方法文章

利用多步链置换光刻技术实现基因的功能性表面固定

DOI：

10.3791/58634

⸱

2018年10月25日

 ,  ,  , 
1Physics Department, Technical University of Munich

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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我们描述了一种简单的光刻方法，用于将基因长度的DNA分子固定在表面，该方法可用于在生物芯片上进行无细胞基因表达实验。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将基因固定在光刻结构化表面上，可在开放式的微流控生物反应器系统中研究区室化的基因表达过程。与其他构建人工细胞系统的方法相比，该装置可实现基因表达试剂的持续供给以及代谢废物的同步排出。这有助于长时间维持无细胞基因表达过程，对于实现动态基因调控反馈系统具有重要意义。本文提供了一种利用基于DNA链置换反应的简易光刻技术制备基因芯片的详细方案，该技术仅使用商业化组件。同时，我们还提供了将区室化基因与聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控系统集成的操作流程。此外，我们证明该系统可与全内反射荧光（TIRF）显微镜兼容，可用于直接观察DNA与表达混合物中分子之间的分子相互作用。

引言

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无细胞基因表达反应在生物化学、生物技术及合成生物学的多种应用中备受关注。无细胞蛋白质表达对于制备高纯度蛋白质样品起到了关键作用，这些样品是大量结构生物学研究的基础。例如，无细胞系统已成功用于表达使用基于细胞的表达方法难以制备的蛋白质复合物1或膜蛋白2。值得注意的是，无细胞基因表达反应还被用于解析遗传密码的结构，始于1961年Nirenberg和Matthaei的开创性实验3。

近年来，无细胞方法在生物技术和合成生物学领域重新受到关注4,5,6无细胞系统可加入非生物化合物，且更易于组合不同生物来源的组分。7。尽管无细胞系统明显存在缺乏完整细胞环境的缺点 "生长与分裂"可以设想制备具有基本代谢功能的开放式无细胞生物反应器，在提供简单的碳源和能源输入后，使其合成代谢产物。8在合成生物学这一新兴领域中，无细胞系统有望表现出更高的可预测性 "底盘" 用于实现合成生物学功能。

目前....

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方案

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NOTE: A time schedule for the steps in the different sections is given in the supplementary information (section 1).

1. Chip Fabrication

NOTE: As substrates, use silicon wafers (100 mm diameter, 0.525 mm thickness) with a 50 nm thick layer of silicon dioxide or glass slides (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 mm x 50 mm, no. 4). Depending on the application, other sizes and thicknesses may be more suitable.

  1. Cleaning the substrates via an RCA clean procedure (water, ammonia solution NH3(aq) 30% and hydrogen peroxide H2O2 30%, at a ratio 5:1:1)
    1. Mix water and....

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结果

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两步光刻： 图5 展示了在载玻片上进行两步光刻工艺的结果，该载玻片上具有重叠的荧光标记DIS链图案。

从基因刷表达荧光蛋白：图6 展示了从固定化DNA中表达荧光蛋白YPet的结果。我们在多个时间点通过部分漂白荧光蛋白并观察荧光信号的恢复情况来评估基因表达速率，忽略立即发生的恢复，因其并非由蛋白质表达引起。在表达两小时后首次漂白，荧光强度迅速恢复并超过漂白前的水平；而在表达四小时和六小时后，荧光强度未能恢复至先前水平，表明若无新鲜表达混合液的补充，反应在约3-4小时后即终止。

与微流控技术联用：通过向表达区室持续供给额外的前体分子，可延长基因表达的持续时间 通过 微流控技术

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讨论

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光刻前是一种用于DNA或RNA图案化固定的强大且多功能的技术。然而，该过程包含多个步骤，如果这些步骤发生改变，可能会导致系统失败或性能降低。

Bephore芯片制备过程中的一个关键步骤是基底的PEG化，该步骤可提供表面的生物相容性。此处，采用RCA程序进行清洗步骤至关重要，因为该步骤还能活化表面，以利于后续的硅烷化反应。在实际的PEG化过程中，基底必须始终保持湿润，不得干燥。此外，Silane-PEG-Biotin必须妥善保存，以维持其反应活性（见第1.2节），并避免发生交联。为评估PEG化的效果，可将基底与荧光标记的链霉亲和素孵育，并与未进行PEG化的对照组进行比较。成功完成PEG化的基底应比对照组结合显著更多的链霉亲和素。

此外，在光刻工艺的后期阶段，芯片的干燥会产生不利影响，导致 例如 已结合DNA的去除，或DNA向底物未曝光区域的更高吸附。

如上文（第3.2节）所述，光刻工艺的分辨率和所需的曝光时间取决于实验装置（物镜、光源， 等等。

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披露

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作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

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我们衷心感谢大众基金会（资助编号：89 883）和欧洲研究理事会（资助协议编号：694410 - AEDNA）对本项目提供的资金支持。M.S.-S. 感谢德国研究基金会通过 GRK 2062 项目提供的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带50 nm二氧化硅的硅片（Bephore基底）Siegert Wafer厚度（µm）：525 ±25，直径（mm）：100
硅片（用于PDMS主模具）Siegert Wafer厚度（µm）：525 ±25，直径（mm）：76.2（3”）
4号载玻片Menzel22 mm × 50 mm
1.5号载玻片Assistent24 mm × 24 mm
生物素-PEG-硅烷Laysan Bio分子量 5,000
无水甲苯Sigma Aldrich (Merck)244511
链霉亲和素Thermo-Fisher ScientificS888
DNAIntegrated DNA Technologies (IDT)
Phusion高保真PCR预混液（含HF缓冲液）New England BiolabsM0531SPCR试剂盒
Wizard SV凝胶和PCR纯化系统 PromegaA9281离心柱式PCR纯化试剂盒
PURExpressNew England BiolabsE6800S无细胞表达系统
PDMS Dow CorningSlygard 184
FluoSpheresThermo-Fisher ScientificF8771
聚四氟乙烯管（内径：0.8 mm，外径：1.6 mm）BolaS 1810-10
EpoCore 20micro resist technology GmbH光刻胶
mr-Dev 600micro resist technology GmbH光刻胶显影液
Ti-PrimeMicroChemicals粘附促进剂
双组分硅胶PicodentTwinsil 
紫外防护黄色胶片Lithoprotect (via MicroChemicals)Y520E212
设备
光刻用掩膜板Zitzmann GmbH64,000 dpi，180 mm × 240 mm
正置显微镜OlympusBX51用于光刻和荧光成像
60倍水浸物镜OlympusLumPlanFl与Olympus BX51联用，数值孔径NA 0.9
20倍水浸物镜OlympusLumPlanFl与Olympus BX51联用，数值孔径NA 0.5
相机PhotometricsCoolsnap HQ与Olympus BX51联用
光源EXFOX-Cite 120Q与Olympus BX51联用
倒置显微镜NikonTi2-E用于基因表达的荧光成像
4倍物镜NikonCFI P-Apo 4x Lambda与Nikon Ti2-E联用
相机AndorNeo5.5与Nikon Ti2-E联用
光源LumencorSOLA SM II与Nikon Ti2-E联用
培养箱笼式孵育器Okolabbold line与Nikon Ti2-E联用
压力控制器ElveflowOB1 MK3
NanoPhotometerImplen用于DNA浓度测定
等离子清洗仪DienerFemto200 W，法拉第笼内操作，气压0.8 mbar

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H.

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重印与许可

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标签

DNA PDMS DNA

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