流式细胞术检测乳腺癌干细胞样细胞在凋亡逆转后的新形成

摘要

本文介绍了一种通过荧光激活细胞分选技术分离凋亡乳腺癌细胞的实验方案，并进一步利用流式细胞术检测乳腺非干细胞样癌细胞在凋亡逆转后向乳腺癌干细胞样细胞转变的过程。

摘要

长期以来，肿瘤学家一直在研究癌症复发问题，但其潜在机制仍不明确。近期，我们及其他研究者发现，一种称为凋亡逆转的现象在不同刺激条件下可导致多种细胞模型的致瘤性增强。以往的研究主要集中在体外和体内追踪这一过程；然而，真正发生逆转的细胞尚未被成功分离，这限制了我们对凋亡逆转后果的理解。本文中，我们利用Caspase-3/7绿色检测试剂对凋亡诱导后激活caspase的细胞进行标记，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进一步分选出阳性信号细胞用于回收。共聚焦显微镜下的形态学观察有助于在FACS前确认细胞的凋亡状态。致瘤性的增加通常可归因于具有癌干细胞（CSC）样特征的细胞比例上升。此外，鉴于乳腺癌的高度异质性，明确这些CSC样细胞的来源对于癌症治疗至关重要。因此，我们在诱导凋亡前预先制备乳腺非干细胞样癌细胞，随后分离出caspase激活的细胞并实施凋亡逆转操作。流式细胞术分析显示，在发生逆转的细胞群体中重新出现了乳腺CSC样细胞，表明这些CSC样细胞是在凋亡逆转过程中由乳腺非干细胞样癌细胞转化而来。综上所述，本实验方案包括凋亡性乳腺癌细胞的分离，以及通过流式细胞术检测逆转细胞中CSC样细胞比例的变化。

引言

癌症一直是全球各国的主要死因之一，给世界各国带来了沉重的负担¹。在所有类型的癌症中，乳腺癌在女性患者中的发病率和死亡率均位居前列¹。由于癌症具有异质性，临床上通常采用多种药物联合化疗，以诱导癌细胞死亡^2,3,4。然而，由于常见的化疗药物通常以DNA^5,6、蛋白质合成^7,8和/或微管动力学⁹为靶点，因此对快速增殖的细胞影响最大，而对静止期细胞（如癌症干细胞（CSC））的影响通常较小¹⁰。因此，CSC在治疗后更有可能存活下来，进而导致耐药性和癌症复发^10,11。因此，清除CSC已成为癌症治疗中的一个重要课题，研究CSC的起源也十分必要。

近十年来，关于细胞凋亡....

方案

1. 乳腺非干细胞癌细胞的制备

1. 在100 mm培养皿中，使用10 mL不含酚红的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基（添加10%热灭活胎牛血清（FBS））培养MCF-7和MDA-MB-231细胞。在100 mm培养皿中，使用10 mL不含酚红的RPMI 1640培养基（添加2 mM L-谷氨酰胺、10%热灭活FBS和1% v/v青霉素-链霉素（PS））培养T47D细胞。将细胞置于37 °C、5% CO₂/95%空气的细胞培养箱中培养。
   注意：酚红会影响基于荧光的检测，同时由于其类雌激素效应，可能对乳腺癌细胞的生长产生潜在影响³¹。例如，酚红可刺激MCF-7细胞的孕激素受体表达和细胞增殖³¹，也可能促进T47D细胞的生长³¹。
2. 用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。向MCF-7和MDA-MB-231细胞中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，向T47D细胞中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。
   注意：不同类型的乳腺癌细胞解离所需的胰蛋白酶-EDTA浓度有所不同，不合适的浓度可能影响某些细胞表面标志物（如CD44和CD24）....

结果

为了观察乳腺非干细胞样癌细胞向乳腺癌干细胞样细胞（CSC）的转变，首先需要对CD44^-/CD24⁺乳腺癌细胞进行分选。对于MCF-7细胞系（其原始细胞群中约有0.15%的细胞表达CSC标志物，图1），该步骤有助于排除在凋亡逆转过程中CSC富集的可能性。相反，若原始细胞群中不存在表达CSC标志物的细胞（如T47D细胞，图1），则可省略此分选步骤。事实上，设门策略会影响各标志物阳性与阴性群体的界定，从而最终影响所确定的CSC比例。因此，应谨慎选择并制备适当的对照，包括目标抗体的同型对照以及各标志物的单染对照，用于设门调整（图1）。

利用乳腺非干细胞样癌细胞，可建立凋亡逆转模型。加入凋亡诱导剂后可观察到典型的形态学变化，撤除药物后细胞应恢.......

讨论

本方案描述了一种直接且清晰的方法，用于检测乳腺非干细胞样癌细胞因凋亡逆转而转变为乳腺肿瘤干细胞（CSC）样细胞的过程。这些逆转细胞的CSC特性可通过以下方法加以验证 i体外乳腺球形成实验 体内 免疫缺陷小鼠异种移植^{18,24,26,27,42,43,44,45}在此，我们使用了两种乳腺癌细胞系，但本方案还可进一步应用于其他乳腺癌细胞系。由于该现象在CD44数量较少的乳腺癌细胞系中表现明显⁺/CD24^- 细胞最初存在的情况下，不建议选.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MCF-7	美国模式培养物集存库 (ATCC)	HTB-22
MDA-MB-231	美国模式培养物集存库 (ATCC)	HTB-26
T47D	美国模式培养物集存库 (ATCC)	HTB-133
试剂
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25300054
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200072
Alexa Fluor 680 标记的膜联蛋白 V 偶联物	Invitrogen	A35109
牛血清白蛋白	USB	9048-46-8
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C-5080
CellEvent caspase-3/7 绿色荧光染料	Invitrogen	C10423
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
Fc 封闭剂	Miltenyi Biotec	130-059-901
胎牛血清	Invitrogen	16000044	热灭活
HEPES	USB	16926
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030081
Mitotracker Red CMXRos	Invitrogen	M7512
抗人 CD24 单克隆抗体	BD Biosciences	555428	PE 克隆：ML5 批号：5049759 RRID:AB_395822
抗人 CD44 单克隆抗体	BD Biosciences	560531	PERCP-CY5.5 克隆：G44-26 批号：7230770 RRID:AB_1727485
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
紫杉醇	Sigma-Aldrich	T7402
PE 小鼠 IgG2a, κ 同型对照	BD Biosciences	554648	克隆：G155-178 (RUO) RRID:AB_395491
青霉素-链霉素	Invitrogen	15070-063
PerCP-Cy5.5 小鼠 IgG2b, κ 同型对照	BD Biosciences	558304	克隆：27-35 RRID:AB_647257
磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher Scientific	21600010
碘化丙啶	Invitrogen	P1304MP
Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基	Invitrogen	11835055	无酚红
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
星形孢菌素	Sigma-Aldrich	S4400
设备
100 mm 培养皿	Greiner Bio-One	664160
12 孔组织培养板	Thermo Fisher Scientific	150628
40 μm 尼龙网细胞筛	BD Biosciences	08-771-1
FACSuite 软件套装 v1.0	BD Biosciences	651360
FACSVerse	BD Biosciences	651155
FluoView FV1000 共聚焦显微镜	Olympus	IX81	60X 物镜
FV10-ASW Viewer 软件 Ver.4.2b	Olympus	-
圆底聚苯乙烯 12 × 75 mm 试管	BD Biosciences	352003
S3e 分选仪	Bio-Rad	1451006