聚乙烯亚胺包被的氧化铁纳米颗粒作为小干扰RNA体外和体内递送至巨噬细胞的载体 In Vitro 和 In Vivo

摘要

我们介绍了一种利用聚乙烯亚胺（PEI）包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒将siRNA转染至巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可高效地将siRNA递送至巨噬细胞。 体外 和 体内 并沉默目标基因的表达。

摘要

由于巨噬细胞在调控免疫反应中具有关键作用，它们一直是深入研究的对象，并被视为治疗多种疾病（如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症）的潜在靶点。RNA干扰介导的基因沉默是研究和调控巨噬细胞功能的重要手段；然而，使用siRNA转染巨噬细胞通常被认为在技术上具有挑战性，目前可用于向巨噬细胞递送siRNA的方法仍十分有限。本文介绍了一种利用聚乙烯亚胺包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（PEI-SPIONs）作为载体，靶向递送siRNA至巨噬细胞的实验方案。当铁（Fe）与siRNA的重量比达到4及以上时，PEI-SPIONs能够有效结合并完全压缩siRNA。 体外这些纳米颗粒能够在不影响细胞活力的前提下，高效地将siRNA递送至原代巨噬细胞以及巨噬细胞样RAW 264.7细胞系，并在最佳转染剂量下最终实现siRNA介导的靶基因沉默。除了可用于 体外 siRNA 转染，PEI-SPIONs 也是一种有前景的将 siRNA 递送至巨噬细胞的工具 体内鉴于其兼具磁性与基因沉默能力，全身给药的PEI-SPION/siRNA颗粒不仅有望调控巨噬细胞功能，还可实现对巨噬细胞的成像与示踪。本质上，PEI-SPION是一种简单、安全且高效的非病毒载体平台，可用于向巨噬细胞递送siRNA 体外 和 体内.

引言

巨噬细胞是一类先天免疫细胞，分布于全身各种组织中，但含量各异。通过产生多种细胞因子和其他介质，巨噬细胞在宿主抵御侵入性微生物病原体、损伤后的组织修复以及维持组织稳态中发挥关键作用¹。由于其重要性，巨噬细胞一直是深入研究的重点对象。然而，尽管siRNA介导的基因沉默技术在基因调控和功能研究中广泛应用，但在巨噬细胞中该技术的成功率较低，尤其是原代巨噬细胞通常难以转染。这主要归因于大多数成熟转染方法具有相对较高的细胞毒性，这些方法通过化学方式（例如，使用聚合物和脂质）或物理方式（例如，电穿孔和基因枪）破坏细胞膜，使siRNA分子穿过膜结构，但会显著降低巨噬细胞的存活率^2,3。此外，巨噬细胞是专职的吞噬细胞，富含降解酶类，这些酶可能破坏siRNA的完整性，即使特异性siRNA已成功递送至细胞内，也会削弱其沉默效率^3,4。因此，一种有效的靶向巨噬细胞的siRNA递送系统需要在递送过程中保护siRNA的完整性和稳定性⁴。

越来越多的证据表明，功能异常的巨噬细胞参与了某些常见临床疾病（如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症）的起始....

方案

所有涉及活体动物的实验方法均按照中国东南大学的动物护理和使用指南进行。

1. PEI-SPIONs 的制备

1. 油酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备
   1. 溶解 FeCl₃•6H₂O 和 FeSO₄•7H₂N₂保护下水中反应₂.
      1. 加入28 g FeCl₃•6H₂O 和 20 g FeSO₄₄•7H₂O 加入盛有 80 mL 去离子水的烧杯中。引入 N₂ 通过玻璃导管加入水中，并搅拌至固体物质完全溶解。
      2. 将反应混合物在800 rpm的搅拌速率下加热至72 °C，随后加入40 mL氨水（28%），继续搅拌5 min。
   2. 将9 mL油酸逐滴加入上述溶液中，于72 °C下搅拌反应3 h。
   3. 将所得溶液冷却至室温（RT）。沉淀该溶液 通过 磁分离
   4. 用无水乙醇将含有SPIONs的沉淀物洗涤3次，然后将沉淀物分散于100 mL正己烷中。
2. 二巯基琥珀酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒....

结果

按照本方案制备的PEI-SPIONs粒径和zeta电位分别为29 - 48 nm（多分散指数：0.12 - 0.23）和30 - 48 mV。它们在4 °C水中储存超过12个月未出现明显聚集，具有良好的稳定性。为评估其与siRNA的结合能力，将PEI-SPIONs与siRNA在不同的Fe:siRNA质量比下混合。图1显示，当Fe:siRNA质量比达到4及以上时，游离siRNA条带完全消失，表明siRNA已成功结合至PEI-SPIONs上。PEI在生物医学应用中的主要问题是其毒性，这主要源于其强正电荷，尤其在高分子量和高剂量时更为显著。如图2A所示，zeta电位为30.5 mV和37 mV的PEI-SPIONs在铁浓度高达30 μg Fe/mL时未表现出明显细胞毒性，该浓度约为常规细胞转染使用浓度（15 μg Fe/mL）的两倍。然而，zeta电位为48 mV的PEI-SPIONs即使在最低测试剂量（10 μg Fe/mL）下也表现出毒性。因此，PEI-S.......

讨论

巨噬细胞对常用的非病毒转染方法（如电穿孔、阳离子脂质体和脂质类物质）具有抗性。本文介绍了一种可靠且高效的siRNA转染巨噬细胞的方法。采用本方案，可实现超过90%的类似巨噬细胞的RAW 264.7细胞（图2B） 以及大鼠腹腔巨噬细胞¹⁸成功转染siRNA，且细胞活力未受到显著影响。该方法依赖于PEI-SPION递送平台，这是一种由氧化铁核心和PEI外壳组成的纳米载体。因此，本方案的第一个关键步骤是合成适用于siRNA递送的PEI-SPION。通常，PEI包被的SPION是通过配体交换法由油酸包被的SPION制备而来，在该方法中，PEI或其衍生物直接取代SPION表面的油酸¹⁵，从而生成具有正电荷表面的亲水性纳米颗粒。在本方案中，SPION表面的油酸被水溶性的二巯基琥珀酸取代，随后通过静电相互作用将PEI负载到SPION表面。该方法温和且易于大量制备，所合成的纳米颗粒在水中具有优异的稳定性²⁰。众所周知，PEI具有细胞毒性，其毒.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Gibco	C11995500BT	使用前于37°C水浴中预热
胎牛血清	Gibco	A31608-02
青霉素/链霉素（1.5 ml）	Gibco	15140122
基于四唑盐的MTS检测试剂盒	Promega	G3582	用于细胞毒性分析
RAW 264.7细胞系	中国科学院上海细胞库	TCM13
组织培养板（6孔）	Corning	3516
组织培养皿（10 cm）	Corning	430167
无RNase离心管（1.5 ml）	AXYGEN	MCT-150-C
离心管（15 ml）	Corning	430791
胰蛋白酶	Gibco	25200-056
Wistar大鼠	中国科学院上海实验动物中心
冻干卡介苗（Bacillus Calmette–Guérin）粉针剂	中国食品药品检定研究院		用于诱导大鼠佐剂性关节炎
siRNA	吉玛基因（中国上海）
Cy3标记的siRNA	锐博生物（中国广州）
聚乙烯亚胺（10 kDa）	阿拉丁化学试剂有限公司	E107079
氨水	阿拉丁化学试剂有限公司	A112077
油酸	阿拉丁化学试剂有限公司	O108484
二甲基亚砜	阿拉丁化学试剂有限公司	D103272
FeSO4•7H2O	国药集团化学试剂有限公司	10012118
FeCl3•6H2O	国药集团化学试剂有限公司	10011918
二巯基丁二酸	阿拉丁化学试剂有限公司	D107254
超滤管	Millipore	UFC910096
四甲基氢氧化铵溶液	阿拉丁化学试剂有限公司	T100882
粒径与Zeta电位分析仪	英国Malvern公司	Nano ZS90