本文提供了一种高效且可行的方法，用于构建具有优良干细胞特性的多层干细胞片。
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摘要
摘要
干细胞治疗在修复受损器官和组织方面展现出广阔的应用前景，而细胞片技术的开发旨在改善细胞在靶向区域内存留率低和存活率差的问题。然而，在此过程中 体外 构建过程，迫切需要一种能够维持干细胞生物活性并增加细胞片中细胞数量的解决方案。本文所述方案提供了一种构建具有优良干细胞生物活性和最佳可操作性的多层细胞片的方法。脱细胞猪心包膜（DPP）通过磷脂酶A2 （PLA2) 脱细胞化方法制备的细胞片支架，并分离扩增大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为接种细胞。利用RAD16-I肽水凝胶构建临时的多层细胞片结构。最后，将细胞片置于动态灌注培养系统中培养以稳定其三维（3D）结构，经48小时培养后即可获得完整的细胞片 体外该方案提供了一种高效且可行的方法用于构建多层干细胞片，该细胞片未来有望开发成为一种理想的干细胞治疗产品。
引言
干细胞治疗已被报道为多种疾病的高效疗法；然而，传统干细胞注射后，细胞在靶区的滞留率低和存活率差仍是亟待解决的关键问题。为解决这一难题，组织工程科学家开发了细胞片技术。首先利用温度响应性培养皿制备出含有完整细胞外基质的单层细胞片1，后续研究报道了该技术可显著提高干细胞在梗死区域的滞留和存活率2,3。其中，构建多层细胞片的方法已被证实是提升细胞存活率及细胞片治疗效果的有效策略3,4。此后，科学家致力于开发多种细胞片构建方法，以提高细胞数量、干细胞特性以及细胞片的机械性能。迄今为止，已有多种类型的细胞片被成功构建，并应用于心肌梗死5、软骨损伤6和皮肤创面7的治疗研究中。
移植前干细胞的生物活性对损伤组织再生表现出日益显著的影响，而不同的细胞片构建策略对干细胞具有不同的作用。一方面，汇合的细胞片仅由高密度的干细胞组成，通过堆叠单层细胞片可获得天然的细胞外基质8 或通过使用磁性组织工程技术9另一方面，研究人员开发了不同的支架，以提供足够的机械强度并支持细胞生长10,11,12，从而允许较低的干细胞接种密度以确保营养供应。然而，尽管采用了这些方法，多层细胞片结构内部营养供应效率低下的问题在培养过程中仍然是一个主要关注点 体外 因此，迫切需要一种高效且可行的细胞片构建系统。
本方案描述了制备多层间充质干细胞（MSC）细胞片的步骤。在此构建系统中，细胞片的机械强度由DPP提供。基于该支架，可利用RAD16-I肽水凝胶快速构建三维细胞结构，并采用动态灌注系统培养多层细胞片，以稳定三维细胞片结构并为细胞提供充足的营养供应。利用该系统，成功制备了多层骨髓间充质干细胞（BMSC）片，并在大鼠心肌梗死模型中表现出理想的治疗效果13。
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方案
所有干细胞和动物实验操作均遵循《实验室动物护理和使用国家指南》的伦理规范，并经中国广州暨南大学动物护理与使用委员会批准。
1. 采用PLA2脱细胞方法制备DPP支架14
注意：PLA2 去细胞化方法的示意图参见图1A。
- 配制 100 mL 浓度为 200 U/mL 的 PLA2 溶液。在 198 mL 碳酸盐缓冲液中加入 0.5 g 脱氧胆酸钠和 2 mL PLA2。该溶液应在配制后 24 小时内使用。
- 从屠宰场获取新鲜猪心包（FPP），并在 1 小时内送回实验室。
注意：运输过程中 FPP 应保存在 4 °C。步骤 1.2 至 1.10 应在恒温水浴中持续振荡条件下进行。 - 在 500 mL 烧杯中，用含有 1% 青霉素-链霉素的 200 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）在 10 °C 下彻底清洗 FPP 10 分钟。重复此步骤 2 次。
- 将 FPP 分为两层，并用镊子和剪刀去除脂肪组织。
注意：在去除脂肪组织过程中，每隔 20 分钟添加 50 mL PBS，以保持 FPP 湿润。 - 用剪刀将 FPP 剪成 10 × 10 cm2 的片状。在 500 mL 烧杯中，用含有 1% 青霉素-链霉素的 200 mL 碳酸盐缓冲液（CBS）在 10 °C 下清洗 FPP 10 分钟。重复此步骤 2 次。
- 将 FPP 转移至纯水中，在 10 °C 下浸泡 12 小时。
- 将 10 × 10 cm2 的样品在含有 200 U/mL PLA2 和 0.5% (w/v) 脱氧胆酸钠的 50 mL CBS 中，于 37 °C 浸泡 6 小时。
- 用含有 1% 青霉素-链霉素的 CBS 在 10 °C 下清洗样品 10 分钟。重复此步骤 2 次。
- 将每份样品在含有 200 U/mL PLA2 和 0.5% (w/v) 脱氧胆酸钠的 50 mL CBS 中，于 37 °C 浸泡 2 小时。
- 用含有 1% 青霉素-链霉素的 CBS 在 10 °C 下清洗样品 2 小时。至少重复此步骤 10 次。将样品平铺于平板上，在 55 °C 恒温烘箱中干燥至恒重。
注意：样品必须完全干燥。每 10 分钟称量一次 DPP 样品，重复 3 次或直至重量不再变化。 - 使用角膜环钻将每份 DPP 样品裁剪成直径为 10.5 mm 的圆形。将每份 DPP 装入无菌密封袋中。
- 通过 γ 射线辐照（25 kGy）对 DPP 样品进行灭菌。使用前将 DPP 样品储存在 4 °C。
注意：所有样品可在 4 °C 下保存长达六个月。
2. 细胞膜片构建的准备工作
- 将所有器械和组织载体组件在121 °C下高压灭菌30分钟，包括1.5 mL离心管、镊子、有齿镊、剪刀、黑色底座（组织载体组件）和白色张力环（组织载体组件）。
- 制备20 mL无菌的10%蔗糖溶液。称取2 g蔗糖，溶于18 mL超纯水中。将10%蔗糖溶液在121 °C下高压灭菌30分钟，或使用0.22 µm滤器过滤除菌。
- 将动态灌注系统设备在121 °C下高压灭菌30分钟，包括气体交换装置、500 mL玻璃瓶、灌注培养容器以及连接管。
- 准备好已灭菌的器械和组织载体组件。将组织载体的黑色底座部分放入培养皿中。
- 取一片干燥的DPP支架，置于黑色底座中央。将白色张力环放置在DPP支架上，并将其固定在组织载体中。
注意：确保支架在组织载体中完全固定，黑色底座与白色张力环之间无任何缝隙。如有缝隙，应拆开组织载体并重新固定支架。 - 在DPP支架上加入100 µL培养基以进行再水化。
注意：若支架在组织载体中固定不牢，培养基会渗入培养皿中。 - 将支架放入37 °C培养箱中，浸泡15分钟。
3. 细胞片构建的细胞准备
注意：本实验方案适用于使用100 mm培养皿进行的细胞培养。多层细胞结构构建的示意图见图1B。
- 分离骨髓间充质干细胞13.
注意：本方法旨在构建多层间充质干细胞（MSC）细胞片。本方案中使用大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）。BMSCs 通过全骨髓贴壁法分离，并进行扩增 体外 以获得足够的细胞数量。- 在121 °C下对器械进行高压灭菌30分钟，包括镊子、有齿镊和剪刀。准备2 mL注射器及BMSC培养基（Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]、10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素）。
- 通过颈椎脱位法处死三周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。将动物置于烧杯中，用100 mL 75%酒精溶液浸泡5分钟。
- 将动物从烧杯中取出，俯卧置于手术台上。用剪刀和镊子切开动物背部皮肤，分离皮肤和肌肉组织，暴露股骨大腿部位。
- 分离股骨并将其放入含有30 mL PBS的50 mL离心管中。每管放入两根股骨。涡旋振荡离心管以充分清洗组织。重复此步骤2次。
- 用剪刀剪去股骨两端，暴露骨髓腔。
- 用注射器吸取2 mL BMSC培养基。将针头插入骨髓腔，用培养基冲洗骨髓。每两根股骨的骨髓冲洗至一个100 mm培养皿中。
- 每个100 mm培养皿中加入2 mL培养基，将培养皿放入37 °C培养箱中静置培养72 h。
- 从培养箱中取出培养皿，弃去上清液，加入6 mL新鲜培养基。
- 在显微镜下观察原代骨髓间充质干细胞（BMSCs），随后每5至7天传代一次BMSCs。
- 从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察细胞状态，选择适合的细胞用于细胞片层构建。当骨髓间充质干细胞（BMSCs）融合度达到80%–90%时，可选作接种细胞。
- 从培养皿中移除培养基。用 2 mL 温热的 PBS 轻柔洗涤细胞。移除培养皿中的所有 PBS，确保无液体残留。向培养皿中加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶（或其他解离溶液），于 37 °C 孵育 3 分钟。
- 通过加入 2 mL 培养基终止胰蛋白酶作用，并轻轻冲洗细胞脱离培养皿。将细胞悬液转移至新的 15 mL 离心管中。在 225 x g 5 分钟。
- 移去上清液。用3 mL 10% (w/v) 蔗糖溶液重悬细胞。
注意：使用10% (w/v)蔗糖溶液洗涤细胞，以获得均匀的细胞-水凝胶混合物，用于后续步骤。 - 吸取10 µL细胞悬液，用血细胞计数板计数细胞数量。根据结果计算下一步所需的细胞悬液体积。每张细胞片使用三百万个BMSCs。
- 提取三百万个细胞，转移至新的15 mL离心管中。在225 x g 5 分钟。
- 移去上清液。用1 mL 10% (w/v) 蔗糖溶液重悬细胞。将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。
注意：使用 1.5 mL 离心管有助于制备细胞-水凝胶混合物。 - 以 260 x g 离心细胞g 5 分钟后，彻底去除上清液，收集细胞沉淀。
4. BMSCs 与 RAD16-I 肽水凝胶混合物的制备
注意：多层细胞结构构建的示意图参见图1B。
- 向1.5 mL离心管中加入20 µL 10% (w/v)蔗糖溶液。轻轻重悬骨髓间充质干细胞（BMSCs），获得均匀的细胞悬液。
注意：重悬过程中避免产生气泡。 - 在细胞悬液上层加入20 µL RAD16-I肽水凝胶。用移液枪头轻轻搅拌RAD16-I肽与细胞悬液。当细胞悬液与水凝胶混合后，再轻轻吹打混合液数次。
- 从组织载体中取出DPP支架，用移液枪头轻轻吸除培养基。
注意：在加入细胞-水凝胶混合物前，确保DPP支架已充分再水化。 - 吸取消化混合液，均匀地滴加到DPP支架上。
注意：混合液总体积约为40–50 µL。建议从支架中心向外周，每次加入10 µL，分次添加。 - 向组织载体底部加入1 mL培养基。将细胞片放入37 °C培养箱中孵育5分钟。
- 从培养箱中取出细胞片。在培养皿中轻轻加入4 mL培养基，完全浸没细胞片。将细胞片放入37 °C培养箱中进行2小时的静态培养。
5. 体外 使用动态培养系统培养三维多层细胞片
注意：3D 动态系统的示意图参见图 1C。
- 准备动态灌注系统，包括蠕动泵、气体交换装置、500 mL 玻璃瓶、灌注培养容器及连接管路。按照 图2 所示组装动态灌注系统。
- 向无菌玻璃瓶中加入 200 mL 培养基。将细胞膜片插入培养容器的腔室内。
注意：注意细胞膜片上表面的方向。 - 在组织容器中加入 3 mL 培养基并关闭容器。将动态灌注系统放入培养箱，启动泵，设置蠕动泵流速为 8 mL/min。在动态灌注系统中培养细胞膜片 48 小时。
6. 获取多层间充质干细胞片
- 将器械和组织载体组件（包括1.5 mL离心管、镊子和有齿镊）在121 °C下高压灭菌30分钟。
- 从玻璃瓶中拔出进液管，停止向容器供应培养基。
注意：当培养容器排空时，应停止蠕动泵。 - 从培养容器中取出细胞片层，并将其放入培养皿中。
- 用一把镊子固定组织载体，再用另一把有齿镊将白色张力环与黑色底座分离。最终获得多层BMSCs细胞片层。
- 短期保存时，可用镊子将每张细胞片层转移至1.5 mL离心管中。DPP支架应贴附于离心管内壁，细胞片层应尽可能在离心管内展开。
- 在离心管中轻轻加入1 mL培养基，浸没细胞片层。盖紧离心管盖子后，将细胞片层置于4 °C保存。
注意：细胞片层应尽快用于移植或分析，建议在4小时内使用。
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结果
多层干细胞片构建的示意图如图1所示。首先采用PLA2去细胞化方法制备细胞片支架。在此支架基础上，通过将干细胞与RAD16-1肽水凝胶混合，构建临时的三维细胞结构。为了获得具有良好干细胞生物活性和最佳机械强度的多层细胞片，需将细胞片置于动态灌注系统中进行培养。在动态营养供给条件下，干细胞可在多层细胞片内增殖并建立细胞间连接，经过约24至72小时的培养后，即可获得最终稳定的多层细胞片产品。
在此情况下，细胞膜片支架 DPP 由 PLA 制备2 脱细胞方法。干燥后DPP呈扁平、光滑且半透明状（图3A）。由于PLA具有特异的裂解作用2，可完全去除异质细胞，同时很好地保留DPP支架内天然胶原蛋白的超微结构（图3B），这对...
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讨论
本方案报告了一种构建多层间充质干细胞片的高效方法。该细胞片具有理想的机械强度、高细胞接种密度以及良好的干细胞生物活性。以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为例，利用RAD16-I肽水凝胶快速构建三维细胞结构。在动态灌注系统中培养后，成功获得多层BMSC细胞片，且BMSCs保持干细胞标志物的高表达水平。
构建临时的多层细胞结构是本实验方案的关键步骤。RAD16-I 是一种商用的水凝胶肽，由1%的氨基酸和99%的水组成。已有多个研究报道，这种肽基水凝胶可模拟天然的细胞外基质（ECM）环境，有利于干细胞的增殖与存活15,16,17。在本方案中，将300万个间充质干细胞（MSC）悬浮于20 µL 10%蔗糖溶液中，与20 µL RAD16-I 肽基水凝胶混合。细胞悬液与肽基水凝胶的体积比为1:1。该肽基水凝胶对环境pH值敏感，当pH值从酸性变为中性时，肽分子会自动形成三维网络结构。由于细胞表面带有电荷，细胞混...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（资助号 31771064）；广东省科技计划项目（资助号 2013B010404030、2014A010105029 和 2016A020214012）；广州市科技计划项目（资助号 201607010063）；大学生创新创业训练计划项目（资助号 201610559028）；国家自然科学基金青年科学基金项目（资助号 31800819）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷脂酶 A2 | Sigma-Aldrich | P6534 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco BRL | 89033 | |
| 青霉素-链霉素/两性霉素B | Gibco BRL | 15640055 | |
| 碳酸氢盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | C3041 | |
| 台式浓缩仪 | 常州奥华仪器有限公司 | KT20183 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Corning Cellgro | 10-014-CVR | |
| 南美胎牛血清 | Gibco BRL | 10270-106/P30-3302 | |
| L-谷氨酰胺 | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| 生物安全柜 | Esco，新加坡 | AC2-2S1 | |
| 恒温培养箱 | Esco，新加坡 | CLS-170B-8 | |
| 离心管 | Corning | 430790 | |
| EP管 | Axygen | 31617934 | |
| 离心机 | TOMOS | 1-16R | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S9378-500G | |
| Pura Matrix | BD | 354250 | |
| 动态灌注培养系统 | Minucells and Minutissue | D-93077 | |
| 蠕动泵 | Ismatec | IPC N8 | |
| 泵用管路 | Ismatec | Nr.1306 | |
| MINUSHEET 1300 | Regensburg | 组织载体组件 | |
| MINUSHEET | Regensburg | 动态灌注系统 | |
| MINUSHEET 0006 | Regensburg | 气体交换设备 | |
| MINUSHEET 0002 | Regensburg | 500 mL 玻璃瓶 | |
| MINUSHEET 1301 | 灌注培养容器 |
参考文献
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