Summary

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Published: March 08, 2019
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA’lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.

Abstract

Hücre dışı ve dolaşımdaki RNA’ların (exRNA) birçok hücre türü vücut tarafından üretilen ve tükürük, plazma, serum, süt ve idrar gibi çok sayıda vücut sıvısı bulunmaktadır. Bu RNA’ların bir alt kümesidir posttranscriptional regülatör – mikroRNA (miRNAs). Belirli hücre tipleri tarafından üretilen miRNAs betimlemek için tüp bebek kültür sistemleri hasat için kullanılabilir ve hücre bir alt grubunu profil exRNAs türetilmiş. Mezenkimal Kök hücre salgılanan faktörler çok sayıda hastalıkları ortadan kaldırılmasına karıştığı ve burada tüp bebek modeli sistemi olarak kullanılır. Bu kağıt toplama işlemi, küçük RNA arınma ve Kütüphane üretimi için sıra ekstraselüler miRNAs açıklanır. ExRNAs kültür ortamından hücresel RNA düşük RNA giriş örnekleri, için en iyi duruma getirilmiş yordamları çağıran kalarak farklı. Bu iletişim kuralı her adım kalite kontrol noktalarında exRNA arıtma ve sıralamanın sırasında gösterilen için kapsamlı bir rehber küçük exRNA sıralama kültür ortamından sağlar.

Introduction

Hücre dışı ve RNA’ların (exRNAs) dolaşan mevcut çeşitli vücut sıvıları ve dirençli doğru RNases1,2. Onların yüksek bereket, istikrar ve rahatlık-in erişilebilirlik tanılama ve prognostik işaretçileri3olarak klinik değerlendirmesi için caziptir. ExRNAs için ulaşım modu dahil hücre dışı veziküller (EVs), (örneğin, yüksek yoğunluklu lipoprotein; lipoproteinler ile dernek HDL) ve Ribonükleoprotein kompleksleri (gibi Argonaute2 kompleksleri ile)4.

ExRNAs bir alt kümesidir yaklaşık 22 kodlamayan RNA’ların, küçük mikroRNA (miRNAs), posttranscriptional gen ekspresyonu düzenleyen nt. Eski miRNAs hücre-hücre iletişim ve hücre homeostazı5Yönetmeliği karıştığı olmuştur. Örneğin, HDL endotel hücre adezyon molekül 1 (ICAM-1) bastırmak için eski-miR-223 sunar ve inflamasyon6. İlginçtir, miR-223 da ekstrasellüler lökosit akciğer kanseri hücreleri, onları bir daha invaziv fenotip7üzerinde almak programlama veziküller tarafından taşınan görülmektedir. Böylece, ex-miRNAs çeşitli vücut sıvıları ve hücre kültür orta transcriptome büyük ölçüde eski miRNA sinyal anlayışımızı geliştirir.

Küçük RNA (küçük RNA seq) sıralama küçük RNA’ların transcriptomics anlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Sadece farklı örnekleri arasında differentially ifade bilinen RNA’ların karşılaştırılabilir ama roman küçük RNA’ların da tespit ve karakterize. Sonuç olarak, farklı koşullar altında differentially ifade miRNAs belirlemek de sağlam bir yöntemdir. Ancak, bir küçük RNA seq engel üzerinden düşük exRNA giriş sıvı serebrospinal sıvı, tükürük, idrar, süt, serum ve kültür medya gibi küçük RNA seq kütüphaneler üreten zor olmasıdır. Illumina TruSeq küçük RNA Kütüphane hazırlık kuralından yaklaşık 1 µg kaliteli toplam RNA’ın gerektirir ve New England Biolabs NEBNext küçük RNA Kütüphane hazırlık ayarla iletişim kuralından 100 ng-1 µg RNA8,9gerektirir. Oftentimes, bu örnekler üzerinden toplam RNA vardır geleneksel UV-VIS Spektrofotometreler için algılama sınırı altında.

EX-miRNAs vücut sıvıları türetilmiş potansiyel olarak iyi prognostik ve tanılama işaretleri vardır. Ancak, fonksiyonel etkilerini incelemek için veya belirli eski miRNAs kökenini belirlemek için hücre kültür sistemleri genellikle bunun yerine kullanılır. Onların EVs miyokard infarktüsü, Alzheimer hastalığı ve Greft versus host hastalığı10dahil olmak üzere birçok hastalığın ortadan kaldırılmasına karıştığı olmuştur çünkü Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Burada, biz eski miRNAs arınma kemik iliği türevi MSCs (BMSCs) ve küçük RNA Kütüphane yapılar, sıralama ve veri analizi (şekil 1) en iyi duruma getirmek için kullanılan belirli adımları göstermektedir.

Protocol

Not: Mezenkimal Kök hücre büyüme orta (MSC medya) Malzemeler tablobelirtildiği gibi önceden hazırlanır. 1. hücre kültürü Not: İnsan Mezenkimal kök hücrelerin kemik iliği, yağ dokusu veya diğer kaynakları11elde edilebilir. Alternatif olarak, hMSCs bir tedarikçi ile satın alınabilir. Bu protokol için kullanılan BMSCs hastaların kemik iliği elde edilen ve bir şirketten satın aldı. 1 x 10<su…

Representative Results

Bu protokol için açıklanan yöntemi sonraki nesil sıralama için MSC kültüründen exRNA toplamak için optimize edilmiştir. İş akışının genel düzeni şekil 1 ‘ solda ve sağda ilgili kalite kontrol denetim noktaları vardır. Koleksiyon için gün hücre morfolojisi (şekil 3A) farklılaşmamış ve (şekil 3B) farklı hücrel…

Discussion

Burada, biz fark ifade analizleri düşük giriş örneklerinden sağlar exRNAs, sonraki nesil sıralama için bir iletişim kuralı tanımlamak. Belirli bir iletişim kuralı için EV ve exRNA yalıtım yapıştırma miRNA13,14düzeyde ve hatta küçük değişiklikler (yani, ultrasantrifüj adım ya da bir değişiklik rotor tipi) transcriptome etkileyebilir çünkü önemlidir. Böylece, nasıl exRNA izole ne olursa olsun, bu sonuçları karşılaştırmak iç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onların teknik destek için iNANO Bay Claus otobüs ve Bayan Rita Rosendahl için minnettarız. Onun ultracentrifuge sık sık bizim kullanımına izin veren Dr. Daniel Otzen sayesinde özel. Bu çalışmada yenilik Fonu Danimarka (kabul Projesi) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

References

  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
  9. . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Play Video

Cite This Article
Yan, Y., Chang, C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

View Video