本文提供了一种高效且可行的方法，用于构建具有优良干细胞特性的多层干细胞片。
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本文内容
摘要
摘要
干细胞治疗在修复受损器官和组织方面展现出广阔的应用前景，而细胞片技术的开发旨在改善细胞在靶向区域内存留率低和存活率差的问题。然而，在此过程中 体外 构建过程，迫切需要一种能够维持干细胞生物活性并增加细胞片中细胞数量的解决方案。本文所述方案提供了一种构建具有优良干细胞生物活性和最佳可操作性的多层细胞片的方法。脱细胞猪心包膜（DPP）通过磷脂酶A2 （PLA2) 脱细胞化方法制备的细胞片支架，并分离扩增大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为接种细胞。利用RAD16-I肽水凝胶构建临时的多层细胞片结构。最后，将细胞片置于动态灌注培养系统中培养以稳定其三维（3D）结构，经48小时培养后即可获得完整的细胞片 体外该方案提供了一种高效且可行的方法用于构建多层干细胞片，该细胞片未来有望开发成为一种理想的干细胞治疗产品。
引言
干细胞治疗已被报道为多种疾病的高效疗法；然而，传统干细胞注射后，细胞在靶区的滞留率低和存活率差仍是亟待解决的关键问题。为解决这一难题，组织工程科学家开发了细胞片技术。首先利用温度响应性培养皿制备出含有完整细胞外基质的单层细胞片1，后续研究报道了该技术可显著提高干细胞在梗死区域的滞留和存活率2,3。其中，构建多层细胞片的方法已被证实是提升细胞存活率及细胞片治疗效果的有效策略3,4。此后，科学家致力于开发多种细胞片构建方法，以提高细胞数量、干细胞特性以及细胞片的机械性能。迄今为止，已有多种类型的细胞片被成功构建，并应用于心肌梗死5、软骨损伤6和皮肤创面7的治疗研究中。
移植前干细胞的生物活性对损伤组织再生表现出日益显著的影响，而不同的细胞片构建策略对干细胞具有不同的作用。一方面，汇合的细胞片仅由高密度的干细胞组成，通过堆叠单层细胞片可获得天然的细胞外基质8 或通过使用磁性组织工程技术
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方案
所有干细胞和动物实验操作均遵循《实验室动物护理和使用国家指南》的伦理规范，并经中国广州暨南大学动物护理与使用委员会批准。
1. 采用PLA2脱细胞方法制备DPP支架14
注意：PLA2 去细胞化方法的示意图参见图1A。
- 配制 100 mL 浓度为 200 U/mL 的 PLA2 溶液。在 198 mL 碳酸盐缓冲液中加入 0.5 g 脱氧胆酸钠和 2 mL PLA2。该溶液应在配制后 24 小时内使用。
- 从屠宰场获取新鲜猪心包（FPP），并在 1 小时内送回实验室。
注意：运输过程中 FPP 应保存在 4 °C。步骤 1.2 至 1.10 应在恒温水浴中持续振荡条件下进行。 - 在 500 mL 烧杯中，用含有 1% 青霉素-链霉素的 200 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）在 10 °C 下彻底清洗 FPP 10 分钟。重复此步骤 2 次。
- 将 FPP 分为两层，并用镊子和剪刀去除脂肪组织。
注意：在去除脂肪组织过程中，每隔 20 分钟添加 50 mL PBS，以保持 FPP 湿润。 - 用剪刀将 FPP 剪....
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结果
多层干细胞片构建的示意图如图1所示。首先采用PLA2去细胞化方法制备细胞片支架。在此支架基础上，通过将干细胞与RAD16-1肽水凝胶混合，构建临时的三维细胞结构。为了获得具有良好干细胞生物活性和最佳机械强度的多层细胞片，需将细胞片置于动态灌注系统中进行培养。在动态营养供给条件下，干细胞可在多层细胞片内增殖并建立细胞间连接，经过约24至72小时的培养后，即可获得最终稳定的多层细胞片产品。
在此情况下，细胞膜片支架 DPP 由 PLA 制备2 脱细胞方法。干燥后DPP呈扁平、光滑且半透明状（图3A）。由于PLA具有特异的裂解作用2，可完全去除异质细胞，同时很好地保留DPP支架内天然胶原蛋白的超微结构（图3B），这对.......
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讨论
本方案报告了一种构建多层间充质干细胞片的高效方法。该细胞片具有理想的机械强度、高细胞接种密度以及良好的干细胞生物活性。以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为例，利用RAD16-I肽水凝胶快速构建三维细胞结构。在动态灌注系统中培养后，成功获得多层BMSC细胞片，且BMSCs保持干细胞标志物的高表达水平。
构建临时的多层细胞结构是本实验方案的关键步骤。RAD16-I 是一种商用的水凝胶肽，由1%的氨基酸和99%的水组成。已有多个研究报道，这种肽基水凝胶可模拟天然的细胞外基质（ECM）环境，有利于干细胞的增殖与存活15,16,17。在本方案中，将300万个间充质干细胞（MSC）悬浮于20 µL 10%蔗糖溶液中，与20 µL RAD16-I 肽基水凝胶混合。细胞悬液与肽基水凝胶的体积比为1:1。该肽基水凝胶对环境pH值敏感，当pH值从酸性变为中性时，肽分子会自动形成三维网络结构。由于细胞表面带有电荷，细胞混.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（资助号 31771064）；广东省科技计划项目（资助号 2013B010404030、2014A010105029 和 2016A020214012）；广州市科技计划项目（资助号 201607010063）；大学生创新创业训练计划项目（资助号 201610559028）；国家自然科学基金青年科学基金项目（资助号 31800819）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷脂酶 A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco BRL | 89033 | |
| 青霉素-链霉素/两性霉素B | Gibco BRL | 15640055 | |
| 碳酸氢盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| 台式浓缩仪 | 常州奥华仪器有限公司 | KT20183 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| 南美胎牛血清 | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-谷氨酰胺 | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| 生物安全柜 | Esco，新加坡 | AC2-2S1 | |
| 恒温培养箱 | Esco，新加坡 | CLS-170B-8 | |
| 离心管 | Corning | 430790 | |
| EP管 | Axygen | 31617934 | |
| 离心机 | TOMOS | 1-16R | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| 动态灌注培养系统 | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| 蠕动泵 | Ismatec | IPC N8 | |
| 泵用管路 | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | 组织载体组件 | |
| MINUSHEET | Regensburg | 动态灌注系统 | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | 气体交换设备 | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL 玻璃瓶 | |
| MINUSHEET 1301 | 灌注培养容器 |
参考文献
- Miyahara, Y., et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nature Medicine. 12 (4), 459-465 (2006).
- Narita, T., et al.
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