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方法文章

用于肿瘤靶向免疫调节的副粘病毒：体外设计与评估

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DOI：

10.3791/58651

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2019年1月7日

 , 
1Department of Translational Oncology, German Cancer Research Center (DKFZ) and National Center for Tumor Diseases (NCT), 2Faculty of Biosciences, Heidelberg University, 3Department of Medical Oncology, NCT and Heidelberg University Hospital

本文内容

摘要

本方案详细描述了用于表达免疫调节剂的溶瘤病毒的生成及其体外表征的工作流程，以编码双特异性T细胞衔接器的麻疹病毒为例。该方法可应用于其他载体平台和转基因，从而加速新型免疫病毒治疗药物的临床转化开发。

摘要

成功的癌症免疫治疗有望实现对肿瘤的长期控制。尽管近期在临床上取得了一些成功，但仍迫切需要针对个体肿瘤免疫特征而定制的安全且有效的治疗方法。溶瘤病毒能够诱导抗肿瘤免疫反应，并实现肿瘤特异性基因表达。本实验方案描述了免疫调节型溶瘤病毒载体的构建及其体外分析方法。以编码双特异性T细胞衔接分子的麻疹疫苗病毒为例，该通用技术流程可适用于其他病毒种类及外源基因。所介绍的工作流程包括重组病毒的设计、克隆、拯救和扩增。同时包含用于分析载体复制动力学、裂解活性以及分离出的免疫调节分子在体外功能性的检测方法，从而有助于新型治疗剂的开发，并推动其在临床前模型中的进一步研究及最终的临床转化。

引言

溶瘤病毒（OVs）正在被开发为一种抗癌治疗药物，能够特异性地在肿瘤细胞内复制并将其杀死，同时保持正常组织完整。目前普遍认为，溶瘤病毒治疗（OVT）在大多数情况下并不完全依赖病毒高效复制和扩散所导致的彻底肿瘤溶解来实现疗效，而是需要其他作用机制共同参与才能取得治疗成功，包括对血管和基质的靶向作用，尤其是对免疫系统的激活1,2,3,4。尽管许多早期的OV研究使用的是 未经修饰的病毒，当前的研究已受益于对病毒生物学更深入的理解、可能含有新型溶瘤病毒的病毒资源库，以及基因工程技术所提供的可能性，从而构建出更先进的溶瘤病毒平台5,6,7。

鉴于免疫疗法的近期成功，免疫调节性转基因在溶瘤病毒的基因工程中备受关注. 通过溶瘤病毒（OV）感染的肿瘤细胞靶向表达此类基因产物，相较于全身给药可降低毒性。靶向性可通过使用具有内在肿瘤选择性的病毒，或通过改造病毒的嗜性来实现。8局部免疫调节可增强溶瘤病毒治疗（OVT）的多层面抗肿瘤机制。此外，该策略有助于深入探究病毒、肿瘤细胞与宿主免疫系统之间的相互作用。为此，本实验方案提供了一套可行且可调整的工作流程，用于设计、克隆、拯救、扩增及验证携带特定外源基因的溶瘤副黏病毒（特别是麻疹病毒）载体。

通过多种转基因产物可实现对免疫反应的调控，这些产物靶向癌症-免疫循环9的不同环节，包括增强肿瘤抗原识别［例如肿瘤相关抗原（TAAs）或主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的诱导剂］，促进树突状细胞成熟以实现有效的抗原呈递（细胞因子）；募集并激活特定免疫细胞，如细胞毒性T细胞和辅助性T细胞［趋化因子、双特异性T细胞衔接分子（BTEs）］；靶向抑制性细胞，如调节性T细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和癌症相关成纤维细胞（抗体、BTEs、细胞因子）；以及防止效应细胞的抑制和耗竭（检查点抑制剂）。因此，已有大量生物制剂可供选择。为提升 癌症治疗效果，有必要评估此类病毒编码的免疫调节剂的治疗功效及潜在协同作用，并深入理解其相应的作用机制。

副黏病毒科（Paramyxoviridae）的负链单股RNA病毒具有多个有利于其作为溶瘤载体使用的特征，包括天然的嗜瘤性、可容纳较大外源基因的基因组容量（超过5 kb）10,11、高效的扩散能力（包括合胞体形成）以及强免疫原性12。因此，已开发出基于犬瘟热病毒13、腮腺炎病毒14、新城疫病毒15、仙台病毒16,17、猴病毒5型18和树鼩副黏病毒19的溶瘤病毒（OV）平台。其中，减毒活麻疹病毒疫苗株（MV）在临床前和临床研究中进展最为显著20,21。这些病毒株已被用于常规免疫接种数十年，具有极佳的安全记录22。此外，由于副黏病毒在细胞质中严格复制，不存在插入突变的风险。目前已建立基于反向基因组cDNA的多功能反向遗传学系统，可将外源基因插入额外的转录单元（ATUs）11,23,24。编码钠碘同向转运体（MV-NIS）用于成像和放射治疗，或编码可溶性癌胚抗原（MV-CEA）作为病毒基因表达替代标志物的MV载体，目前正在多项临床试验中进行评估（NCT02962167、NCT02068794、NCT02192775、NCT01846091、NCT02364713、NCT00450814、NCT02700230、NCT03456908、NCT00408590 和 NCT00408590）。既往研究已证实其安全性，并报道了抗肿瘤疗效的案例25,26,27,28,29,30（由Msaouel等综述31），为更多新型溶瘤麻疹病毒的临床前研发与测试奠定了基础。编码靶向癌症-免疫循环不同环节免疫调节分子的MV在小鼠模型中显示出延缓肿瘤生长和/或延长生存期的效果，并在同源小鼠模型中证实其疗效依赖于免疫机制，且可诱导长期保护性免疫记忆。载体编码的外源基因包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）32,33、H. pylori中性粒细胞活化蛋白34、免疫检查点抑制剂35、白细胞介素-12（IL-12）36、肿瘤相关抗原（TAAs）37以及双特异性T细胞衔接分子（BTEs）38，后者可将肿瘤表面抗原与CD3交联，从而不依赖T细胞受体特异性和共刺激信号，激活多克隆T细胞产生抗肿瘤效应（图1）。这些构建体所获得的令人鼓舞的临床前结果，亟需进一步的转化研究推进。

Talimogene laherparepvec（T-VEC）是一种编码GM-CSF的I型单纯疱疹病毒，是目前唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准的溶瘤治疗药物。2015年底获批所依据的III期研究不仅证明了其在肿瘤内注射部位的疗效，而且还 晚期黑色素瘤中的远隔效应（即未注射部位病灶的缓解）39。T-VEC 随后进入了针对其他肿瘤类型的更多临床试验（例如, 非黑色素瘤皮肤癌，NCT03458117；胰腺癌，NCT03086642）以及联合疗法的评估，尤其是与免疫检查点抑制剂联用（NCT02978625、NCT03256344、NCT02509507、NCT02263508、NCT02965716、NCT02626000、NCT03069378、NCT01740297，以及Ribas e等。40).

这不仅展示了溶瘤免疫治疗的潜力，也凸显了进一步研究以确定溶瘤病毒治疗（OVT）与免疫调节更优组合的必要性。合理设计新型病毒载体并推动其进入临床前测试，是实现这一目标的关键。这还将加深对潜在作用机制的理解，并对推进个体化癌症治疗具有重要意义。为此，本文介绍了副黏病毒的改造与开发方法，用于靶向性癌症免疫治疗，特别是编码T细胞结合抗体的溶瘤麻疹病毒的构建方法（图2）。

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方案

注意：[O]、[P] 和 [M] 分别表示适用于以下情况的子章节：一般性溶瘤病毒（OVs）、（大多数）副黏病毒科病毒或仅麻疹病毒（MV）。[B] 表示针对 BTE 转基因的特定章节。

1 将编码免疫调节因子的转基因克隆至麻疹病毒载体

  1. [O] 设计插入序列。
    1. [O] 根据文献研究或遗传筛选等探索性数据，确定感兴趣的免疫调节剂41 并从适当的数据库（如 GenBank、欧洲核苷酸数据库（European Nucleotide Archive）或国际免疫遗传学信息系统（IMGT））中获取相应的 cDNA 序列。
    2. [O] 在转基因序列中添加额外的特征图3。前面的Kozak序列以及物种特异性的密码子优化可增强表达。分泌需要信号序列。应包含编码N端和/或C端蛋白标签的序列，用于检测与纯化42包含用于插入载体的限制性酶切位点。
      注意： [M] 表达外源基因的重组麻疹病毒（MV）基因组需要含有MV聚合酶基因起始和终止信号的附加转录单元（ATUs）。此前已开发出由CMV启动子调控、包含具有独特限制性酶切位点的ATUs、可用于在特定位点插入正义链外源基因的合适反基因组cDNA载体。11[P] 转基因的适当定位至关重要，因为它会影响副粘病毒典型的表达梯度，从而影响病毒复制和转基因表达43. 介绍将ATU插入反基因组3'端附近的区域（即., 在引导位置或其下游 P 基因）通常会导致外源基因高水平表达，但会降低病毒复制能力。当将ATU置于下游时，可预期病毒复制能力增强，而外源基因表达水平降低 H 基因。包括麻疹病毒在内的多种副黏病毒基因组的包装需要每个核衣壳蛋白结合六个核苷酸44对于将外源基因插入此类病毒，应确保完整基因组的核苷酸数目可被6整除。此原则也称为“六的规则”。45,46如有必要，可在插入片段中添加额外的核苷酸（位于Kozak序列上游或终止密码子下游），但不得引入移码或提前出现的终止密码子。[M] 应避免在转基因序列中出现与麻疹病毒（MV）基因起始信号（AGGRNCMARGW）、终止信号（RTTAWANAAAA）以及RNA编辑序列（AAAAAGGG）相似的特定序列。此类共识序列已有文献报道（例如，参见Parks等人的研究）。47).
    3. [O] 购买所需序列的寡核苷酸，或使用标准分子克隆技术从现有序列组装48.
      注意： [O] 为扩增转基因序列，设计一条正向引物，包含上游限制性酶切位点及插入片段的前15-20个核苷酸；设计一条反向引物，包含插入片段的最后15-20个核苷酸及紧随其后的下游限制性酶切位点。
  2. [O] 将克隆插入物连接至编码病毒（反）基因组的 DNA 中。
    1. [O] 利用标准分子克隆技术将插入片段克隆至DNA载体或RNA病毒的DNA反向基因组中48 即, 酶切后进行DNA连接
      1. [O] 使用不相容的限制性酶切位点或在连接前进行去磷酸化处理，以防止载体重新连接。
      2. [O] 通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，并使用市售试剂盒进行后续凝胶纯化。通常，插入片段与载体的摩尔比为3:1时，可获得最佳连接效率。
    2. [O] 将连接产物转化至适用于高效回收大质粒的感受态细菌中（例如, 进行热激处理 E. coli49并通过菌落PCR鉴定含有正确DNA的细菌克隆50.
    3. [O] 使用市售DNA提取试剂盒从单个细菌克隆中分离扩增的DNA。使用适当的限制性内切酶（如, 通过测序验证转座基因插入的正确性和完整性 [M]。
      注意： [M] 对于插入 MV 的转基因 H-ATU，使用以下引物进行Sanger测序：H-9018 [正向引物，结合麻疹病毒基因组第9018位点的序列] H 开放阅读框（ORF）：5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'；L-9249+（反向引物，结合于MV基因组第9249位点） L ORF）：5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'

2. 编码免疫调节因子的重组麻疹病毒颗粒的拯救

  1. [O] 从（反）基因组DNA生成重组病毒颗粒 通过 根据相应病毒的标准操作流程转染病毒生产细胞。遵循无菌操作规范，在生物安全柜中进行细胞培养，特别是所有涉及病毒的操作均应在II级生物安全柜中完成。
    1. [ M ] 从cDNA拯救麻疹病毒23,24，将MV生产细胞（非洲绿猴肾源性Vero细胞）均匀接种于6孔板中，转染前24 h进行铺板。每孔接种2 × 10⁶个细胞5 每孔加入2 mL含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），使转染时细胞融合度达到65–75%。
      注意： [P] 若细胞在病毒诱导合胞体形成前过度生长，则减少细胞数量。
    2. [P] 使用编码病毒反向基因组的DNA、所需的辅助质粒，以及（如需要）编码荧光报告蛋白的质粒转染细胞，以评估转染效率。
      1. [M] 在总体积为 200 µL 的 DMEM 中，混合 5 µg 编码麻疹病毒抗基因组的重组 DNA、各 500 ng 编码麻疹病毒 N 蛋白和 L 蛋白的哺乳动物表达质粒，以及各 100 ng 编码 P 蛋白和荧光报告基因的质粒。
      2. 加入18.6 µL脂质体转染试剂，立即轻弹管壁混匀，室温（RT）孵育25分钟。
      3. [P] 每孔加入1.8 mL DMEM、2% FBS、50 µg/mL 卡那霉素（或其他防止污染的抗生素），替换原有培养基，然后将转染混合物逐滴加入孔中，轻轻摇动混匀。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜2第二天更换为 2 mL 新鲜的 DMEM 培养基，含 2% FBS 和 50 µg/mL 卡那霉素；当培养基变酸时重复更换。
        注意： [O] 根据生物安全规定操作细胞和材料，因为从转染开始至后续步骤可能含有病毒。妥善处理（可能具有感染性的）废弃物。
  2. [P] 收集并扩增病毒颗粒。
    1. [P] 每日通过显微镜观察细胞的报告基因表达及合胞体形成情况（图4）。当出现由20个或更多细胞组成的大片合胞体，或细胞密度过高时，收获病毒（即., 当它们开始形成多层生长时（通常在7–9天后）。
      注意： [P] 如果特定载体构建体未观察到合胞体形成，并不一定意味着拯救失败。由于样品中仍可能存在具有感染性的病毒，可将其转移至新鲜的生产细胞进行传代。
    2. [P] 接种约 1.5 x 106 在预期收获前24小时，将生产细胞以含10% FBS的12 mL DMEM培养基于10 cm培养皿中培养，或2.5 x 106 每孔细胞在传代病毒前4–6小时接种，以确保病毒接种时细胞融合度达到65–75%。
    3. [P] 收集病毒子代时，使用细胞刮轻轻刮下贴壁的病毒生产细胞，并将含有细胞的上清液转移至离心管中。在2,500 x g条件下离心5分钟，以去除细胞碎片。 g 和 4 °C。
      注意： 刮取的细胞可直接转移，无需离心，以最大程度保留病毒，但会牺牲培养条件的最优化，并可能导致显微观察出现假象。
      警告：[O] 刮取细胞时避免培养基溢出，尽量减少气溶胶的产生。
    4. [P] 将步骤2.2.3中获得的无细胞上清液与无血清培养基混合，制备接种物，终体积为4 mL。用该接种物替换生产细胞的培养基，并在37 °C和5% CO₂条件下孵育细胞至少2 h。2加入6 mL含10% FBS的DMEM，过夜培养细胞，随后更换为12 mL新鲜的含10% FBS的DMEM。
    5. [P] 每天至少观察细胞两次，并在合胞体破裂前收获病毒（即, 当膜破裂现象可见时，收集第一代病毒：移除培养板中的上清液，加入600 µL无血清培养基，用细胞刮刮取细胞，并转移至洁净离心管中。
      注意： [ M ] 根据病毒株的不同51,52 为促进病毒感染的进展，将感染细胞的培养板转移至32 °C，以利于病毒复制与扩散。通常情况下，MV Schwarz株在37 °C下增殖良好，而将感染Edmonston B株病毒的细胞转移至32 °C时，虽可导致合胞体形成减缓，但病毒滴度更高。
      注意： [P] 收获过程中切勿让细胞层干燥，否则会导致病毒颗粒的感染性降低。尽管弃去感染细胞的上清液时会损失部分病毒，但从细胞层中可获得更高的病毒滴度。
    6. [P] 立即用液氮速冻病毒悬液，于 -80 °C 保存至少 24 小时以确保完全冻结。如需中断实验流程，可延长至数天。
    7. 在37 °C下解冻以释放病毒颗粒。通过涡旋振荡使其均匀，并在2,500 x g条件下离心5分钟 g 以及 4 °C。将上清液转移至带标签的冻存管中，并于 -80 °C 保存。
      注意： [O] 将病毒分装成适合后续实验的体积保存，因其最好仅冻融一次，并立即使用。[P] 额外的冻融循环或在4 °C下储存数天会导致病毒滴度显著降低。
    8. [P] 为获得所需的数量和滴度，在进一步传代前一天，接种 4 x 106 在15 cm培养皿中，将生产细胞置于12 mL含10% FBS的DMEM中。以0.03的感染复数（MOI）接种病毒。每块培养皿使用8 mL无血清培养基进行感染，细胞孵育至少2 h后，更换为含10% FBS的DMEM。通过使用多块培养皿进行扩增。
    9. 按照步骤2.2.5所述收获，当合胞体已扩散至整个细胞层时。将获得的悬液汇集至50 mL离心管中，并按步骤2.2.6–2.2.7所述进行处理。
      注意： [O] 收获前必须对所有培养皿进行肉眼检查，以确认是否存在细菌和真菌污染。通常情况下，应定期采用多重PCR方法对所有细胞系进行支原体和外源病毒污染的检测。
  3. [P] 测定病毒滴度。 使用96孔板，每份病毒储存液进行八重复测定以确定病毒滴度。每次病毒拯救实验对三份独立的等分试样进行滴定，并取平均值来计算实验中所用病毒悬液的用量。
    1. [P] 收集生产细胞，计数并调整至 1.5 x 105 每毫升含细胞数，在含10% FBS的DMEM中。
    2. 用移液器将90 µL含10% FBS的DMEM加入96孔板的每个孔中。
    3. [P] 从病毒储备液的一个等分试样中取10 µL加入到平板第一列的全部8个孔中，并通过上下吹打至少10次充分混匀。
    4. [P] 对病毒进行10倍系列稀释。使用多通道移液器将第一列各孔中的10 µL液体转移至第二列。通过反复吹打充分混匀，每次稀释步骤均使用新的移液器吸头。从最后一列各孔中弃去10 µL液体。
      注意： 每个96孔板可进行12个连续稀释步骤。[M] 对于MV载体，通常进行8个10倍稀释步骤即可，因为滴度高于1 x 109 每毫升细胞感染单位（ciu）通常难以通过第2.2步所述的增殖方法获得。[P] 无病毒的对照孔可用于比较并监测污染情况。
    5. [P] 每孔加入100 µL细胞悬液，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 培养48小时。确保细胞悬液中无细胞团块，以实现细胞的均匀分布。
    6. [P] 使用光学显微镜检查合胞体。在显示可见合胞体的最高稀释倍数的列中，计数每孔的合胞体数量。
    7. [P] 将该列中合胞体总数除以8，计算每孔的平均合胞体数。将该平均值乘以相应列的稀释倍数，起始稀释倍数为102 每毫升含 ciu，第一列53 （参见 图5 （作为示例）。

3. 确定编码免疫调节因子的病毒载体的复制能力和细胞毒性

  1. [O] 通过单步或多步生长曲线（GCs）比较所获得的重组病毒与未修饰载体的复制动力学。对于单步生长曲线，通过同时感染所有细胞（理论上为100%感染）后评估病毒子代产量。多步生长曲线则从较低比例的感染细胞开始，以追踪多轮病毒复制过程。
    1. [M] 为分析麻疹病毒复制动力学，接种 1 x 105 感染前一天，在12孔板中每孔加入含10% FBS的DMEM培养基1 mL，接种Vero细胞。每个关注的时间点至少设置两孔作为技术重复。
    2. [O] 以低感染复数（MOI）进行多步生长曲线实验，或以高MOI进行单步生长曲线实验 [M]（在Vero细胞上进行麻疹病毒复制时分别为0.03和3）。更换为含有相应病毒量的300 µL无血清培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 至少 2 小时后，移除接种物，加入 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM，继续培养。
    3. 在感染后12、24、36、48、72和96小时等相应时间点，通过将细胞直接刮入培养基中收集病毒子代。将每孔内容物转移至单独的离心管中，液氮速冻后于-80 °C保存，直至进行滴度测定。
      注意： 在此步骤中，可将重复样品合并，用于分析平均滴度。
    4. [P] 收集所有时间点的样品，在37 °C下同时解冻以检测病毒子代。涡旋振荡后，于2,500 x g离心5分钟，沉淀细胞碎片。 g 和 4 °C。
    5. [P] 按照上述方法计算每个构建体和时间点的平均滴度，绘制滴度随时间变化的曲线。比较含有与不含插入外源基因的载体、含有不同外源基因的载体，或外源基因插入位置不同的载体的生长曲线（参见 图6A).
  2. [O] 比较编码免疫调节因子的病毒与未修饰病毒的裂解活性。
    1. [O] 可选择的实验方法包括阻抗检测、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验，或基于代谢的比色法细胞活力检测 [例如, 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）和2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四氮唑-5-羧基苯胺（XTT）检测
      1. [M] 使用XTT法分析麻疹病毒载体的细胞毒性时，按照步骤3.1.1所述接种Vero细胞，并为每个时间点设置未感染对照组的重复样本。
        注意： 在同一样本上于不同时间点进行XTT实验可减少技术误差，但反复洗涤及暴露于XTT试剂会影响活细胞数量。阻抗检测可作为连续测量的替代读数方法。
    2. [M] 按照步骤 3.1.2 所述，以 MOI 为 1 感染 Vero 细胞。
      注意： 对于某些较难感染的靶细胞（如一些小鼠肿瘤细胞系），可能需要使用较高的感染复数（MOI），例如 3 或 5。
    3. [O] 在关注的时间点（例如., 感染后12、24、36、48、72和96 h，制备所需量的XTT试剂（即.，每孔300 µL，另加10%过量）。避免光照。
    4. [M] 每个时间点，移除各孔中的培养基，加入 300 µL XTT 试剂，于 37 °C 避光孵育。当对照孔中的试剂变为深红色时（通常需要 15 分钟至 2 小时），收集上清液，并于 -20 °C 冻存。
      注意： [O] 孵育时间取决于病毒载体、细胞类型、密度和细胞病变效应。
    5. [O] 收集所有样本后，同时解冻。将每份样本各100 µL转移至96孔板中，以630 nm为参比波长，在450 nm处测定光吸收值。
    6. [O] 绘制时间点（x轴）与. 样品相对于对照组的光吸收值，反映代谢活性，以此作为细胞活力的替代指标（y轴）。随时间推移，相对吸光度下降表明病毒具有细胞毒性（参见 图6B).

4. 分析感染细胞分泌的病毒编码免疫调节因子的活性

  1. [O] 分离分泌的转基因产物 由病毒感染的靶细胞表达。
    1. [P] 在T175培养瓶中将病毒生产细胞培养至70%汇合度。
    2. [P] 吸去细胞培养基，用 12 mL PBS 洗涤两次以去除血清。在 12 mL 无血清培养基中以 MOI 为 0.03 接种病毒，于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育2 过夜。弃去原培养基，更换为12 mL新鲜无血清培养基。
      1. [M] 对于Edmonston B病毒，在37 °C培养40小时后，将细胞转移至32 °C继续孵育24小时，以促进感染并防止合胞体过早破裂。具体操作取决于病毒株51,52 合胞体形成及进展过程中，可调整孵育温度和时间以获得最佳的蛋白产量和纯度。
    3. [P] 在合胞体破裂前小心收集上清液，避免细胞脱落。最佳情况下，合胞体已扩散至整个细胞层。将上清液汇集至50 mL离心管中。
      注意： 为高效纯化转基因产物，在收获感染细胞的上清液时，应避免合胞体破裂，并尽量减少细胞碎片。
    4. [P] 通过在 2,500 x 下离心 5 分钟，从上清液中去除细胞碎片 g 4 °C 条件下，并通过 0.22 µm 滤器过滤。根据滤液体积的多少，可使用注射器或真空泵完成此步骤。
    5. [O] 采用适当的纯化方法分离转基因产物。使用 Ni-NTA 离心柱通过亲和层析纯化带有六聚组氨酸（His）标签的蛋白质38 如这里简要所述（步骤 4.1.5.1–4.1.5.4）。
      注意： [O] 所有步骤均需快速并在冰上操作。缓冲液需预先冷却，离心机预冷至 4 °C。
      1. [O] 分别配制含 PBS、200 mM 氯化钠以及终浓度为 10 mM（洗涤缓冲液 1，WB1）、20 mM（洗涤缓冲液 2，WB2）和 500 mM（洗脱缓冲液，EB）咪唑的缓冲液各 100 mL。将 WB1 和 WB2 的 pH 调至 8.0，EB 的 pH 调至 7.0。根据待纯化蛋白的不同，可能需要调整咪唑的浓度。
      2. [O] 用 600 µL WB1 平衡柱子，并在 800 x g 条件下离心 g 开盖孵育2分钟。
      3. [O] 将600 µL过滤后的上清液上样至柱中。通过200 x g离心使His标签蛋白与柱基质结合。 g 盖上盖子孵育5分钟。每根层析柱最多可累计上样并结合300 µg的His标签蛋白。
      4. [O] 用 WB1 洗涤三次，再用 WB2 洗涤一次，或直至流出液无色。加入 600 µL 缓冲液，以 800 x g 开盖孵育2分钟。
      5. [O] 用 300 µL EB 缓冲液进行两次洗脱，并在 800 × g 下离心 2 分钟，将蛋白质洗脱至新的离心管中 g.
      6. [O] 根据产物大小，使用离心滤膜进行脱盐并浓缩产物。加入 PBS 至 15 mL 体积后过滤 通过 4,000 × g 条件下离心 10 分钟 g重复操作直至达到所需纯度和浓度。为提高蛋白质浓度，可在4,000 × g条件下离心40分钟，将终体积减少至约200 µL。 g.
  2. [O] 确认产物的纯度和身份。
    1. [O] 使用标准比色法（如二辛可宁酸法（BCA）或Bradford法）测定分离物中的总蛋白含量54,55[M] 感染细胞上清液中每毫升可产生1–3 µg的转基因产物，此为典型值。
    2. [O] 对于蛋白质分离物的相对定量，应分别进行 通过 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）并进行考马斯亮蓝染色56.
    3. [O] 使用针对目标蛋白或其相关肽标签的特异性抗体，通过免疫印迹法确认纯化产物的身份57.
    4. [O] 使用适当技术分析蛋白质结合特异性，可能包括酶联免疫吸附测定（ELISA）或流式细胞术（参见 图7）。可使用近期报道的磁珠下拉实验来确认细胞结合。38.
      注意： [O] 使用适当的对照。在细胞结合实验中，应包括不表达靶分子的细胞作为阴性对照（如 图9）以及非靶向蛋白质替代物（图8）。在流式细胞术实验中，应包括阳性对照、阴性对照和同型对照（图7).
      1. [O] 将靶细胞与蛋白质分离物共同孵育以允许结合。[B] 用于分析BTEs与自人血中分离的外周血单个核细胞（PBMCs）的结合情况58，孵育 2.5 × 106 在冰上用含有1% FBS的PBS（100 µL，含200 ng BTE）孵育细胞1小时（结合缓冲液，BB）。
      2. [B] 用1 mL BB洗涤细胞，以去除未结合的蛋白。在300 x g下离心 g 5分钟，弃上清，将沉淀重悬于100 µL BB缓冲液中。加入针对目标蛋白或相关肽标签的生物素化抗体，冰上孵育30分钟。对于带有流感血凝素（HA）标签的BTEs，使用100 ng抗-HA-生物素抗体（克隆株3F10）。
      3. [B] 用 1 mL BB 缓冲液洗涤细胞两次，重悬于 80 µL BB 缓冲液中。加入 20 µL 链霉亲和素偶联磁珠，4 °C 孵育 15 分钟。
      4. [B] 洗涤一次以去除多余的磁珠，将沉淀重悬于500 µL含有2 mM EDTA的BB缓冲液（洗脱柱缓冲液，CB）中。
      5. [B] 根据试剂盒说明书，使用层析柱和磁力架分离细胞。
        1. [B] 通过重力流使500 µL CB流经层析柱，以达到平衡。
          注意： [B] 柱子绝不能流干。移液时需小心操作，并对缓冲液进行脱气处理，以避免产生气泡。
        2. [B] 将一根洁净的离心管置于柱下，加入细胞/珠子悬液至柱中。每次用500 µL CB缓冲液洗涤柱，共洗涤三次。收集悬液及至少第一次洗涤步骤的穿流液至离心管中，随后置于冰上保存。
        3. [B] 洗脱被磁场滞留于磁珠上的细胞。将柱子从磁力架上取下，置于一支洁净离心管上，加入1 mL CB缓冲液，用推杆迅速将缓冲液推过柱子并收集至管中。将收集的样品置于冰上保存。
      6. [B] 将含有流穿液和洗脱液样本的离心管在16,000 x g条件下离心20分钟 g 4 °C 离心收集细胞。弃上清，用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（建议使用 75 µL）裂解细胞。进行 SDS-PAGE56.
      7. [B] 使用合适的特异性一抗进行免疫印迹。一抗可靶向转基因产物或细胞蛋白（例如., β-actin 图8) 以评估 BTE 细胞的结合能力。
  3. [O] 评估分离的免疫调节剂的免疫学功能。
    1. [O] 根据编码的免疫调节因子的特性确定相关检测方法。针对预期的免疫调节活性，可采用评估细胞增殖、迁移、成熟、活化或细胞毒性的方法。
      注意： [O] 细胞增殖可通过CFSE进行分析59 标记或Ki67染色60Transwell 或划痕实验可用于分析细胞迁移61细胞成熟与活化状态可通过针对相应标志物的适当染色方案进行评估。[B] 用于评估BTE介导的细胞毒性的现有技术包括阻抗测量法和铬释放实验。若选择铬释放实验，操作放射性物质时应遵守适当的安全防护措施。
    2. [B] 作为一种非放射性替代方法，以下将详细描述如何通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验（此前已简要介绍）评估BTE诱导的细胞介导的细胞毒性38).
      1. [B] 确定实验中需要测试的条件（参见 图9 以示例）。时间点（数小时至数天）、免疫调节剂浓度（pg/mL 至 µg/mL）以及效应细胞与靶细胞比例（E:T 比例，例如 1:50 至 50:1）均可调整。所有样品均应设置三个重复。
      2. [B] 包含不含蛋白质和不含效应细胞的样本，作为单个细胞类型自发性LDH释放的对照（Tsp 和 Esp），靶细胞最大裂解对照（T最大值加入去垢剂后读数，仅培养基对照，以及T的体积对照最大.
        注意： [B] 目标细胞所需数量及孵育时间可能有所不同。在不含效应细胞和免疫调节剂的条件下进行初步测试，以确定最佳参数。包括Tsp 和 T最大值 样本及相应的对照组，用于评估不同的细胞数量和时间点。
      3. [B] 分离免疫效应细胞（例如，通过人血液的密度梯度离心获取外周血单个核细胞）58 从小鼠脾细胞中进行小鼠T细胞的阳性或阴性筛选62).
      4. [B] 根据步骤4.3.2接种靶细胞（例如, 每孔 5 × 10³ 个细胞，接种于 U 型底 96 孔板中。
      5. [B] 将分离的蛋白质以所需浓度加入相应的样品中，以所需比例加入免疫效应细胞，再加入培养基至每孔总体积为100 µL。
      6. [B] 在步骤4.3.2中确定的时间范围内孵育，通常为4至48小时（未刺激的PBMCs孵育24小时，新分离的小鼠T细胞孵育48小时；预刺激的免疫细胞可采用较短的孵育时间），条件为37 °C、5% CO₂。2.
      7. [B] 在收集样品前45分钟，向含有T的孔中加入10 µL 10x裂解液最大 样品及相应的培养基对照。继续孵育。
      8. [B] 以 250 x g 离心细胞 g 孵育4分钟。将每份上清液50 µL转移至平底96孔板中。避免转移细胞，以防带入细胞结合的乳酸脱氢酶（LDH）。
      9. [B] 按照生产商说明配制底物溶液。每孔加入 50 µL，室温避光孵育 30 分钟，或孵育至 T最大值 样品变为深红色。
      10. [B] 每孔加入 50 µL 终止液。以 4,000 × g 离心 1 分钟以去除气泡。 g，并使用空心针手动操作。在490 nm处测定光吸收度。
      11. [B] 计算每个样本的特异性裂解百分比值。
        1. [B] 计算含裂解液与不含裂解液的培养基对照组重复样本的平均值。将实验样本和T的数值减去上述所得值。最大值 以及自发释放对照。将这些经背景校正的值用于后续计算。
        2. [B] 计算经背景校正的 T 的平均值最大值，Tsp，以及 Esp 对照组。利用这些平均值，可通过以下公式计算每个样本的特异性裂解百分比：

          Calculation formula for percent specific lysis in cell assay; shown as equation.
        3. [B] 绘制特异性裂解百分比值 与 蛋白浓度或效靶比，并与非靶向对照样本进行比较。

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结果

图1 展示了编码双特异性T细胞衔接分子的溶瘤麻疹病毒的作用机制。本实验方案的工作流程图见图2。 图3 显示了一个修饰后的溶瘤麻疹病毒基因组示例，直观呈现了对麻疹病毒反向基因组所做的特定修改以及插入的转基因的特定特征。图4 展示了典型的麻疹病毒诱导的合胞体。请注意，在收获病毒拯救物的时间点具有较高的细胞密度（A，B），表明在重复实验时可适当减少细胞数量。可在Vero细胞传代过程中优化孵育温度和时间（C，D），以促进合胞体在培养板上的扩散。图5 显示了一次典型的滴定实验结果。图6 展示了接种未修饰麻疹病毒（MV）和编码BTE的溶瘤麻疹病毒（MV-H-mCD3xhCD20）后的单步生长曲线（...

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讨论

溶瘤免疫疗法（即., 联合免疫调节的溶瘤病毒治疗（OVT）在癌症治疗中具有广阔前景，亟需进一步开发和优化编码免疫调节蛋白的溶瘤病毒。本方案描述了构建和验证此类载体的方法，以用于后续相关临床前模型中的测试，并为未来转化为新型抗癌治疗手段奠定基础。

多种具有不同优势的溶瘤病毒平台可供选择63除了肿瘤特异性、载体安全性、生产要求、裂解肿瘤细胞的效力以及诱导免疫应答的能力外，克隆容量也是利用特定溶瘤病毒实现免疫调节剂有效递送的关键因素。目前尚缺乏对不同溶瘤病毒的直接比较，而开展此类比较有助于为个体患者确定最佳治疗方案。通过推动新型携带转基因载体的合理设计与测试，可促进这一目标的实现，麻疹病毒-BTE（MV-BTE）即为本文示例。鉴于麻疹病毒（MV）所具备的有利特性（即, 肿瘤趋向性、安全性、融合性、免疫原性、基因修饰的可行性）本方案聚焦于该溶瘤病毒载体，但可推广至其他溶瘤病毒（OV），尤其是副黏病毒科病毒。

为了合理选择潜在相关的免疫调节剂作为候选转基...

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披露

C.E. Engeland 被列为海德堡大学拥有的关于用于癌症免疫病毒治疗的RNA病毒的一项专利的共同发明人。J.P.W. Heidbuechel 无任何利益冲突需要披露。

致谢

这些方法由教授博士领导的病毒治疗研究组建立 博士 感谢海德堡国家肿瘤疾病中心的Guy Ungerechts。我们向他以及实验室团队的所有成员致以诚挚谢意，特别是Tobias Speck博士、Rūta Veinalde博士、Judith Förster、Birgit Hoyler和Jessica Albert。本研究由Else Kröner-Fresenius基金会（资助号：2015_A78，授予C.E. Engeland）和德国国家科学基金会（DFG，资助号：EN 1119/2-1，授予C.E. Engeland）提供支持。J.P.W. Heidbuechel获得海德堡国际癌症研究研究生院的奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
快速DNA去磷酸化 &连接试剂盒罗氏生命科学，德国曼海姆4898117001
CloneJET PCR 克隆试剂盒赛默飞世尔科技，圣莱昂-罗特K1231
琼脂糖Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴A9539-500G
QIAquick 凝胶回收试剂盒QIAGEN，德国希尔登28704
NEB 10-beta 感受态细胞 E. coli德国美因河畔法兰克福新英格兰生物实验室（New England Biolabs, NEB）C3019I
Lennox改良的LB培养基Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄X964.1
氨苄青霉素Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄HP62.1
QIAquick 质粒小提试剂盒QIAGEN，德国希尔登27104
限制性内切酶 HindIII-HF德国美因河畔法兰克福新英格兰生物实验室（New England Biolabs, NEB）R3104S
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Invitrogen，德国达姆施塔特31966-021
胎牛血清（FBS）法国博桑生物塞尔公司FB-1280/500
FugeneHDPromega，曼海姆，德国E2311可替换为任意选择的转染试剂
卡那霉素Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴K0129
Vero 细胞ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯CCL81
B16-CD46 / B16-CD20-CD46J. Heidbuechel，海德堡德国癌症研究中心可根据要求提供
Granta-519德国不伦瑞克，德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）ACC 342
Opti-MEM（无血清培养基）Gibco Life Technologies，德国达姆施塔特31985070
比色法细胞活力检测试剂盒 III（XTT）PromoKine，德国海德堡PK-CA20-300-1000包含 XTT 试剂
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco Life Technologies，德国达姆施塔特14190-094
QIAquick Ni-NTA 离心柱QIAGEN，德国希尔登31014
氯化钠Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄3957.3
咪唑Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄I5513-25G
Amicon Ultra-15，PLGC Ultracel-PL 膜，10 kDa默克，德国达姆施塔特UFC901024
BCA 蛋白检测试剂盒默克密理博71285-3
人血清中的IgGSigma-Aldrich，德国陶夫基兴I4506
抗HA-PEMiltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-092-257RRID: AB_871939
小鼠 IgG1，κ 同种型对照，藻红蛋白偶联，克隆 MOPC-21 抗体BD 生物科学公司，德国海德堡555749RRID: AB_396091
抗HA-生物素抗体，克隆3F10Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴12158167001RRID: AB_390915
抗生物素微珠Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-090-485
MS色谱柱Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-042-201
MiniMACS 分离器Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-042-102
MACS 多功能支架Miltenyi Biotech，德国贝尔吉施格拉德巴赫130-042-303
RIPA缓冲液Rockland Immunochemicals，吉尔伯茨维尔，宾夕法尼亚州，美国MB-030-0050
CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒Promega，曼海姆，德国G1780包含10倍裂解液、底物溶液（底物混合液和检测缓冲液）以及终止液
细胞刮刀康宁，雷诺萨，墨西哥3008
10 cm 培养皿美国纽约州奥嫩塔康宁公司430167
15 cm 培养皿Greiner Bio-One，德国弗里克豪森639160
96孔板，U型底TPP，瑞士特拉辛根92097
96孔板，平底Neolab，德国海德堡353072
6孔板Neolab，德国海德堡353046
12孔板Neolab，德国海德堡353043
50 mL 离心管nerbe plus，德国吕内堡02-572-3001
T175 细胞培养瓶赛默飞世尔科技，圣莱昂-罗特159910
0.22 µm 滤器默克，德国达姆施塔特SLGPM33RS

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