LECs表达水平很低或不表达的标记物CD16/32和CD146。结合肝脏中其他内皮细胞几乎不表达或低表达...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Clicks/EHAA 培养基	Irvine Scientific	9195
胶原酶 IV	Worthington Biochemical corporation	LS004188
DNase I	Worthington Biochemical corporation	LS002145	脱氧核糖核酸酶 1
OptiPrep	Sigma Aldrich	D1556	密度梯度介质
V450 抗小鼠 CD146（克隆 ME-9F1）	BD biosciences	562232
FITC 抗小鼠 CD146（克隆 ME-9F1）	Biolegend	134706	异硫氰酸荧光素（FITC）
Pacific Blue 抗小鼠 CD31（克隆 390）	Biolegend	102422
PerCp/Cy5.5 抗小鼠 CD31（克隆 390）	Biolegend	102420	多甲藻叶绿素蛋白-花青素 5.5（PerCP-Cy5.5）
APC 抗小鼠 PDPN（克隆 8.1.1）	Biolegend	127410	别藻蓝蛋白（APC），podoplanin（PDPN）
APC/Cy7 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）	Biolegend	103116
Brilliant Violet 510 抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）	Biolegend	103138
FITC 抗小鼠 CD16/32（克隆 93）	Biolegend	101306	异硫氰酸荧光素（FITC）
PerCp/Cy5.5 抗小鼠 CD16/32（克隆 93）	Biolegend	101324	多甲藻叶绿素蛋白-花青素 5.5（PerCP-Cy5.5）
ghost red 780 活性染料	TONBO biosciences	3-0865-T100
APC 仓鼠 IgG（克隆 SHG-1）	Biolegend	402102
PerCp/Cy5.5 大鼠 IgG2a（克隆 RTK2758）	Biolegend	400531
FITC 大鼠 IgG2（克隆 eBR2a）	ebioscience	1-4321-80
抗小鼠 LYVE1（克隆 223322）	R&D systems	FAB2125A
抗小鼠细胞角蛋白（克隆 EPR17078）	abcam	ab181598
抗小鼠 F4/80（克隆 Cl:A3-1）	Bio-rad	MCA497
BSA（V 组分）	Fischer	BP1600-100	牛血清白蛋白（BSA）
山羊血清	Jackson Immunoresearch	017-000-121
驴血清	Jackson Immunoresearch	017-000-121
EDTA	VWR	E177	乙二胺四乙酸（EDTA）—用于红细胞裂解缓冲液
氯化铵	Fischer	A687-500	用于红细胞裂解缓冲液
碳酸氢钾	Fischer	P184-500	用于红细胞裂解缓冲液
手术刀	Feather	2975#21
100 μm 细胞筛	Fischer	22363549
2.4G2	本实验室/ATCC	ATCC HB-197	FC 阻断剂，用于抑制非特异性结合至 Fc gamma 受体阳性细胞——由杂交瘤制备
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning	21-040-CV
Hanks 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14185-052
胎牛血清（FBS）	Atlanta biologicals	S11550
96 孔板	Corning	3788
6 孔板	Corning	3506
50 mL 锥形离心管	Truline	TR2004
15 mL 锥形离心管	Falcon	352196
1 mL 移液枪头	USA scientific	1111-2721
200 µL 移液枪头	USA scientific	1110-1700
10 µL 移液枪头	USA scientific	1111-3700
血清学 10 mL 移液管	greiner bio-one	607107
血清学 5 mL 移液管	greiner bio-one	606107
细胞培养箱	Fischer		Heracell 160i
BD FacsCanto II 流式细胞仪	BD biosciences
临床离心机	Beckman coulter		型号 X-14R