我们介绍了一种利用聚乙烯亚胺（PEI）包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒将siRNA转染至巨噬细胞的方法。这些纳米颗粒可高效地将siRNA递送至巨噬细胞。 体外 和 体内 并沉默目标基因的表达。
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方法文章
聚乙烯亚胺包被的氧化铁纳米颗粒作为小干扰RNA体外和体内递送至巨噬细胞的载体 In Vitro 和 In Vivo
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
由于巨噬细胞在调控免疫反应中具有关键作用，它们一直是深入研究的对象，并被视为治疗多种疾病（如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症）的潜在靶点。RNA干扰介导的基因沉默是研究和调控巨噬细胞功能的重要手段；然而，使用siRNA转染巨噬细胞通常被认为在技术上具有挑战性，目前可用于向巨噬细胞递送siRNA的方法仍十分有限。本文介绍了一种利用聚乙烯亚胺包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（PEI-SPIONs）作为载体，靶向递送siRNA至巨噬细胞的实验方案。当铁（Fe）与siRNA的重量比达到4及以上时，PEI-SPIONs能够有效结合并完全压缩siRNA。 体外这些纳米颗粒能够在不影响细胞活力的前提下，高效地将siRNA递送至原代巨噬细胞以及巨噬细胞样RAW 264.7细胞系，并在最佳转染剂量下最终实现siRNA介导的靶基因沉默。除了可用于 体外 siRNA 转染，PEI-SPIONs 也是一种有前景的将 siRNA 递送至巨噬细胞的工具 体内鉴于其兼具磁性与基因沉默能力，全身给药的PEI-SPION/siRNA颗粒不仅有望调控巨噬细胞功能，还可实现对巨噬细胞的成像与示踪。本质上，PEI-SPION是一种简单、安全且高效的非病毒载体平台，可用于向巨噬细胞递送siRNA 体外 和 体内.
引言
巨噬细胞是一类先天免疫细胞，分布于全身各种组织中，但含量各异。通过产生多种细胞因子和其他介质，巨噬细胞在宿主抵御侵入性微生物病原体、损伤后的组织修复以及维持组织稳态中发挥关键作用1。由于其重要性，巨噬细胞一直是深入研究的重点对象。然而，尽管siRNA介导的基因沉默技术在基因调控和功能研究中广泛应用，但在巨噬细胞中该技术的成功率较低，尤其是原代巨噬细胞通常难以转染。这主要归因于大多数成熟转染方法具有相对较高的细胞毒性，这些方法通过化学方式（例如，使用聚合物和脂质）或物理方式（例如，电穿孔和基因枪）破坏细胞膜，使siRNA分子穿过膜结构，但会显著降低巨噬细胞的存活率2,3。此外，巨噬细胞是专职的吞噬细胞，富含降解酶类，这些酶可能破坏siRNA的完整性，即使特异性siRNA已成功递送至细胞内，也会削弱其沉默效率3,4。因此，一种有效的靶向巨噬细胞的siRNA递送系统需要在递送过程中保护siRNA的完整性和稳定性4。
越来越多的证据表明，功能异常的巨噬细胞参与了某些常见临床疾病（如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化和癌症）的起始与进展。因此，利用siRNA等手段调控巨噬细胞功能，正成为治疗这些疾病的一种颇具吸引力的策略。5,6,7尽管已取得诸多进展，基于siRNA的治疗策略仍面临重大挑战，即全身给药的siRNA细胞特异性差以及巨噬细胞对siRNA摄取不足，从而导致非预期的副作用。与通常缺乏理想细胞选择性且易引起脱靶不良反应的游离核酸治疗剂相比，药物负载的纳米颗粒（NPs）由于可自发被网状内皮系统捕获，因而可被设计用于实现对巨噬细胞的被动靶向 体内，可在副作用最小的情况下提高治疗效果8目前用于RNA分子递送的纳米颗粒包括无机纳米载体、多种脂质体和聚合物9其中，聚乙烯亚胺（PEI）是一种能够结合并压缩核酸形成稳定纳米颗粒的阳离子聚合物，表现出最高的RNA递送能力9,10PEI 可保护核酸免受酶促和非酶促降解，介导其跨细胞膜转运，并促进其在细胞内的释放。尽管最初被用作DNA递送试剂，但后续研究表明PEI也是一种有吸引力的平台，可用于 在体 siRNA 递送，无论是局部还是全身性递送9,10.
超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）因其磁性、生物相容性、与生物重要物质相当的尺寸、高比表面积以及易于修饰以结合生物试剂的表面特性，在生物医学领域展现出巨大潜力11例如，由于其作为对比剂的潜在效用以及被巨噬细胞快速摄取的特性，超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）已成为用于成像组织巨噬细胞的首选临床工具12尽管SPIONs也被广泛研究作为核酸递送载体11,13,14,15据我们所知，文献中关于将超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）作为靶向巨噬细胞的siRNA载体的报道较少。在利用SPIONs进行基因递送时，通常在其表面包被一层亲水性阳离子聚合物，从而通过静电作用吸引并结合带负电荷的核酸分子。本文介绍了一种合成表面修饰低分子量（10 kDa）支化聚乙烯亚胺（PEI-SPIONs）的SPIONs的方法。这些磁性纳米平台可用于压缩siRNA，形成PEI-SPION/siRNA复合物，进而实现siRNA向细胞内的转运。我们推测，网状内皮系统细胞对SPIONs的自发吞噬作用16，结合PEI对核酸强大的结合与压缩能力，使得PEI-SPIONs适用于将siRNA高效递送至巨噬细胞。本文提供的数据支持PEI-SPION/siRNA介导的基因沉默在培养巨噬细胞中的可行性，以及 体内.
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方案
所有涉及活体动物的实验方法均按照中国东南大学的动物护理和使用指南进行。
1. PEI-SPIONs 的制备
- 油酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备
- 溶解 FeCl3•6H2O 和 FeSO4•7H2N₂保护下水中反应2.
- 加入28 g FeCl3•6H2O 和 20 g FeSO₄4•7H2O 加入盛有 80 mL 去离子水的烧杯中。引入 N2 通过玻璃导管加入水中，并搅拌至固体物质完全溶解。
- 将反应混合物在800 rpm的搅拌速率下加热至72 °C，随后加入40 mL氨水（28%），继续搅拌5 min。
- 将9 mL油酸逐滴加入上述溶液中，于72 °C下搅拌反应3 h。
- 将所得溶液冷却至室温（RT）。沉淀该溶液 通过 磁分离
- 用无水乙醇将含有SPIONs的沉淀物洗涤3次，然后将沉淀物分散于100 mL正己烷中。
- 溶解 FeCl3•6H2O 和 FeSO4•7H2N₂保护下水中反应2.
- 二巯基琥珀酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备
- 将800 mg分散于200 mL正己烷中的油酸（OA）修饰SPIONs，以及400 mg分散于200 mL丙酮中的二巯基丁二酸（DMSA），加入置于60 °C水浴中的三颈烧瓶中。
注意：为确定上一步骤获得的油酸修饰的超顺磁性纳米氧化铁（OA-SPION）的浓度，可取少量分散液（例如 1 mL），挥发除去正己烷后称量所得粉末质量。 - 在上述溶液中，于1,000 rpm搅拌并回流条件下，逐滴加入200 µL三乙胺。
- 搅拌回流5小时后，通过磁分离获得黑色沉淀。
- 使用四甲基氢氧化铵调节溶液pH值，将亲水性SPIONs在去离子水中均匀分散。
- 将800 mg分散于200 mL正己烷中的油酸（OA）修饰SPIONs，以及400 mg分散于200 mL丙酮中的二巯基丁二酸（DMSA），加入置于60 °C水浴中的三颈烧瓶中。
- PEI-SPIONs 的制备
- 在500 mL三口烧瓶中，将DMSA修饰的SPION胶体溶液在1,000 rpm机械搅拌下，逐滴加入PEI溶液（10 kDa）中，持续2 h（W铁:WPEI = 1:3).
注意：PEI-SPIONs 的电荷和大小取决于 W 的比例Fe 至 WPEI。W铁:WPEI 1:3 的比例可作为合成适用于siRNA递送的PEI-SPIONs的一个良好起点。 - 将所得溶液加入截留分子量为100 kDa、容积为15 mL的超滤管中，在5,400 × g条件下离心10分钟，直至剩余溶液体积为1 mL。加入去离子水使溶液体积再次达到15 mL，重复上述步骤10次，以获得最终产物。随后，将溶液经0.22 μm滤膜过滤，最终产物于4 °C保存。
- 采用邻菲罗啉比色法测定PEI-SPIONs中的铁浓度17将PEI-SPIONs用去离子无菌水稀释至铁浓度为1 mg/mL，并于4 °C保存。
- 将10 μL PEI-SPION溶液（1 mg Fe/mL）用去离子水稀释至1 mL，然后使用动态光散射仪检测其流体动力学粒径和泽塔电位。
注意：制备粒径范围约为30–50 nm的PEI-SPIONs。在此尺寸范围内，纳米颗粒大小对siRNA结合及细胞摄取的影响不显著。当PEI-SPIONs的平均zeta电位超过+37 mV时，在转染剂量范围内可能具有细胞毒性，因此应进行细胞毒性检测以确保安全性。通过调节PEI含量，可将纳米颗粒的表面电荷和流体力学尺寸控制在理想范围内。
- 在500 mL三口烧瓶中，将DMSA修饰的SPION胶体溶液在1,000 rpm机械搅拌下，逐滴加入PEI溶液（10 kDa）中，持续2 h（W铁:WPEI = 1:3).
2. PEI-SPION/siRNA 纳米颗粒的制备及琼脂糖凝胶电泳
- 用无RNase水稀释siRNA，使其终浓度为20 μM（0.26 μg/μL）。
- 准备5个无RN酶的微量离心管，分别标记为0、1、2、4和8，标签代表不同的Fe:siRNA质量比。将3 μL siRNA溶液加入所有离心管中（每管约含0.8 μg siRNA）。
- 向标有 0、1、2、4 和 8 的离心管中分别加入 0、0.8、1.6、3.2 和 6.4 μg 的铁（以 PEI-SPIONs 形式）。每管的总样品体积保持在 20 μL 以下。轻轻吹打混匀。
- 在室温下孵育混合物30分钟，以促进PEI-SPION/siRNA复合物的形成。在此期间，使用高纯度琼脂糖制备3%琼脂糖凝胶。
注意：其他 Fe:siRNA 比例的 PEI-SPION/siRNA 复合物（例如，可制备并测试5或6。 - 每5 μL样品中加入1 μL的6x DNA上样缓冲液，小心混匀。将所有样品上样，以5 V/cm的电压进行电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶长度的三分之二处。用溴化乙锭（EB）染色15–20分钟。
注意：应使用 freshly prepared 电泳缓冲液和 EB 溶液。 - 在紫外成像系统下观察siRNA条带。检测siRNA与PEI-SPIONs形成复合物的Fe:siRNA比例，此时代表游离siRNA的条带会出现滞留或无法被检测到。
3. RAW264.7 巨噬细胞的转染 体外
- 使用含10%胎牛血清（FBS）、每100 U/mL青霉素和每100 μg/mL链霉素的完全DMEM培养基，在37 °C、5% CO2培养箱中，于10 cm培养皿中培养小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞。
- 转染前一天，吸除细胞培养基，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）清洗细胞一次。向10 cm培养皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，在37 °C、5% CO2培养箱中消化RAW264.7细胞约5–10分钟。
- 当大部分细胞脱落（约5–10分钟后），向培养皿中加入5 mL完全DMEM培养基以终止胰蛋白酶消化作用。用移液器反复吹打，使细胞团块分散为单细胞悬液。
- 将细胞悬液转移至无菌15 mL锥形离心管中，在室温下以300 × g离心3分钟，弃去上清液。
- 用5 mL新鲜完全DMEM培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。
- 在6孔板中每孔接种9 × 104个细胞，加入2 mL完全DMEM培养基，于37 °C、5% CO2培养箱中培养约24小时。
注意：若使用其他规格的培养板，请根据相对表面积按比例调整接种细胞密度，以确保转染时细胞融合度达到80%。 - 当细胞融合度达到80%时，吸除原有培养基，每孔更换为1 mL完全DMEM培养基。将培养板放回培养箱中孵育，直至PEI-SPION/siRNA复合物制备完成并准备使用（约30分钟）。
- 制备PEI-SPION/siRNA复合物：根据转染实验需求计算所需PEI-SPION/siRNA复合物的用量。在1.5 mL无RNase的微量离心管中，按设定的Fe:siRNA质量比将适量PEI-SPION与siRNA混合。例如，若需制备含100 µg铁、Fe:siRNA比为4的PEI-SPION/siRNA纳米颗粒，则向96 μL siRNA溶液（0.26 μg/μL）中加入100 µL PEI-SPION（1 mg Fe/mL），随后用微量移液器轻轻混匀。室温孵育30分钟。
注意：所制备的PEI-SPION/siRNA复合物体积应比实际需要量多出10%，以补偿操作过程中的损失。建议在较低Fe:siRNA比条件下制备复合物，以确保siRNA分子完全负载于PEI-SPION上，从而减少PEI-SPION用量，降低潜在细胞毒性。优化Fe:siRNA比时需进行预实验（如凝胶阻滞实验）。 - 从培养箱中取出6孔板（步骤3.7）。将所需体积的PEI-SPION/siRNA复合物逐滴加入各孔中，轻轻摇动培养板以确保均匀分布。将培养板放回培养箱继续孵育，直至进行细胞摄取或基因沉默效率检测（1–3天）。
注意：以约15 μg Fe/mL的浓度用PEI-SPION/siRNA转染巨噬细胞，可在最大化转染效率的同时最小化潜在细胞毒性。
4. 在实验性关节炎大鼠中将 siRNA 系统性递送至巨噬细胞
- 获取7周龄的无特定病原体级雄性Wistar大鼠，使用前适应性饲养7天，并提供充足的食物和饮水。按照先前所述方法诱导大鼠佐剂性关节炎（AA）。18.
- 按照第3.8步所述制备PEI-SPION/siRNA复合物。
- 向AA大鼠注射PEI-SPION/siRNA纳米颗粒（0.3 mg siRNA/kg） 通过 尾静脉。评估细胞摄取 通过，例如，流式细胞术，组织生物分布 通过例如，基于特定时间点的临床、组织学和放射学分析，评估实时荧光成像系统或其他治疗效果18.
注意：对于细胞和组织生物分布研究，给予大鼠单次注射所需纳米颗粒；对于治疗学研究，每周注射待测纳米颗粒一次，连续三周。
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结果
按照本方案制备的PEI-SPIONs粒径和zeta电位分别为29 - 48 nm（多分散指数：0.12 - 0.23）和30 - 48 mV。它们在4 °C水中储存超过12个月未出现明显聚集，具有良好的稳定性。为评估其与siRNA的结合能力，将PEI-SPIONs与siRNA在不同的Fe:siRNA质量比下混合。图1显示，当Fe:siRNA质量比达到4及以上时，游离siRNA条带完全消失，表明siRNA已成功结合至PEI-SPIONs上。PEI在生物医学应用中的主要问题是其毒性，这主要源于其强正电荷，尤其在高分子量和高剂量时更为显著。如图2A所示，zeta电位为30.5 mV和37 mV的PEI-SPIONs在铁浓度高达30 μg Fe/mL时未表现出明显细胞毒性，该浓度约为常规细胞转染使用浓度（15 μg Fe/mL）的两倍。然而，zeta电位为48 mV的PEI-SPIONs即使在最低测试剂量（10 μg Fe/mL）下也表现出毒性。因此，PEI-S...
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讨论
巨噬细胞对常用的非病毒转染方法（如电穿孔、阳离子脂质体和脂质类物质）具有抗性。本文介绍了一种可靠且高效的siRNA转染巨噬细胞的方法。采用本方案，可实现超过90%的类似巨噬细胞的RAW 264.7细胞（图2B） 以及大鼠腹腔巨噬细胞18成功转染siRNA，且细胞活力未受到显著影响。该方法依赖于PEI-SPION递送平台，这是一种由氧化铁核心和PEI外壳组成的纳米载体。因此，本方案的第一个关键步骤是合成适用于siRNA递送的PEI-SPION。通常，PEI包被的SPION是通过配体交换法由油酸包被的SPION制备而来，在该方法中，PEI或其衍生物直接取代SPION表面的油酸15，从而生成具有正电荷表面的亲水性纳米颗粒。在本方案中，SPION表面的油酸被水溶性的二巯基琥珀酸取代，随后通过静电相互作用将PEI负载到SPION表面。该方法温和且易于大量制备，所合成的纳米颗粒在水中具有优异的稳定性20。众所周知，PEI具有细胞毒性，其毒...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81772308）和国家重点研发计划（No. 2017YFA0205502）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | C11995500BT | 使用前于37°C水浴中预热 |
| 胎牛血清 | Gibco | A31608-02 | |
| 青霉素/链霉素（1.5 ml） | Gibco | 15140122 | |
| 基于四唑盐的MTS检测试剂盒 | Promega | G3582 | 用于细胞毒性分析 |
| RAW 264.7细胞系 | 中国科学院上海细胞库 | TCM13 | |
| 组织培养板（6孔） | Corning | 3516 | |
| 组织培养皿（10 cm） | Corning | 430167 | |
| 无RNase离心管（1.5 ml） | AXYGEN | MCT-150-C | |
| 离心管（15 ml） | Corning | 430791 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar大鼠 | 中国科学院上海实验动物中心 | ||
| 冻干卡介苗（Bacillus Calmette–Guérin）粉针剂 | 中国食品药品检定研究院 | 用于诱导大鼠佐剂性关节炎 | |
| siRNA | 吉玛基因（中国上海） | ||
| Cy3标记的siRNA | 锐博生物（中国广州） | ||
| 聚乙烯亚胺（10 kDa） | 阿拉丁化学试剂有限公司 | E107079 | |
| 氨水 | 阿拉丁化学试剂有限公司 | A112077 | |
| 油酸 | 阿拉丁化学试剂有限公司 | O108484 | |
| 二甲基亚砜 | 阿拉丁化学试剂有限公司 | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | 国药集团化学试剂有限公司 | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | 国药集团化学试剂有限公司 | 10011918 | |
| 二巯基丁二酸 | 阿拉丁化学试剂有限公司 | D107254 | |
| 超滤管 | Millipore | UFC910096 | |
| 四甲基氢氧化铵溶液 | 阿拉丁化学试剂有限公司 | T100882 | |
| 粒径与Zeta电位分析仪 | 英国Malvern公司 | Nano ZS90 |
参考文献
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