本方案描述了一种我们已标准化并多年用于将特定量的核酸直接递送至蚊子和家蝇血淋巴的显微注射方法。该方案可实现极低的注射死亡率，并允许进行与剂量相关的繁殖力测定。
本文内容
摘要
摘要
用于诱导RNA干扰的合成双链RNA（dsRNA）可能具有剂量依赖性的表型效应。如果采用非定量方法递送dsRNA，则难以明确这些效应。准确递送已知数量的核酸或其他化学物质，对于评估待测化合物的有效性以及在不同化合物之间进行可靠比较至关重要。
本文提供了一种可重复且定量的显微注射方案，可确保准确递送特定剂量的dsRNA，从而降低通常由注射损伤引起的死亡率。该方法的改进包括添加罗丹明B、使用带刻度的注射针头，以及借鉴Isoe和Collins的改良恢复方法。该方法可用于计算剂量反应，并促进不同化合物之间的比较。该方法的多个版本已成功应用于三种蚊子属以及家蝇，以评估核糖体RNA转录本基因沉默所导致的生殖力下降情况。
本方案提供了多种策略，以降低小型昆虫显微注射过程中的若干技术难题。通过机械方式递送dsRNA并结合可视化验证、确定有效的递送位点，以及设置注射后的恢复期，可确保精确给药并显著降低因损伤导致的死亡率。本方案还描述了一种产卵生物测定法，用于一致地评估对繁殖力的影响。
引言
向成年双翅目昆虫（包括蚊科和蝇科）递送小分子生物分子（如核酸）已被证明具有挑战性。已有报道称，通过口服摄入dsRNA可导致成年埃及伊蚊（Aedes aegypti）幼虫出现不育（当靶向仅在成虫睾丸中表达的基因时）或死亡（当靶向SNF7和类固醇受体共激活因子时）1,2。在幼虫期家蝇（Musca domestica）中靶向HSP70时也观察到致死效应3。然而，将dsRNA掺入糖餐饲喂成年埃及伊蚊（Ae. aegypti）后，并未产生上述表型效应4,5。
显微注射已被用于在引入病原体或核酸时绕过中肠，从而诱导系统性反应5,6,7,8,9,10。目前已存在多种显微注射技术，所用设备范围从需通过视觉测量注射体积的自制装置，到可实现低至2.3 nL自动化体积输送的微处理器控制注射仪5,9,10,11。靶向核糖体mRNA的RNA干扰（RNAi）触发因子可破坏节肢动物的卵巢发育，这些节肢动物包括牛蜱Rhipicephalus microplus、埃及伊蚊Aedes aegypti和致倦库蚊Culex pipiens，以及家蝇Musca domestica5,9,12,13。在这些研究中，监测产卵行为的中断对于评估接种物的有效性至关重要，因为该表型可能表现为子代终止或减少。这是一种多代致死性表型，是许多非传统生物防治方法（如引入感染Wolbachia的雄性个体（导致生殖不亲和）以及RNAi诱导的不育）中关键且期望实现的效果5,9,14。追踪死亡率和繁殖力对于高特异性生物合理药物（天然存在的病原体和/或天然衍生物）的表征与开发十分必要15。
本方案详细介绍了成年蚊子和家蝇的显微注射技术，这一过程在文献中往往描述不足。此外，还描述了用于充分评估双链RNA对成年双翅目昆虫影响的产卵行为生物测定方法。这些方案最初是为埃及伊蚊（Aedes aegypti）和家蝇（Musca domestica）专门开发的，但也可根据需要修改用于其他物种。
方案
1. 昆虫准备
- 将蚊子置于4 °C环境中数小时，或暴露于CO2中2分钟，随后在4 °C条件下保持，以进行冰麻醉；在注射前2‒3小时将果蝇置于4 °C进行冰麻醉。若产卵是观测指标，则需确保蚊子和果蝇已完成交配。
注意：蚊子的麻醉方法取决于其种类和品系，例如，Culex从冰麻醉中恢复的速度明显快于Aedes aegypti，因此更推荐使用CO2麻醉法。 - 将载玻片置于冰上，使用柔软的镊子小心地将蚊子或果蝇腹面朝上摆放，间距约0.5 cm。标准载玻片可容纳两排，每排6只蚊子，或6–7只家蝇。在载玻片左端或右端预留1–1.5 cm的空白区域，不放置蚊子或果蝇，以便于操作。
- 将摆放好昆虫的载玻片置于大型培养皿中，并在4 °C条件下保存，直至准备进行注射。
注意：在培养皿盖上钻一个小孔，有助于防止盖上盖子时因空气位移而扰动昆虫。在培养皿底部固定几根玻璃毛细管，并将载玻片置于其上，可便于从培养皿中取出载玻片。
2. 昆虫注射
- 按照Estep所述方法制备dsRNA 等5 和Sanscrainte 等9若无污染物，可通过分光光度计测定260 nm处的吸光度，并根据A260值计算RNA浓度（单位为μg/mL）260 × 稀释倍数 × 40
- 在冰浴台或浅冰桶上方设置解剖显微镜和显微注射仪，用于对低温麻醉的蚊子和果蝇进行注射操作（参见步骤1.1–1.3及 图1).
- 使用拉针仪将玻璃毛细管拉成细尖（参数设置：加热器 = 15 单位，电磁阀 = 4 A）。
注意：参见 材料表 有关制造商的详细信息。 - 按照制造商的说明将毛细管针装入显微注射器中，并用镊子轻压针尖以折断，形成尖锐的端部。
注意：建议蚊子的针头开口尺寸约为 150 µm，家蝇约为 250 µm。 - 设定显微注射仪至所需递送体积。建议采用约 50 nL 的液滴进行蚊虫显微注射，因其弯月面移动易于观察。如有条件，启用快速注射模式。用无核酸酶水冲洗注射针头，填充并排出液体 3 次。
- 配制注射用溶液，使其浓度满足：100‒150 nL 可为蚊虫提供所需剂量，500 nL 可为家蝇提供所需剂量。
注意：建议初始剂量：每只蚊子1 µg，每只家蝇5 µg5,9. - 可选地，对于蚊子，可在溶液中加入罗丹明B（终浓度为3.0 µg/mL），以辅助观察。
注意：染料注射至腹部与胸部交界处腹面近乎透明的角质层后，可通过其粉红色清晰观察到。 - 用移液器吸取3–4 µL待注射溶液，滴加到洁净表面（如一片石蜡膜上），然后吸入玻璃针头中，注意避免吸入任何空气。反复按压注射按钮，直至液体开始从针头流出，再用精细擦拭纸轻轻擦去液滴。
注意：尽管某些型号的显微注射器需要回填注射器，但本文所提及的注射器 材料表 不。 - 使用超细点标记笔，从液体弯月面开始，向针柄方向每隔约1毫米画一条刻度线。这有助于观察弯月面的移动，并确保注射时溶液已进入蚊虫体内。
- 将按步骤1.2–1.3制备好的蚊子或苍蝇载玻片置于冰台或冰上，放在针头下方图1确保显微镜视野足够宽，能够观察到针头中溶液的弯月面。
- 对于蚊子，将针头对准中胸侧板的中间三分之一区域（图2A），用镊子从对侧固定蚊子以抵住针头，同时使用显微注射仪的微米调节装置，轻轻用针尖刺破蚊子的体壁。
- 对于家蝇，将针头对准中胸侧板（图2B）同时用针固定果蝇，用针尖轻轻刺穿其体壁。
- 轻轻将针头滑入蚊子或苍蝇体内，直至针尖穿过中线。
注意：进针过浅常导致注射液在昆虫体表形成液滴渗出（参见步骤 2.15）。 - 在观察针头内液体弯月面移动的同时，按压注射按钮，直至注入所需体积的液体。对于蚊子，若设定为每次注射50.6 nL，则按压2次以注入约100 nL，或按压3次以注入约150 nL。对于家蝇，按压注射按钮直至注入约500 nL的液体（即， 以69纳升分装，按7次，共483纳升。
- 如果液面未移动，在观察液面变化的同时，缓慢将蚊子或果蝇从针头移开。若拔出针头时有部分注射液从表皮渗出，或液面仍无移动，则丢弃该昆虫，因为此次注射未成功。
- 将成功注射的蚊子以每组10–15只，或家蝇以每组5只，转移至洁净的3.5盎司收集杯中。用薄纱或网罩覆盖，在室温下恢复。
- 蚊子和苍蝇恢复后（1–2 小时），将每个饲养杯倒扣在浸有 10% 蔗糖溶液的棉球上。
注意：将杯子倒置在蔗糖棉上方有助于提高存活率，因为它更便于获取糖分食物10. - 在注射不同溶液之间，按照步骤 2.5 冲洗针头。注射完成后，将使用过的针头丢弃至适当的锐器容器中。
3. 埃及伊蚊 死亡率与产卵生物测定
- 注射后连续三天继续为蚊子提供10%蔗糖，并记录明显死亡的蚊子数量。
- 将新鲜血液填充至长度不超过12英寸的人工膜（如胶原蛋白香肠肠衣）中即， 牛的 埃及伊蚊) 并在60 °C水浴中加热。
- 用纸巾轻轻滚动膜以短暂干燥，然后将其覆盖在3.5盎司透明 Holding Cups 的 tulle 帽上。为增强摄食效果，可在加热后向血液中添加1 mM ATP作为摄食刺激剂，或用干净的双手直接接触温热的血肠，使肠衣表面残留人体挥发性物质。
- 吸血后，更换饲养杯顶部浸有10%蔗糖溶液的棉球，并将蚊虫静置约24小时，然后转移至产卵杯中。
- 使用透明的3.5盎司生物测定杯，加入约30 mL去离子水，制备产卵杯2O，并将一张种子发芽纸（约4 cm宽、5 cm长，纵向有褶皱）放置在杯底并紧贴杯壁图3A）。用薄纱或网罩覆盖，并在薄纱或网罩上切一小口（约1 cm）。
- 在吸血后24小时，于饲养杯的纱布盖上剪开一个小口（约1 cm），通过轻柔的口吸法将成功吸血（腹部可见血团）的雌蚊单独转移至产卵杯中（每只产卵杯放入1只雌蚊）。用饱和10%蔗糖溶液的棉球封住产卵杯盖上的切口。
- 在约 27 °C 条件下培养 5‒7 天，使蚊子充分产卵，同时记录每日死亡率。在解剖显微镜下计数卵。
4. 家蝇 死亡率与产卵生物测定
- 注射后三天内，继续为果蝇提供10%蔗糖，并记录明显死亡的果蝇数量。
- 注射后第三天，将聚乙烯管通入二氧化碳（CO2）短暂覆盖盛放果蝇的杯子，使其麻醉，直至所有果蝇静止不动并沉至杯底。
- 将果蝇转移至一个洁净的饲养笼中，该笼由一个4 L塑料罐和覆盖罐口的网罩（直径10 cm，图3B）组成。为果蝇提供水以及按体积比8:8:1混合的颗粒蔗糖、奶粉和干蛋黄，持续饲养四天，每天记录并移除死亡果蝇。
- 通过按重量混合75%麦麸和25%颗粒牲畜饲料，制备新鲜果蝇幼虫培养基的干料成分。加水调节至含水量62%（直至轻轻挤压时仅有少量水滴渗出）。
- 取上述新鲜幼虫培养基与“使用过”的果蝇幼虫培养基（曾用于果蝇化蛹的培养基）按1:1比例混合，制成直径2.5 cm的球状物。用一块方形黑色棉布包裹该球体，轻轻挤压至培养基中的液体微微渗出，然后用橡皮筋将棉布固定在球体周围。
- 将该球体放入一个60 mL的杯子中，并置于果蝇饲养笼内5小时（图3B）。
- 用水冲洗产卵球上的卵，确保卵从布料褶皱中完全清除。轻轻振荡以打散卵团，然后用移液管将卵转移至一个带刻度的20 mL离心管中。
- 等待卵沉降后，记录离心管中沉降卵的体积。加入足够的水，使总体积达到沉降卵体积的20倍。记录水与卵的总体积。
- 在使用磁力搅拌子或剧烈搅拌使水和卵悬液混合均匀的同时，用剪去尖端的1 mL移液枪头，将0.5 mL的卵悬液以线条形式滴加到一片预先润湿的黑色布料上。在解剖显微镜下计数卵的数量。
- 重复步骤4.9两次。若其中一次计数结果为显著异常值（即与其余两次计数相差>35%），则进行第四次计数，并舍弃异常值。
- 计算每次取样的平均卵数，乘以2得到每毫升悬液中的卵数。将该“卵/毫升”数值乘以步骤4.8中所得卵悬液的总体积，即为产卵总数的估计值。
结果
在蚊子中显微注射dsRNA
该显微注射方法已在本实验室用于评估80多种dsRNA触发物在多个蚊属中的基因表达、死亡率及产卵反应伊蚊, 按蚊属, 库蚊）。向来自群体品系的雌性注射 埃及伊蚊 (ORL1952) 与 1 µg 由核糖体转录本RPS6和RPL26衍生的dsRNA（参见Estep 等5 用于dsRNA制备方法和序列数据）与注射对照dsGFP的蚊虫相比，在多个产卵周期中均表现出相对表达量（RE）的显著降低。 Aedes aegypti 2 后测量的 REnd 生殖营养周期显示出RPS6表达的显著降低（P < 0.05），通过同一组中dsGFP对照的Student t检验确定图4)5.
通过本文所述的产卵生物测定法评估单个雌性蚊虫的繁殖力。注射后第3天，将蚊虫进行血液饲喂，随后转移至单独的产卵容器中，允许其完成整个产卵过程。与注射dsGFP的对照组（n = 79只雌蚊，49.3 ± 3.5枚卵，图5A）相比，注射dsRPS6的埃及伊蚊（Ae. aegypti）（n = 102只雌蚊，1.3 ± 0.8枚卵（均值±标准误））和注射dsRPL26的实验组（n = 86只雌蚊，4.0 ± 1.1枚卵）在第一 gonotrophic 周期中的平均卵块数量均显著减少。在第二 gonotrophic 周期后的卵块评估也显示，两个dsRNA处理组的产卵量均显著降低，但效应量有所减弱。由于各组埃及伊蚊（Ae. aegypti）的数量存在差异，因此采用Dunn检验进行均值间的多重比较5。24小时内的死亡率通常为3%或更低。
注射dsRPS6时观察到明显的剂量效应 1 µg 至女性中的 50 ng 埃及伊蚊，且与之相比，窝卵数存在显著差异 1 µg/female dsGFP 注射对照组，除 25 ng/雌性 dsRPS6 剂量组外（图5B).
家蝇中注射dsRNA
对家蝇（Musca domestica，ORL 正常品系）注射5 µg针对家蝇RPS6和RPL26转录本设计的dsRNA构建体9。与埃及伊蚊（Ae. aegypti）中的观察结果类似，RPS6和RPL26特异性转录本的表达水平显著降低，且产卵量也显著减少（图4 和 图5A）。通过Student's t检验分析同一组内的dsGFP对照组，确定RE显著降低（P < 0.05）；不同家蝇（M. domestica）处理组之间的产卵量差异则采用Holm-Sidak检验确定显著性。卵巢解剖结果显示，dsRPS6和dsRPL26处理组的卵子发生减少，而饲喂dsGFP的果蝇其卵黄蛋白原沉积正常，根据Tyndale-Biscoe评分标准进行评估9。
图 1：向成年蚊子和家蝇递送微量液体的显微注射装置。 注射操作在置于冷却台上、经低温麻醉的昆虫上进行，昆虫被固定在显微镜载玻片上。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：Ae. aegypti 和 M. domestica 的显微注射位点。（A） 成年 Ae. aegypti 的注射部位位于中胸侧板中段的三分之一区域。（B） 成年 M. domestica 的注射部位位于中胸侧片。箭头指示注射位点。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：产卵行为生物测定装置。（A） Ae. aegypti 产卵实验杯，内含作为产卵基质的种子发芽滤纸，杯口覆盖薄纱并放置浸有10%蔗糖溶液的棉球。（B） 家蝇（M. domestica）雌成虫在产卵行为测定容器中，其中包含食物（A）、水（B）和幼虫培养基（C）。请点击此处查看该图的高清版本。
图4：RPS6的相对表达水平 埃及伊蚊 和 M. domestica 注射物种特异性dsRNA。 Aedes aegypti 和 M. domestica 分别注射了1和 5 µg 分别用对照dsRNA（dsGFP）或针对每种昆虫RPS6或RPL26转录本设计的dsRNA处理。显著降低（P < 在注射了dsRPS6的蚊子和蝇类以及注射了dsRPL26的蝇类中观察到RPS6表达量显著降低（*P* < 0.05，由星号标示）。误差线表示均值±标准误，柱状图底部的数字表示检测个体数。该图经Estep修改 等5 和Sanscrainte 等9. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：平均窝卵数 埃及伊蚊 和 M. domestica 注射物种特异性dsRNA。（A） 产卵量显著减少（P < 0.05）在两者中均 埃及伊蚊 和 M. domestica 注射1后 5 µg 分别注射对照dsRNA（dsGFP）或针对每种昆虫RPS6或RPL26转录本设计的dsRNA。星号表示与同一组的dsGFP对照相比存在显著差异。误差线表示均值±标准误，柱状图底部数字表示检测个体数。该图已根据Estep修改 等5 和 Sanscrainte 等9. （B） 剂量曲线 埃及伊蚊 注射剂量为每只雌虫50 ng至1000 ng的dsRPS6后，其繁殖力显著低于注射dsGFP（每只雌虫50、100和1000 ng）的对照组。误差线表示每剂量组36–81个个体的平均值±95%置信区间。标有字母的点表示组间差异显著（P < 0.05） < 0.05）的显著性水平，通过方差分析（ANOVA）确定。该图已根据 Estep 的原始内容修改 等5. 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
显微注射是一种有价值的实验室技术，可确保将dsRNA或其他生物制剂（例如农药、病毒、微孢子虫）递送至目标生物体内。尽管许多实验室已开展显微注射操作，但由于递送系统的技术限制，实际注射量往往不明确，因为递送体积通常未被直接测量11。递送体积和浓度是关键参数，可用于计算标准毒理学指标，如EC50或IC50，或确定最小有效剂量5,16。这一点在利用RNAi技术对成虫昆虫开展功能研究时尤为重要，因为通过饲喂方式递送时，并不总能实现目标颗粒物的全身性暴露，且实际穿过中肠的剂量尚不明确5。
尽管显微注射操作最初可能具有挑战性，但通过练习和耐心，注射速度和递送准确性的提升会非常迅速。掌握注射操作本身需要投入时间，但一旦熟练掌握，该操作即可产生可重复的结果，且损伤导致的死亡率低于<3%。随着操作熟练度的提高，成功注射的比例将逐步上升，每天可完成300只蚊子或果蝇的注射。
显微注射的许多挑战源于所使用的针头。确定合适的毛细管针断裂点和针尖角度是该操作中较难掌握的部分，需要通过反复试验才能确定针对特定物种最有效的开口尺寸。最适合蚊子显微注射的细针（约150 µm）口径过小，无法快速注入果蝇所需的较大体积；而适用于果蝇的较大针头开口（约250 µm）则会对体型较小的蚊子造成严重的组织损伤，并导致不可接受的注射死亡率。针尖过于钝的针头往往难以无损穿透表皮，容易引起组织损伤并增加死亡率。在实验过程中，昆虫的鳞片或组织碎片可能堵塞针头，因此准备多个拉制好的针头以备更换通常很有帮助。我们发现，更换困难的针头比花费时间尝试疏通堵塞或污染的针头更为高效。
观察注射溶液进入昆虫体内至关重要，以便及时剔除注射失败的样本（见步骤 2.14–2.15）。在注射溶液中添加罗丹明 B 可提供清晰的视觉标记，确保经过低温处理的昆虫获得准确的剂量，尤其有助于练习阶段的操作（见步骤 2.7）。
本研究所采用的注射与产卵生物测定方法，通过使用针对物种特异性核糖体转录本设计的dsRNA，已成功在成年埃及伊蚊（Ae. aegypti）和家蝇（M. domestica）中诱导基因沉默，并产生可测量的表型效应（图4 和 图5A）。此外，该方法能够精确地向个体递送微量体积，从而可利用少量材料（低至50 ng；图5B）生成剂量-反应曲线。这一优势在筛选siRNA或dsRNA等实验中尤为有用，因为大量制备此类分子可能成本高昂。
在确保递送缓冲液通过注射无不良影响后，可修改本方法以递送生物制剂（病毒、细菌、微孢子虫）或化学杀虫剂。由于递送体积受限于昆虫的大小，制备高浓度的测试溶液尤为重要。
为了充分评估dsRNA的效力，有必要追踪产卵情况，因为致死表型可能仅在子代中显现。如本文所述，需将雌性 埃及伊蚊 排卵后分别进行采血，可实现对个体产卵数的单独测定，并可在产卵后对同一实验个体进行后续检测即， 基因表达研究、额外的生殖营养周期、组织特异性敲低）以关联生殖产出与其他指标，例如基因表达。作为 M. domestica 通常以群体产卵的方式进行产卵，诱导单独的怀卵雌蝇产卵极为耗时费力，不适合大量个体的操作17因此，本文介绍了一种测定平均窝卵数的方法。
本文介绍的显微注射方法可实现对蚊子和家蝇的稳定系统性递送。结合死亡率和产卵行为追踪生物测定，这些多功能工具可用于评估小RNA分子、生物制剂以及传统杀虫剂在无法通过口服途径递送时的转录水平和表型效应。
披露
所有作者均为美国农业部或国防部的雇员或合同人员。本论文是在履行公务期间完成的，根据法律规定属于公共领域。文中表达的观点仅代表作者意见，并不代表美国政府的官方立场或认可。提及商业产品并非表示推荐使用。
致谢
作者感谢 Hanayo Arimoto（美国海军）、Dana Johnson、Lucy Li 以及 Roxie White（美国农业部农业研究局）在数据采集与分析方面提供的帮助。我们还感谢 Pia Olafson 博士（美国农业部农业研究局）和 Ke Wu（佛罗里达大学）对稿件的审阅，以及 Niklaus Hostettler（佛罗里达大学）显微镜视频的拍摄工作。本研究由美国农业部、海军和海军陆战队公共卫生中心 WII-141C 项目以及部署作战人员防护项目提供资助。资助方未参与本研究的设计、实施或稿件撰写工作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 拉针 | |||
| 垂直拉针仪 | Kopf | 720 | 设置：加热器 = 15 单位，电磁阀 = 4 安培 |
| 玻璃毛细管，3.5" 长，ID = 0.530 mm ± 25 μm，OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | 用于拉制玻璃针的毛细管 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 显微注射工作站 | |||
| 纳升级 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | 显微注射仪 |
| 手动显微操作器 | World Precision Instruments | KITE-L | 左手KITE操作器 |
| 磁力架 | World Precision Instruments | M9 | 持握显微操作仪 |
| 带臂式支架的精密体视变倍双目显微镜 | World Precision Instruments | PZMIII-BS | 用于显微注射的解剖镜 |
| 1.5倍物镜 | World Precision Instruments | 501377 | 显微镜物镜 |
| LED环形灯 | 世界精密仪器公司 | 504134 | 注射显微镜用环形光源 |
| 实验室冷藏台 | BioQuip Products | 1431 | 微注射用冷却台 |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-1 | 用于注射过程中昆虫的分期处理 |
| 罗丹明 B，98%以上 | Acros Organics | AC296571000 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 蚊子产卵生物测定 | |||
| 大号培养皿 | Fisher Scientific | FB0875714 | 用于固定和放置载玻片 |
| 塑料杯 - 3.5 盎司 | Dart Container Corporation | TK35 | 蚊子产卵生物测定杯 |
| 哑光塔夫绸面料 | Joanne Fabrics | 1103068 | 用于产卵生物测定的盖子 |
| 血液来源 | 本地获得的 | 通常为牛或活鸡 | |
| 1 根 30 毫米透明可食用胶原蛋白套管 | 巴彻与帕克 | 30D02-05 | |
| 重载种子发芽纸 | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| 带有HEPA过滤器的口吸器 | John W. Hock Company | 612 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 家蝇产卵生物测定 | |||
| 4 L 塑料食品储存罐 | 沃尔玛 | 555115143 | |
| 10英寸长筒袜套 | Medonthego.com | FS15001H | |
| 小麦麸皮 | 本地获得的 | 通常可在饲料店找到 | |
| Calf Manna 性能补充剂 | ValleyVetSupply.com | 16731 | 颗粒状牲畜饲料 |
| 干燥的蛋黄 | BulkFoods.com | 40506 | |
| 黑色棉布 | 本地获得的 | 通常在手工材料区 | |
| 60 mL 杯 | Dart Container Corporation | P200-N |
参考文献
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重印与许可
