利用细胞外通量分析法测量离体视网膜组织中的能量代谢

摘要

本技术描述了利用细胞外通量分析仪对小鼠离体视网膜组织的耗氧量和细胞外酸化速率进行实时记录的方法。

摘要

高敏锐度视觉是一个高度耗能的过程，视网膜已进化出多种独特适应机制，以精确满足这一需求，同时保持视觉轴的透明性。这种精细平衡的破坏会导致致盲性疾病，例如糖尿病视网膜病变。因此，理解视网膜在疾病过程中能量代谢的变化，对于开发针对多种视力丧失原因的合理疗法至关重要。近年来，商用的细胞外通量分析仪的出现使视网膜能量代谢的研究变得更加便捷。本实验方案描述了如何利用此类分析仪，通过定量氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）作为这两条通路的替代指标，来评估视网膜能量供应的两个主要途径——氧化磷酸化和糖酵解——各自的贡献。该技术可直接应用于离体视网膜组织，便于在单次实验中评估多种药理学试剂的作用。本方法用于比较缺乏视杆光感受器信号传导的动物视网膜与野生型对照组的代谢特征。该技术的一个主要局限性在于无法区分明适应与暗适应状态下的能量利用情况，而这是视网膜组织中一个重要的生理学考量。

引言

视网膜是中枢神经系统中能量需求最高的组织之一¹与大多数组织一样，它能生成三磷酸腺苷（ATP） 通过 细胞质中的糖酵解或 通过 线粒体中的氧化磷酸化。通过氧化磷酸化与糖酵解产生ATP的能量效率差异显而易见：每分子葡萄糖经氧化磷酸化可生成36分子ATP 与 后者产生2分子ATP。因此，视网膜神经元主要依赖线粒体呼吸作用提供能量，这在其高密度的线粒体中得到体现²然而，即使在氧气充足的情况下，视网膜也高度依赖糖酵解机制。这种有氧糖酵解过程最初由奥托·瓦尔堡（Otto Warburg）在癌细胞中描述。³曾指出，视网膜是唯一能够进行这种代谢形式的终末分化组织⁴自最初观察以来，许多终末分化组织被发现除了通过氧化磷酸化外，还以不同程度进行糖酵解来满足其ATP需求。

光转导、视觉色素循环、感光细胞外节的生物合成以及突触活动均为感光细胞中高度耗能的过程，而感光细胞是视网膜中主要的神经元亚类。然而，神经元中最消耗能量的过程是主动将离子逆其电势梯度和浓度梯度进行转运的需求。¹. 光感受器是一种特殊的神经元，其特点是在无刺激状态下处于去极化状态（即， 在黑暗中），而光刺激会引发通道关闭及随后的超极化。因此，在黑暗中，视网膜消耗大量ATP以维持其去极化状态 "暗电流" 正如其通常所称，从适应性角度来看，提供如此大量ATP的主要挑战在于生物体需要通过光学轴保持视觉清晰。现代生物中所见的视网膜倒置结构是占主导地位的解决方案，因为它将为感光细胞供能的密集毛细血管网络远离光线路径。但这一自然生物工程的奇迹也使视网膜在代谢储备方面处于临界状态。即使对视网膜造成轻微损伤，也可能破坏能量供需之间微妙的平衡，进而迅速导致视觉功能障碍甚至完全失明。

鉴于神经视网膜具有独特的能量需求，同时其血管供应受到严格限制，准确测量视网膜中的ATP消耗及其在疾病过程中的变化，可能对理解与治疗致盲性疾病（如视网膜色素变性及糖尿病视网膜病变）产生深远影响。传统上，此类测量需要昂贵且定制设计的设备，大多数相关研究仅由少数专门致力于代谢活性测量的实验室开展^2,5,6,7,8。相关技术包括针对特定代谢物的单独检测、使用放射性标记前体的示踪研究、利用克拉克电极记录耗氧量，以及代谢组学分析⁹。

随着高通量技术的进步以及商用设备的日益普及，记录视网膜代谢的技术正变得越来越易于获取且成本低廉。本文所述方法利用离体组织和一种市售的细胞外通量分析仪，同时测量视网膜的氧化磷酸化和糖酵解过程^9,10,11,12。该分析仪可分别记录耗氧速率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR），二者分别作为氧化磷酸化和糖酵解的间接指标¹³。这些测量通过浸没在覆盖于目标组织上方所形成的微室中的探针完成。本方法在先前已发表技术的基础上进行了改进，采用原本为胰岛（Langerhans岛）设计的捕获板，用于记录小块圆形小鼠视网膜组织的代谢活性。由于系统为每个样品孔配备了4个注射口，因此可在单次记录过程中向组织施加多种药物干预。结合分别优化用于ECAR和OCR检测的实验方案，可将野生型视网膜的反应与缺乏transducin（Gnat1^-/-）的视网膜进行比较，后者是人类先天性静止性夜盲症的致病原因¹⁴。

方案

实验方案遵循视力与眼科学研究协会关于动物使用的规定，并经华盛顿大学批准。

1. 动物准备

1. 将动物饲养在标准环境中，保持12小时黑暗与12小时光照的循环。实验应在固定时间开始，以避免昼夜节律的影响，通常在清晨开灯后不久进行。

2. 溶液配制

1. 通过将 8.4 mg 粉末培养基溶解于双蒸 H₂O (ddH₂O)₂O)，并用 HCl 或 NaOH 调节 pH 至 7.4，定容至 1 L。使用 0.22 µm 细胞培养滤器过滤除菌。
   1. 向培养基中加入1 M葡萄糖和100 mM丙酮酸钠，使葡萄糖和丙酮酸的终浓度分别为5 mM和1 mM。
   2. 将50 mL基础培养基置于37 °C水浴中。
2. 通过将Tris碱加入至10 mM、聚乙二醇叔辛基苯基醚加入至0.2%（v/v）、EDTA加入至1 mM，溶于ddH₂O中，配制用于通量分析结束时组织定量的裂解液₂O. 混合至所有组分完全溶解，并调节pH至8.0。
3. 对于线粒体应激实验方案，用基础培养基配制浓度为 11 µM 的寡霉素（ATP 合酶抑制剂）储备液，使孔中终浓度为 1 µM。用基础培养基配制浓度为 11 µM 的羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP，解偶联剂）储备液，使孔中终浓度为 1 µM。配制电子传递链抑制剂混合液（鱼藤酮和抗霉素 A，RAA）：将鱼藤酮加入基础培养基至浓度为 11 µM，抗霉素 A 至浓度为 22 µM，使孔中终浓度为 1 µM 鱼藤酮和 2 µM 抗霉素 A。
4. 对于糖酵解实验方案，将葡萄糖溶于基础培养基中，配制220 mM的母液，以达到孔内终浓度为20 mM。同时，将2-脱氧葡萄糖（2-DG）溶于基础培养基中，配制1.1 M的母液；2-DG是葡萄糖的竞争性抑制剂和糖酵解拮抗剂，其孔内终浓度为100 mM。

3. 仪器校准

1. 为校准细胞外通量检测的仪器，向传感器微孔板的每个孔中加入 1 mL 校准液（共 24 个孔），并在 37 °C、无 CO₂ 的培养箱中孵育过夜（或至少 8 小时）。
2. 将线粒体应激实验方案或糖酵解实验方案所需的添加剂分别加入传感器微孔板上的加样口 A 至 D 中，并根据孔内体积变化进行调整。
   注意：例如，若孔内初始体积为 450 µL，则典型的实验方案中，第一个加样口加入 45 µL 添加剂，第二个加入 49.5 µL，第三个加入 54.5 µL，最后一个加入 60 µL。
3. 在最初几次实验中，将基础培养基加入 A 口，以评估加样口注射后组织移动或伪影的程度。
4. 将加载完毕的传感器板置于 37 °C、非 CO₂ 培养箱中孵育至少 60 分钟。

4. 新鲜小鼠视网膜组织的分离

注意：此步骤改编自 Barry Winkler 博士的技术¹⁵。

1. 使用标准的氯胺酮/赛拉嗪混合物实施深度麻醉后，通过颈椎脱位法处死小鼠。
2. 使用一对中等大小的弯头镊子夹住视神经处的后部眼球，并轻轻施加向前的压力使眼球突出（图1A）。
   1. 用干净的剃须刀片，沿角膜从一侧角膜缘至另一侧角膜缘进行一次完整而有目的性的切开。
   2. 使用精细的斜头McPherson式镊子夹住后部眼球，将晶状体和前部玻璃体膜从角膜切口挤出。弃去这些组织。
   3. 重复使用镊子夹捏操作，将神经视网膜挤出。
   4. 使用镊子像勺子一样托起视网膜，避免直接夹持组织，将视网膜从角膜切口处转移出来，并直接放入盛有温热培养基的3 cm培养皿或6孔组织培养板中。
3. 使用两对精细的斜头McPherson式镊子，轻轻分离视网膜上残留的玻璃体。最佳操作方式是从视网膜杯周边部夹住玻璃体并向中心牵拉，最后整体将玻璃体从中心部位剥离。使用镊子清除视网膜光感受器表面残留的视网膜色素上皮细胞。
   1. 用剃须刀片切割P1000移液枪头，制造一个约4 mm的开口，以防止在转移过程中对脆弱的视网膜组织造成过度损伤。
   2. 使用切割后的P1000移液枪头将分离的视网膜组织转移到新鲜培养基中。
   3. 使用带有顶针装置的1 mm活检打孔器在视神经周围切取直径1 mm的视网膜组织块，以便在组织卡在孔内时可借助顶针将其推出（图1B）。将获取的视网膜组织块置于洁净培养基中，并放置于37 °C加热块或加热垫上备用。

5. 检测方案

1. 使用剪裁过的P1000枪头，将单个组织穿孔样本转移至24孔胰岛捕获微孔板中，同时吸取450 µL培养基与组织一同转移。
2. 使用精细的直头镊子将 punches 轻柔地移至微孔板中央。保持所有 punches 方向一致（例如，神经节细胞层朝上）。
   1. 将捕获板放置在设定为 37 °C 的加热垫或加热块上，并对剩余样品重复上述步骤。
      注意： 每次实验需预留3-4个空白孔，每孔加入450 µL基础培养基，作为阴性对照。在剩余的20-21个孔中，每个生物学重复设三个复孔进行检测。因此，每块24孔板可记录6-7个不同动物或处理条件的数据。
3. 避免产生气泡，使用镊子将胰岛捕获网插入每个孔中，并用金属推杆或剪裁过的P1000移液器吸头固定插入件。图1C).
   注意： 在此步骤中，应避免组织过度移动，以保持视网膜打孔位置位于样品微室的中央。气泡会严重干扰氧消耗率（OCR）读数。尽管微室深度足以容纳典型的小鼠视网膜图1C），偶尔由于筛网插入件的加工缺陷，可能导致组织在插入筛网时被过度压缩。若发生此情况，只需记录被压碎的组织，并将该样本从最终分析中剔除。
4. 在37 °C CO₂培养箱中孵育组织培养板₂无菌培养箱中孵育至少60分钟。
5. 使用混合、等待、测量和重复命令对细胞外通量分析仪进行编程。例如，视网膜组织的典型实验可能包括以下步骤：混合2分钟，等待2分钟，测量5分钟。在基线记录期间以及运行过程中每次注射待测化合物后，将上述三个步骤重复5至8次（循环）。
6. 按下细胞外通量分析仪上的程序“START”按钮，并根据屏幕上的提示插入传感器微板进行校准。
7. 校准结束后，根据屏幕上的提示，将校准板替换为含有视网膜样本的板。
8. 按预设程序运行。运行结束后，根据屏幕提示取出组织板。查看运行结果并保存数据文件。
9. 使用弯曲的20号针头和镊子，将所有膜插件从孔中取出，留下视网膜打孔组织。
10. 小心吸除组织中的培养基，用 0.5 mL 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织两次。每次洗涤后吸除 PBS。
11. 向每孔加入 100 µL 裂解缓冲液，用移液器吹打数次以充分匀浆组织。
12. 根据总双链DNA（dsDNA）或总蛋白含量定量输入量。
    注意： 以下内容基于一种市售的双链DNA检测试剂盒。
13. 将裂解后的样品用100 µL Tris-EDTA（TE）缓冲液按1:1比例稀释，并取100 µL稀释后的样品转移至96孔板中。
    1. 每孔加入 100 µL 检测缓冲液。混匀 2–5 分钟后，在激发波长 480 nm、发射波长 520 nm 条件下测定荧光强度，并根据标准曲线进行定量分析。
    2. 将原始细胞外通量轨迹数据根据孔内DNA含量进行归一化处理。
       注意： 在本研究展示的结果中，样品已归一化至50 ng dsDNA——相当于1 mm视网膜打孔组织中的典型含量。因此，本文提供的绝对值可与以相似数据形式呈现的研究进行比较 "每片视网膜 punch"将轨迹数据归一化至内部标准，例如在5 mM葡萄糖浓度下获得的基线运行数据。

结果

采用所述技术（总结于图1），将8周龄野生型（WT）小鼠的视网膜外植体与同龄、背景匹配的转导素基因敲除小鼠（Gnat1^-/-）进行比较。由于Gnat1^-/-动物缺乏响应光刺激而关闭环核苷酸门控离子通道的分子机制，其视杆细胞即使在光照条件下仍保持去极化状态¹⁴。持续维持钾离子外流将导致大量ATP消耗，从而引发生物能量应激。为了确定这种能量需求的变化是否会增加氧化磷酸化或糖酵解通量，使用细胞外通量分析仪对野生型小鼠和Gnat1^-/-小鼠的组织进行了比较。在基础状态下，存在5 mM葡萄糖和1 mM丙酮酸的条件下，野生型动物的视网膜组织与Gnat1^-/-突变体的酸外排速率相似。加入20 mM葡萄糖和糖酵解抑制剂2-DG后，也观察到类似的趋势（图2A

讨论

使用所述技术，通过生物分析仪可轻松测量离体视网膜组织的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。该方法在多个关键步骤上与其他研究团队的方法有所不同。视网膜组织通过大角膜切口分离，而无需摘除眼球，此方法最初由 Winkler¹⁵ 描述。这种视网膜分离方法可实现从活体眼球快速转移至组织捕获板（通常在5分钟内完成）。整个过程中组织始终保持在37 °C，相较于置于冰上更有利于维持细胞呼吸功能。初始测量采用添加成分最少的培养基，避免使用任何缓冲剂（如HEPES或碳酸氢钠）、血清或过量宏量营养素，以便更可靠地测量基础能量代谢，并且不会干扰ECAR的评估。视网膜组织 punch 样本最好采用24孔板格式进行记录，而非96孔板，以尽量减少对组织的损伤。将视网膜组织置于孔中央的组织微室中，并用网格插件固定。这样做可准确记录ECAR和OCR，防止运行过程中组织过度移动，并无需使用其他试剂（如组织粘合剂）。建议在检测过程中进行载剂注射，尤其是在首次设置记录实验时，这有助于判断组织在捕获板中的固定情况。采用该技术进行的OCR记录不受视网膜在孔中方向的影响，但在同一批实验的各样本之间必须保持方向一致。所有测量均...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Seahorse XF24 细胞外通量分析仪	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 胰岛捕获通量试剂盒（包含：胰岛捕获微孔板、传感器盒和校准液）	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	包含胰岛捕获微孔板、传感器盒和校准液
RPMI 1640 培养基（粉末状培养基）	Millipore-Sigma	R1383	含 L-谷氨酰胺、不含葡萄糖和碳酸氢钠的 RPMI 1640 培养基
D-葡萄糖	Millipore-Sigma	G8270	1M 过滤灭菌 D-葡萄糖，用于培养基配制
丙酮酸钠	Corning	25000CI	100 mM 丙酮酸钠
抗霉素 A	Millipore-Sigma	A8674	线粒体应激实验方案组分
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	线粒体应激实验方案组分
鱼藤酮	Millipore-Sigma	R8875	线粒体应激实验方案组分
2-脱氧葡萄糖	Millipore-Sigma	D6134	糖酵解实验方案组分
1 mm 带推杆皮肤活检打孔器	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	视网膜组织外植块工具
Dumont 小型直头镊子	Fine Science Tools	11200-10	视网膜组织外植块工具
Dumont 医用 #5/45 镊子 - 45 度弯头	Fine Science Tools	11253-25	视网膜组织外植块工具
Dumont #7 镊子 - 弯头型	Fine Science Tools	11271-30	视网膜组织外植块工具
Quant-iT Picogreen 双链 DNA 检测试剂盒	Fisher Scientific	P7589	上样归一化检测
Trizma 碱（Tris 碱）	Millipore-Sigma	T6066	裂解缓冲液组分
Triton X-100（聚乙二醇叔辛基苯基醚）	Millipore-Sigma	X100	裂解缓冲液组分
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	裂解缓冲液组分
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratories	品系 000664	实验动物
Gnat1-/- 及背景匹配的 Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	实验动物