我们描述了使用MPTP建立帕金森病小鼠模型的方法，并通过圆筒实验和开放旷场实验进行行为学评估，以测量运动功能。随后，我们以左旋多巴（L-DOPA）为例，展示如何应用该模型研究帕金森病药物。
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本文内容
摘要
摘要
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种常见的神经退行性疾病，可导致震颤、僵直、运动迟缓和痴呆等症状。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）可通过破坏脑黑质中的多巴胺能神经元，引发类似帕金森病的症状，因此已被广泛用于建立多种动物的帕金森病模型。本实验中，小鼠连续七天接受MPTP注射（20 mg/kg/天），第八天进行行为学测试。该模型在帕金森病研究中具有良好的适用性。所采用的行为学测试包括圆筒实验和旷场实验。圆筒实验用于检测动物被置于新环境时前肢抬起的能力。由于帕金森病模型小鼠常出现弓背现象，其前肢抬起次数会减少。该测试操作简便。旷场实验用于记录小鼠奔跑、行走及静止不动所花费的时间。我们利用软件分析小鼠在旷场中的活动情况并获取数据。最后，我们以左旋多巴（L-DOPA）——一种最常用的帕金森病治疗药物——为例，展示如何利用该模型开展帕金森病药物研究。实验结果表明，MPTP的神经毒性可导致运动功能障碍，而左旋多巴可缓解该症状。
引言
帕金森病（Parkinson's disease, PD）是老年人中最常见的疾病之一，是一种长期的神经退行性疾病1。 患者通常表现出震颤、僵硬、运动迟缓和痴呆等症状，且症状随时间逐渐加重2。此外，还常观察到感觉异常、睡眠障碍和情绪问题等其他症状2。PD 的病因尚不明确，但普遍认为其涉及遗传和环境因素的共同作用，导致黑质中多巴胺能神经元的丧失3，并在大脑多个区域形成路易小体和路易神经突4。
在帕金森病（PD）的研究中，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）5 被广泛用于在实验模型中重现部分PD症状。1984年，Langston et al. 首次发现，在松鼠猴体内注射MPTP可导致帕金森综合征6。尽管MPTP啮齿类动物模型不表现出帕金森病的生物标志物——路易小体，但MPTP可通过破坏大脑黑质中的多巴胺能神经元引发类似帕金森病的症状7。与其他帕金森病药物模型（如由6-羟基多巴胺（6-OHDA）8 或1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）9 诱导的模型）相比，MPTP注射操作简便，且MPTP模型所需时间更短。小鼠每日接受MPTP注射（20–30 mg/kg/天），连续注射七天，行为学测试于第八天进行10。
旷场实验11最初由美国学者Calvin S. Hall提出12。在不同研究中，该实验可检测多种行为。在以帕金森病为研究重点的实验中，通常通过检测动物的运动活动及运动速度，评估其活动能力是否受到影响。与其他用于建立帕金森病动物模型的检测方法相比，旷场实验操作简便，所需设备简单，且可使用原型设计和数据分析软件（例如 MATLAB、Excel）轻松采集和绘制数据。此外，其变异系数相对较小13，表明旷场实验结果具有较高的可靠性。相较于其他方法的另一优势在于，本实验所包含的行为易于区分：小鼠的行为状态通常为奔跑、行走或静止不动。通常情况下，当研究人员需要评估实验动物的运动能力时，可采用旷场实验对啮齿类动物进行检测。
圆筒实验也称为前肢不对称使用实验。该实验最初设计时用于检测大鼠前肢的不对称使用情况14。在此，我们利用该实验分析动物伸展并使用双侧前肢探索新环境的能力。当脑内的黑质和纹状体受到MPTP损伤后，动物倾向于弓背，且较少伸展身体去探索未知环境。该实验操作简便，可提供初步结果。然而，该实验存在较高的个体内变异，因此通常需与其他行为学实验联合使用。
服用左旋多巴（L-DOPA），也称为左旋-3,4-二羟基苯丙氨酸，是治疗帕金森病的常用方法，因为帕金森病（PD）的病因之一是大脑中多巴胺的减少。L-DOPA 是多巴胺的前体物质。与多巴胺不同的是，L-DOPA 能够穿过血脑屏障，这意味着它在提高脑区多巴胺浓度方面更为有效。在穿过血脑屏障后，L-DOPA 由 L-氨基酸脱羧酶转化为多巴胺15。
本文描述了使用圆筒实验14和改良的旷场实验对MPTP诱导的帕金森病（PD）模型小鼠进行运动功能的测量与分析。我们以左旋多巴（L-DOPA）给药为例，展示如何将该模型应用于PD药物的研究。结果表明，MPTP可诱导产生运动功能障碍，而该障碍可被L-DOPA缓解。
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方案
本研究遵循国际、国家和机构关于动物实验的规定进行。研究方案已获得南开大学动物伦理委员会的批准。
1. MPTP 和 L-DOPA 给药
注意：10周龄雌性BALB/c小鼠由中科院动物研究所提供。小鼠每笼饲养6只，光照/黑暗周期为12小时（光照时间为08:00至20:00），环境温度恒定在21–22 °C，相对湿度为55% ± 5%。提供经高压灭菌的相同配方的标准小鼠饲料和饮水 随意 所有动物均接受了处理。
- 经过一周的适应期后，将动物分为三组，每组六只小鼠。
- 对第1组，从第1天到第7天每天进行腹腔注射（见步骤1.5），每只小鼠注射生理盐水250 µL/天，然后在第8天进行经口灌胃（见步骤1.6），每只小鼠给予生理盐水250 µL。
- 对第2组，从第1天到第7天每天进行腹腔注射20 mg/kg/天的MPTP，然后在第8天进行经口灌胃，每只小鼠给予生理盐水250 µL。
- 对第3组，从第1天到第7天每天进行腹腔注射20 mg/kg/天的MPTP，然后在第8天进行经口灌胃，每只小鼠给予L-DOPA 5 mg/kg。
- 腹腔注射操作步骤如下：
- 将药物装入带有26 G针头的无菌1 mL注射器中，排出注射器内的空气。
- 抓握小鼠使其腹部朝上，固定头部，保持小鼠的头、颈和身体呈一条直线。
- 倾斜针头以刺入腹膜，推进针头至适当深度直至阻力变小，然后注入药物，随后平稳拔出针头。
- 经口灌胃操作步骤如下：
- 将药物装入带有灌胃针头的无菌1 mL注射器中，排出注射器内的空气。
- 抓握小鼠使其腹部朝上，固定头部，保持小鼠的头、颈和身体呈一条直线。
- 保持针头与小鼠身体平行，从其口腔角落插入，压住舌头并沿上颌向内推进。
- 当感到阻力较小时，表明针头正顺利进入食道，此时小心推进针头至适当深度，在针尖到达胸部底端之前注入药物。
- 平稳拔出针头。
2. 圆筒实验
注意：行为学测试于第8天进行。在行为学测试前40分钟，向第三组小鼠注射L-DOPA。如果行为学测试不在动物饲养房间内进行，则动物需要在测试前于新房间内适应30-60分钟。
- 在最后一次注射MPTP后24小时进行测试。
- 将一个透明玻璃圆筒（高度 = 19.5 cm，直径 = 15 cm，重量 ≥1 kg）放置在桌子中央。用黑色硬纸板从圆筒的三个侧面围挡，以减少环境光照的影响。留出一侧圆筒面向摄像机，用于视频录制。
注意：硬纸板与圆筒之间的距离应约为4至8 cm。 - 将一台摄像机（> 100万像素分辨率）安装在距离圆筒约40–60 cm的位置，确保整个圆筒均在视野范围内。
注意：此距离既不过近也不过远，以免在录制小鼠运动视频时干扰其行为。 - 每次将一只小鼠放入圆筒中，并立即开始录像，3分钟后停止录像。
注意：在此过程中，应尽量避免噪音或光线变化，以防影响小鼠的行为表现。 - 测试结束后，将小鼠放回其原饲养笼中。
- 用清水清洗圆筒，然后在内壁喷洒70% v/v乙醇进行消毒并去除小鼠气味。在放入下一只小鼠前，将圆筒擦干。
- 以正常速度的0.5倍回放视频，记录每只小鼠前爪触碰筒壁的次数。
注意：当小鼠以后肢直立，双前肢抬高至肩部以上并随后落地时，计为一次前爪抬起。仅单侧前肢抬起不计入。通常小鼠会抬起前肢接触圆筒壁；若小鼠连续多次抬起双前肢高于肩部但未落地，则仅计为一次。
3. 开放旷场实验
- 在MPTP给药后24小时进行旷场实验。
注意：可与圆筒实验同时进行。 - 准备一个透明的旷场反应箱（长45 cm × 宽45 cm × 高25 cm），底部用黑布覆盖木板。在反应箱正上方1 m高度处固定一台相机（>100万像素分辨率）。
注意：旷场反应箱底部的颜色应与测试小鼠的体色不同，以确保视频中具有足够的颜色对比度。 - 调整相机位置，确保旷场反应箱位于视频画面正中央。
- 将一只待测小鼠放入箱内，让其适应环境约1分钟。
- 使用连接至计算机的相机记录5分钟视频。
- 利用软件工具（例如，MATLAB）分析视频，获得小鼠运动轨迹图、静止状态（速度 <1 cm/s）、行走（速度1–20 cm/s）和奔跑（速度 >20 cm/s）的时间分布、总移动距离以及每只测试小鼠的平均速度。
注意：分析视频时，我们追踪小鼠整个身体的运动。平均速度指小鼠身体所行路径的总长度除以经过的时间。因此，若小鼠未发生移动，其瞬时速度视为零。 - 清除旷场反应箱内的粪便残留。喷洒70%乙醇溶液后擦拭清洁。
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结果
在圆筒实验中，与生理盐水处理组小鼠（第1组）相比，经MPTP处理第1至第7天、第8天给予生理盐水的小鼠（第2组）表现出靠墙站立次数减少；而与第2组小鼠相比，经MPTP处理第1至第7天、第8天给予L-DOPA的小鼠（第3组）表现出靠墙站立次数增加（图1).
图2展示了三组小鼠静止时间、行走时间和奔跑时间的代表性轨迹及分布情况。（A）小鼠接受生理盐水处理。（B）小鼠在第1至第7天接受MPTP处理，第8天给予生理盐水。（C）小鼠在第1至第7天接受MPTP处理，第8天给予L-DOPA。当小鼠在开放场地中的移动速度分别<1 cm/s、1–20 cm/s或>20 cm/s时，被判定为静止、行走或奔跑状态。仅接受MPTP处理的小鼠相较于生理盐水处理组表现出更低的运动速度、更短的运动距离、更长的静止时间以及更短的奔跑时间，表明MPTP诱导...
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讨论
由于脑内黑质部位的多巴胺能神经元遭到破坏，MPTP 可在小鼠中引发类似帕金森病的症状7。自临床应用以来，左旋多巴（L-DOPA）一直是治疗帕金森病（PD）的首选药物，因其能够有效抑制运动异常（包括运动迟缓和肌强直），帮助患者维持正常的日常活动15。经 MPTP 处理的小鼠在筒壁实验和旷场实验等行为学测试中表现出功能障碍，这些测试可用于研究 MPTP 帕金森病模型。筒壁实验和旷场实验通常用于评估动物的自发性活动。本研究中，我们对这两种行为学测试进行了改良，以适用于帕金森病的研究。如实验结果所示，L-DOPA 可通过改善动物的运动能力，减轻其行为学功能障碍。
通常情况下，小鼠被置于新环境时会探索周围空间。因此，当小鼠被放置于透明圆筒中时，会通过移动身体并抬起前肢触碰筒壁的方式在筒内进行探索。而使用如MPTP等神经毒素处理后的小鼠，该行为会减少。这使得我们能够在帕金森病（PD）研究中应用圆筒实验。前肢抬举次数反映了前肢用于支撑身体的使用情况，因而可用于评估新型化学实体对运动功能的影响。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由天津市大学生创新创业训练计划项目（项目编号：63183004）资助。该项目在南开大学药物化学生物学国家重点实验室启动。作者声明不存在利益冲突。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70% 乙醇 | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| 相机 | BASLER | acA645-100gm | |
| 圆筒实验 | 南开大学自制 | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| 左旋多巴 | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matlab 2017a | Mathworks | N/A | |
| 小鼠 | 中国科学院动物研究所 | Balb/c | 成年雌性小鼠（10周龄） |
| MPTP | 上海源叶生物科技有限公司 | S31504-500mg | |
| 旷场实验 | 南开大学自制 | N/A | |
| 注射器 | Solelybio | S-xsgwz-w | 灌注用 |
| 注射器 | 江西丰林医用制品有限公司 | hc3824 | 腹腔注射用 |
参考文献
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