本文介绍了评估精子细胞膜完整性的方法，该细胞特征与精子的受精能力密切相关。我们描述了三种用于荧光检测精子膜的技术：特异性荧光探针的同步染色、荧光显微镜检查，以及专用于精子的流式细胞术。此外，还展示了这些方法联合应用的实例。
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本文内容
摘要
摘要
描述精子质量的标准精液分析主要基于生理和视觉参数，例如精液体积和浓度、活力与前向运动能力，以及精子形态和存活率。然而，这些评估方法均不足以准确预测精液质量。鉴于精子存活率和受精潜能依赖于细胞膜完整性和细胞内功能，对这些参数的评估可能更有效地预测精子的受精能力。本文介绍了三种可行的方法，利用特异性荧光探针结合荧光显微镜或流式细胞术分析来评估精子质量。这些方法分别通过4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和碘化丙啶（PI）评估质膜完整性，通过异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素（Pisum sativum agglutinin, FITC-PSA）评估顶体膜完整性，以及通过5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）评估线粒体膜完整性。本文还展示了这些方法的联合应用。例如，联合使用annexin V与PI荧光染料可评估精子凋亡情况，并计算凋亡精子的比例（凋亡指数）。我们认为，这些基于精子细胞膜检测的方法在评估精子质量方面具有重要应用价值。
引言
精子膜的完整性和功能是反映精子活力和受精潜能的因素之一。质膜作为细胞内和细胞外环境之间的屏障，维持着细胞的渗透平衡1。任何导致质膜完整性受损的应激都可能破坏稳态，降低精子活力和受精能力，并增加细胞死亡。例如，冷冻保存过程中的温度变化和渗透压应激会损伤精子质膜，从而降低精子活力2。我们先前报道过，将公牛精子暴露于低浓度的食源性污染物，如农药阿特拉津、其主要代谢产物二氨基氯三嗪或真菌毒素黄曲霉毒素B1，会降低精子活力1,3。该结论是通过使用DAPI标记双链DNA，并结合PI染色实现的，PI可结合质膜受损细胞的DNA。
顶体反应（AR）涉及顶体外膜与覆盖其上的质膜发生融合 ，导致顶体酶释放4,5。这些事件对于精子穿透透明带以及与卵母细胞进一步融合至关重要6。因此，评估顶体膜完整性是评价精液质量和男性生育力的一个有效指标7,8,9。多种荧光技术可用于检测顶体完整性，例如FITC-PNA或FITC-PSA8,10。在我们之前的研究中，通过分析FITC-PSA染色模式1,3，我们对以下三种状态给出了准确定义：（i）完整顶体，（ii）破损的顶体膜，以及（iii）已发生反应的顶体。在本研究中，我们采用专用于精子的流式细胞术评估顶体状态，并将结果与荧光显微镜法进行比较。
线粒体是多功能细胞器，参与ATP合成、活性氧物种产生、钙信号传导以及细胞凋亡等多种生理过程。包括男性和女性不育在内的多种生理功能障碍均与线粒体功能异常相关11。精子中的线粒体排列于中段，在精子运动能力中发挥关键作用12。普遍认为，较高的线粒体膜电位（ΔΨm）与正常的运动能力及较高的受精能力相关13。相反，较低的ΔΨm 则与活性氧水平升高及受精率降低相关14。然而，多种环境化合物（例如内分泌干扰物）可诱导细胞应激，导致ΔΨm短暂升高、超极化1,3、自由基生成增加，并最终引发细胞凋亡15。荧光探针5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）可用于检测食物源性毒素等物质对精子ΔΨm的影响1,3。
基于生理和形态学参数的标准精液分析无法充分预测精液质量，因此需要更精确的方法来评估精子质量。本文提供了两种基于精子膜评价的可行方法：特异性荧光探针四重同步染色结合荧光显微镜检测，该方法已在我们的研究中描述1,3；以及先进的专用精子流式细胞术，该技术近期已在我们的实验室应用，并被其他研究者采用16,17,18。
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方案
所有实验均按照1994年以色列动物福利指南进行。牛精子由以色列一家商业化公司提供，用于人工授精和育种。本研究共评估了11头公牛的精液样本。
1. 精子样品制备
注意：该实验步骤基于 Roth 实验室的方案1,3。
- 在室温下，用15 mL离心管收集约1–6 mL牛精液。
- 每1 mL精液中加入6 mL预热（37 °C）的NKM缓冲液（110 mM NaCl，5 mM KCl，20 mM MOPS [3-N-吗啉代丙磺酸；pH 7.4]），在600 x g条件下离心8分钟，重复1–2次，直至上清液澄清。
注意：若精子浓度过高或初始体积较大，首次洗涤时可分至两个离心管中进行。 - 立即移除并弃去澄清的上清液，仅保留约1 cm高的上清液在沉淀上方。
- 将离心管小心倾斜至30°角，以增加精子上浮的表面积，并在37 °C下静置20–30分钟，使精子上浮。
注意：可观察到轻微浑浊。 - 使用微量移液器小心吸取上层1 mL含活动精子的上清液，转移至新的1.5 mL离心管中。
- 将精子在37 °C下保存，待用。
- 使用Neubauer血细胞计数板估算精子数量。
注意：可使用其他类型的计数室，但计数方法有所不同。- 为防止精子运动，将100 µL活动精子与10 mL双蒸水（DDW）混合（1:100稀释），置于15 mL离心管中，轻轻混匀。
- 取10 µL样品加入血细胞计数板两侧计数室，并盖上盖玻片。注意避免计数室内产生气泡，以免影响精子计数的准确性。
- 在光学显微镜下使用20X物镜进行观察。
注意：血细胞计数板的完整网格包含9个大方格，每个面积为1 mm2，盖玻片距计数室底部0.1 mm。因此，中央计数区域的总体积为0.1 mm3或0.1 µL。中央区域包含25个中格，每个中格又分为16个带单线的小方格。 - 计数4个角部中格及中央中格内的总细胞数。为提高精确度，应计数两个计数室（Neubauer血细胞计数板的两侧），并取平均值计算细胞浓度。
- 将所计得的平均细胞数乘以5（得到每个计数区域的细胞数），再乘以10,000（得到每1 mL稀释样品中的细胞数），最后乘以稀释倍数（1:100），计算出原始精液样品中的精子总数。
注意：例如，在两个计数室的中央计数区域中，25个中格内共计数5个中格的精子平均数为150（[152+148]/2）。因此，每个计数室（即每0.1 µL）的平均精子数为150 × 5 = 750。将750乘以10,000，得到每1 mL稀释样品中的细胞数（7,500,000），再乘以100（稀释倍数），最终得出原始精液样品中每毫升含75 × 107个细胞。
2. 技术一：使用多种荧光探针同时评估精子膜
注意：精子膜（质膜、顶体膜和线粒体膜）的评估参照 Celeghini 等人10先前描述的方法，并略作修改。采用落射荧光显微镜结合数码相机进行观察，激发光波长为 450-490 nm，发射光波长为 515-565 nm，使用三色滤光片。
- 配制储备液。
- 将 5 mg DAPI 溶解于 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制 0.1 mg/mL 的 DAPI 储备液。分装为 50 µL 每份，于 -20 °C 保存。使用前用 PBS 按 1:10 稀释（工作液；10 µg/mL）。
- 将 1 mg FITC–PSA 溶解于 1 mL PBS 中，配制 1 mg/mL 的 FITC–PSA 储备液。分装为 50 µL 每份，于 -20 °C 保存。使用前用 PBS 按 1:10 稀释（工作液；100 µg/mL）。
- 将 1 mg JC-1 溶解于 1 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，配制 1 mg/mL 的 JC-1 储备液。分装为 10 µL 每份，于 -20 °C 保存。使用前用 DMSO 按 1:10 稀释（工作液；0.1 mg/mL）。
- 将 10 mg PI 溶解于 400 µL PBS 中，配制 PI 储备液（终浓度为 2.5 mg/mL）。于 +4 °C 保存。使用前用 PBS 按 1:20 稀释（工作液；0.125 mg/mL），并以 +4 °C 作为储备液保存。
注意：PI 具有潜在致突变性，操作时应谨慎。染料必须按照当地相关法规安全处置。
- 将 133 µL 活力精子（步骤 1.5）转移至新的 1.5 mL 离心管中（25 x 106 精子/mL）。
注意：若样品浓度过高，用 NKM 缓冲液稀释至所需浓度；若上泳样品浓度偏低，则将上泳后获得的上清液于 1,000 x g 离心 5 分钟，弃去 0.5 mL 上清液后重新计数精子。 - 加入 17 µL DAPI（工作液），于 37 °C 孵育 10 分钟。
- 于 1,000 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 向沉淀中加入 100 µL NKM 缓冲液。
- 加入 50 µL FITC–PSA、2 µL JC-1 和 3 µL PI（均为工作液），于 37 °C 孵育 10 分钟。
- 于 1,000 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 向沉淀中加入 40 µL NKM 缓冲液，用移液器吹打重悬。
- 取 10 µL 样品滴加至载玻片，涂片并加盖盖玻片。
- 立即使用配备数码相机的三色滤光片落射荧光显微镜（物镜 40x）观察，并分别对每种滤光片通道单独采集图像。
注意：观察滤光片的顺序无特定要求。- 在 DAPI 通道下观察，激发波长 358 nm，发射波长 461 nm。
- 在 FITC 通道下观察绿色单体，激发波长 450–490 nm，发射波长 515–565 nm。
- 在 PI 通道下观察红色聚集体，激发波长 488 nm，发射波长 590 nm。
- 在 JC-1 通道下观察红色聚集体，激发波长 559 nm，发射波长 574–627 nm；观察 JC-1 绿色单体，激发波长 488 nm，发射波长 500–535 nm。
- 使用相机软件的“合并”功能，将三种滤光片获得的 JPG/JPEG 格式图像进行合并。
- 使用“画图”工具打开合并后的图像，并使用画笔功能标记已计数的精子。
- 根据各探针发出的荧光对精子进行分类：
- 通常每张载玻片至少评估 200 个精子——所有细胞均呈蓝色（DAPI 染色）。
- 通过计数死亡细胞（呈紫色，PI [红色] + DAPI [蓝色]）评估精子活力，并计算死亡细胞百分比（死亡细胞数 / 总计数细胞数 × 100）。
- 根据荧光染色模式（FITC–PSA）评估顶体状态。计算不同染色模式的百分比（顶体完整、顶体损伤或顶体反应细胞数 / 总计数细胞数 × 100）。
注意：顶体膜受损表现为整个顶体帽呈均匀绿色荧光；顶体已发生反应者表现为赤道部或顶部残留绿色荧光；顶体完整的细胞在顶体区域无绿色荧光。 - 通过区分线粒体膜电位（ΔΨm）高低评估精子：ΔΨm 高的精子中段呈红色荧光，ΔΨm 低的精子中段呈绿色荧光。分别计数红色和绿色中段，并计算其比值（红色/绿色）。
3. 技术二：使用即用型试剂盒和流式细胞术评估精子膜
注意：质膜完整性、线粒体膜电位和顶体膜完整性的评估采用预先分装有冻干荧光染料的即用型流式细胞仪试剂盒进行。实验步骤根据制造商说明书进行，略有修改。
- 质膜完整性评估
- 从活力与浓度检测试剂盒（PI 和 SYbr14）的包装中取出所需数量的孔板，转移至工作底座，并用柔性盖板盖好（避光）。
- 加入 199 µ每孔加入 L 缓冲液用于流式细胞术分析。
- 加入1 µ均匀精液的 L 值为 57 × 106/mL（每孔 57,000 个细胞），并通过移液混匀。
- 用黑色盖子盖住培养板。
- 在 37 ℃ 下孵育 10 分钟 °避光保存。
- 使用“活力”设置，通过流式细胞仪运行样本。
- 线粒体膜电位
- 从线粒体活性检测试剂盒（JC-1）的包装中取出所需数量的孔板，转移至工作底座上，并用柔性盖板盖好（避光）。
- 加入10 µ每孔加入 L 的无水乙醇，用移液器吹打以重悬孔内的粉末。
- 加入190 µ每孔加入 L 的 PBS，用移液器吹打混匀。
- 加入 0.75 µ均匀精液的 L 值为 57 × 106/mL（每孔 50,000 个细胞），并通过移液混匀。
- 用黑色盖子盖住培养板。
- 37℃孵育30分钟 °C 避光保存。
- 将样品置于流式细胞仪中，按照设定参数运行 ʽ线粒体活性
- 顶体膜完整性
注意： FITC-PSA 染色（参见方法一）可用于评估 3 种顶体状态（完整顶体、反应性顶体和受损顶体）。结合流式细胞仪与活力检测 & 顶体完整性检测试剂盒（PI 和 FITC-PNA），将精子分为以下3类。- 从活力检测试剂盒中取出所需数量的孔板 & 顶体完整性检测试剂盒，转移至工作液中，并用柔性盖密封（避光）。
- 加入200 µ每孔加入 L 缓冲溶液用于流式细胞术。
- 加入 0.7 µ均匀精液的 L 值为 57 × 106/mL（每孔40,000个细胞），并通过移液混匀。
- 用黑色盖子盖住培养板。
- 在37℃下孵育45分钟 °避光保存。
- 将样品置于流式细胞仪中，按照设定条件进行检测 ʽInCyte’
- 根据荧光强度，通过设定三个标记区域来分析所得直方图：R1代表荧光信号可忽略、顶体完整且未染色的弱荧光细胞，R2代表具有残留染色顶体部分的弱荧光细胞，R3代表顶体破裂的强荧光细胞。
注意： 使用 "分析使用其他模块获取的文件" 参照仪器用户指南中的相关部分，以创建三个区域（R1、R2、R3）。
4. 技术三：利用荧光探针和流式细胞术评估精子膜
注意：联合使用annexin V与PI荧光染料可评估精子凋亡，并计算凋亡精子的比例（凋亡指数）。
- 从20倍浓缩的储存液中配制1倍浓度的annexin V结合缓冲液（将500 μL储存液用去离子水稀释至10 mL） µ将20倍浓缩的annexin V结合缓冲液1 L与9.5 mL无菌蒸馏水混合。
- 使用Neubauer血细胞计数板按照第1.7节所述方法估算精子数量。
- 洗涤 106 1 mL 1x annexin V 结合缓冲液中的精子，300 x g 离心 g 10 分钟
- 完全吸除上清液。
- 将沉淀重悬于100 µ1x annexin V 结合缓冲液的 L
- 加入10 µFITC 标记的 L 型膜联蛋白 V
- 充分混匀，室温避光孵育15分钟。
- 将1 mL 1×膜联蛋白V结合缓冲液加入每10⁶个精子中，洗涤精子6 细胞并在 300 x g 10 分钟
- 完全吸除上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 500 µ每 10 微升 1x annexin V 结合缓冲液6 总细胞数
- 加入1 µ在使用流式细胞仪分析前立即加入终浓度为 g/mL 的 PI。
- 将样品通过已设定好的流式细胞仪进行检测 ʽInCyte’
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结果
图1展示了使用PI、DAPI、FITC-PSA和JC-1对精子膜（质膜、顶体膜和线粒体膜）进行的同时荧光评估。通过四种荧光探针的同时染色对精子膜进行评估，可针对每一个精子细胞同时分析其所属类别中的比例——活 vs. 死；高 vs. 低线粒体膜电位（ΔΨm）；顶体完整 vs. 顶体损伤。
图2展示了使用荧光探针评估精子膜特性的结果。实验仅使用精子活力至少为80%的精液样本。每头公牛至少检测200个细胞。能够根据细胞膜完整性评估精子样本质量的差异。例如，与公牛1号相比，公牛7号的精液中死细胞比例相对较低，顶体假反应精子比例较低，且线粒体膜电位较高。
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讨论
精子的受精潜能取决于多个反映其质量的因素。高浓度的精子以及高比例的快速前向运动精子可被视为高质量精液。然而，此类评估并未考虑其他细胞和功能参数。使用“台式”微毛细管流式细胞仪可方便地结合荧光探针对多种精子结构进行评估，此前已有研究报道17 ，本文亦对此进行了展示（技术#3）。例如，精子顶体完整性对于成功实现自然受精至关重要，因此有必要精确评估顶体状态。此类评估可通过荧光染色模式对顶体状态进行分类来轻松完成（如前所述，使用FITC-PSA、FITC-PNA，即技术#1）1,3。 尤其重要的是确定顶体完整精子（即顶体未染色）相对于顶体受损精子的比例。对于后者，顶体受损的精子可能表现为：（i）顶体帽完全染色，表明细胞膜受损，使染料能够穿过膜进入顶体囊泡；（ii）已发生顶体反应的精子，仅残留少量顶体内容物，提示顶体反应（AR）已经发生（即假性AR）。应注意的是，此类评估也可使用专用流式细胞仪完成。
即用型活...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者谨此感谢以色列哈费茨-海姆的以色列人工授精与育种公司"SION"所提供的帮助与合作，以及法国莱格勒IMV Technologies公司的李娜女士在仪器安装与培训方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-吗啉代丙磺酸] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| 无水乙醇 | Sigma | 64-17-5 | |
| 血细胞计数板 | 德国纽鲍尔 | 血细胞计数板 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | Sigma | D9542 | 荧光探针 |
| PI（碘化丙啶） | Sigma | P4170 | 荧光探针 |
| FITC-PSA（异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素） | Sigma | L0770 | 荧光探针 |
| JC-1（5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物） | ENZOBiochem，美国纽约州纽约市 | ENZ52304 | 荧光探针 |
| FITC标记的Annexin V | MACS，美天旎生物技术 | 130-093-060 | 荧光探针 |
| Annexin V 结合缓冲液 20 倍储存液 | MACS，美天旎生物技术 | 130-092-820 | 缓冲液 |
| 尼康 Eclipse，TE-2000-u | 尼康，日本东京 | 倒置荧光显微镜 | |
| Nis Elements | 尼康，日本东京 | 软件 | |
| Nikon DXM1200F | 尼康，日本东京 | 数码相机 | |
| Guava EasyCyte Plus | 法国拉艾格，IMV Technologies | 微毛细管精子流式细胞仪 | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc.，美国加利福尼亚州海沃德；由 IMV Technologies 发行 | 软件 | |
| 用于细胞计数的缓冲溶液 | IMV Technologies，法国莱格勒 | 023862 | 缓冲液 |
| 活力与浓度检测试剂盒 | IMV Technologies，法国莱格勒 | 024708 | 用于活力评估的试剂盒 |
| 线粒体活性检测试剂盒 | IMV Technologies，法国莱格勒 | 024864 | 线粒体活性评估试剂盒 |
| 存活率 & 顶体完整性试剂盒 | IMV Technologies，法国莱格勒 | 025293 | 用于顶体完整性评估的试剂盒 |
| JMP-13 | SAS 研究所股份有限公司，2004，卡里，北卡罗来纳州，美国 | 软件 | |
| 牛精子 | "SION"，以色列人工授精与育种公司，Hafetz-Haim，以色列 |
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