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方法文章

味觉信号蛋白缺失对炎症性肠病小鼠模型肠道炎症的影响

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DOI：

10.3791/58668

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2018年11月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Zhejiang University, 2Monell Chemical Senses Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种研究味觉相关基因缺失对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病（IBD）小鼠模型免疫反应影响的实验方案。

摘要

炎症性肠病（IBD）是一类与免疫相关的胃肠道疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，影响着全球数百万人的生活质量。IBD 的症状包括腹痛、腹泻和直肠出血，这些症状可能是肠道微生物群、食物成分、肠上皮细胞和免疫细胞之间相互作用的结果。评估在肠上皮细胞和免疫细胞中表达的各个关键基因如何影响结肠炎症具有重要意义。G 蛋白偶联味觉受体，包括 G 蛋白 α 亚基 gustducin 及其他信号蛋白，已在肠道中被发现。本文以 α-gustducin 为代表，描述了一种葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的 IBD 模型，用于评估味觉相关基因突变对肠道黏膜免疫和炎症的影响。该方法结合了基因敲除技术与化学诱导的 IBD 模型，因此可用于评估味觉基因缺失以及其他可能增强或抑制 DSS 诱导结肠免疫反应的基因所产生的效应。将 DSS 给予突变小鼠一定时间，在此期间监测并记录其体重、粪便状况和直肠出血情况。在给药过程中的不同时间点，处死部分小鼠，测量其脾脏和结肠的大小与重量，并采集肠道组织进行组织学和基因表达分析。结果显示，与野生型小鼠相比，α-gustducin 基因敲除小鼠表现出更严重的体重下降、腹泻、肠道出血、组织损伤和炎症。vs. 由于诱导炎症的严重程度受小鼠品系、饲养环境和饮食的影响，在预实验中优化 DSS 浓度和给药持续时间尤为重要。通过调整这些因素，该方法可用于评估抗炎和促炎效应。

引言

炎症性肠病（IBD）主要有两种形式：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其特征是肠道出现慢性缓解性或进行性炎症，病因具有多因素性1,2。IBD的发生取决于遗传因素以及某些环境因素，如饮食、抗生素使用，尤其是病原体感染。然而，IBD的病因及其调控的分子机制仍不明确。因此，已构建并应用了多种化学诱导的IBD动物模型，用于阐明其发病机制和调控机制，并评估人类治疗手段的有效性3。

味觉受体属于G蛋白偶联受体（GPCRs），可分为两大类：I型（T1Rs）和II型（T2Rs），分别感知甜味、鲜味和苦味物质。味觉信号级联反应由味觉刺激物与T1Rs或T2Rs结合而启动，进而激活由α-味导素（α-gustducin）和Gβγ二聚体组成的异源三聚体G蛋白，导致Gβγ亚基的释放。释放的Gβγ组分继而激活下游效应酶磷脂酶C-β2（PLC-β2）。活化的PLC-β2将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸水解为两种细胞内第二信使——肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油，其中IP3与通道型受体IP3R3结合并使其开放，促使钙离子从内质网中释放。最终导致瞬时受体电位离子通道Trpm5的开放，并将神经递质ATP释放至味觉神经上4,5,6,7。然而，咸味和酸味的信号通路与甜味、鲜味及苦味不同，且相互独立8。此外，味觉GPCR及其下游蛋白组分存在于多种口腔外组织中。近期研究表明，作为味觉信号通路主要组分的α-味导素在肠黏膜中亦有表达。尚需进一步研究以明确这些味觉信号组分在口腔外组织中的功能9,10。

本文所述方法用于表征在肠外组织中表达的味觉信号蛋白的功能。我们将一种为解析味蕾中信号级联通路而开发的转基因小鼠品系与化学诱导的结肠炎模型相结合。由于其操作简便且病理特征与人类溃疡性结肠炎高度相似，右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病（IBD）模型在多种化学诱导结肠炎模型中应用最为广泛11。在本研究中，我们采用α-味转导蛋白缺陷型小鼠作为代表性小鼠品系，通过以下两种方式揭示α-味转导蛋白在肠道黏膜免疫和炎症中的新功能：1）分析组织形态学变化；2）检测结肠中与炎症相关的细胞因子表达差异。当存在目标基因的基因修饰小鼠品系时，该方法可用于定性和定量评估味觉信号蛋白（以及其他在肠道中表达的蛋白）对组织损伤和肠道炎症的贡献。该方法的优势在于可使研究者获得由化学物质DSS处理与目标基因缺失共同作用所产生的整合数据。该方法还可进一步优化，以提高其灵敏度，并揭示细胞和分子水平上细微的肠道变化。

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方案

所有涉及小鼠的实验均经过浙江大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准。建议在执行本方案前佩戴适当的个人防护装备。

1. 小鼠和DSS的准备

  1. 将基因敲除小鼠（α-gustducin-/-）与年龄、性别和体重相匹配的野生型对照小鼠（α-gustducin+/+）C57BL/6 小鼠分别饲养于清洁的笼具中。
    注：基因敲除小鼠已与 C57BL/6 小鼠回交超过 20 代，具有接近 100% 的 C57BL/6 遗传背景。
  2. 将 30 g 右旋糖酐硫酸钠（DSS）粉末溶于 1 L 经高压灭菌的水中，搅拌至溶液澄清，确保终工作浓度为 3%（w/v）。
    注：DSS 溶液可在室温下保存最多 1 周，或置于 4 °C 保存至使用。

2. 小鼠DSS结肠炎的诱导与评估

  1. 称重并记录每只小鼠的初始体重。将小鼠分别放入标准塑料笼中，并对笼子进行标记。
  2. 将普通饮用水替换为3% DSS溶液，持续7天，两组小鼠均可自由饮用（ad libitum）。
  3. 在DSS处理期间，每天测量小鼠体重，记录DSS溶液消耗量，并收集和检查每只小鼠的粪便。观察腹泻和直肠出血的严重程度，并将其转换为DSS诱导的疾病指数12。
  4. 实验过程中，通过计算相对于初始体重的体重下降百分比和疾病指数，评估结肠炎症状。
    注：疾病指数根据腹泻和直肠出血的观察结果综合评分，定义如下：0分（粪便正常，无出血），1分（软便，无出血），2分（软便，少量出血），3分（极软便，中度出血），4分（水样便，明显出血）12。每天对每只小鼠进行疾病指数分析。
  5. 完成7天DSS处理后，通过颈椎脱臼法处死小鼠，并继续进行后续实验。

3. 组织样本的制备

  1. 将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇清洁腹部皮肤。用一把小剪刀在腹部做一条3 cm长的正中切口，以暴露腹腔。
  2. 使用镊子小心地将脾脏与其他组织分离，然后取出脾脏并测量其大小。
  3. 用镊子识别并提起结肠，将其从周围肠系膜中分离。拉出整个结肠，直至盲肠和直肠可见。
  4. 在结肠-盲肠交界处和盆腔深部切断结肠，分别游离近端和远端结肠，从而分离结肠。然后测量并记录分离后结肠的长度。在解剖过程中注意不要损伤结肠组织。
  5. 用配备灌胃针头的10 mL注射器，以10 mL冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗结肠，去除粪便和血液，直至流出液完全澄清。
  6. 为进行组织学鉴定，将组织样本均分为三部分：近端、中段和远端。然后用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C下固定过夜。
  7. 为分析细胞因子表达，用液氮迅速冷冻整个结肠，并在-80 °C下保存至使用前。

4. DSS诱导性结肠炎严重程度的组织学评估

  1. 苏木精-伊红（H&E）染色
    1. 固定后，将组织置于含有30%蔗糖的1×PBS溶液中，于15 mL离心管中4°C过夜浸泡，以实现组织的冷冻保护。
    2. 将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并置于-20 °C环境中，直至OCT完全凝固。
    3. 将含有组织的OCT包埋块转移至冷冻切片机中，设定切片厚度为12 µm，切取并收集厚度为12 µm的冷冻切片。
    4. 将冷冻切片机收集的组织切片置于65 °C加热板上加热20分钟。
    5. 用蒸馏水短暂清洗切片，随后使用苏木精染色液染色5分钟，再用流动自来水冲洗5分钟。
    6. 使用0.5%盐酸-乙醇溶液分化30秒，再用流动自来水冲洗1分钟。然后用1×PBS洗涤1分钟，再用流动自来水冲洗5分钟。
    7. 依次使用70%、75%、80%和95%乙醇对组织切片进行洗涤，每次10秒。随后使用伊红染色液复染2分钟。
    8. 通过95%乙醇及两次更换的无水乙醇进行脱水，每次5分钟。再用两次更换的二甲苯透明，每次5分钟。
    9. 根据上述H&E染色结果，对基因敲除组和野生型组每只小鼠的近端、中段和远端结肠组织损伤程度进行评分。
      ​注：疾病指数为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层区域上皮损伤与炎症的综合评分，定义如下：0分（无组织损伤和炎症），1分（局灶性组织损伤和炎症），2分（片状组织损伤和炎症），3分（弥漫性组织损伤和炎症）12,13。每只小鼠分别对结肠近端、中段和远端三个部位进行评分，总分为三项之和。最后计算各组的平均评分。
  2. 免疫组织化学14
    1. 将冷冻切片机收集的组织切片置于65 °C加热板上加热20分钟。用1×PBS洗涤切片3次，每次10分钟。加入3%过氧化氢溶液，室温孵育10分钟以灭活内源性过氧化物酶。再用1×PBS洗涤3次。
    2. 弃去PBS，加入含以下免疫细胞类型特异性一抗的溶液：CD45（白细胞）、CD3（T细胞）、B220（B细胞）、CD11b（巨噬细胞）和Ly6G（中性粒细胞）。4 °C孵育过夜。
    3. 吸除组织切片上的一抗溶液，用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。加入生物素标记的二抗，室温孵育，随后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）复合物，室温孵育。
    4. 加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色液，孵育至出现浅棕色或深棕色显色，以显示免疫反应阳性细胞。
    5. 使用苏木精和0.3%（v/v）稀释氨水对切片进行复染。在显微镜下以10倍物镜采集明场图像。
    6. 使用图像处理软件，通过设置两个掩膜来识别并定量上皮层及固有层（上皮下方）中标记的免疫细胞数量：第一个掩膜基于颜色立方体特征设定颜色检测阈值，用于测量DAB显色阳性区域面积；第二个掩膜用于确定待分析切片中上皮层和固有层的总面积。免疫反应阳性细胞数量以浸润细胞染色面积占待分析组织总面积的比值表示。

5. DSS诱导结肠炎的基因表达评估

  1. 从-80 °C冰箱中取出DSS处理的基因敲除小鼠和野生型小鼠的结肠组织，向25 mg组织中加入0.6 mL裂解缓冲液，然后在匀浆器中进行匀浆。
  2. 按照RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA，并使用DNase I去除可能存在的基因组DNA污染。
  3. 使用琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA质量。若28S RNA条带亮度高于18S条带，则RNA可使用。取1 µL RNA样品，用微量分光光度计测定RNA浓度。
  4. 将1 µg总RNA与2.5 µL 20 mM寡核苷酸(dT)混合12,13,14,15,16,17,18 引物和1 µL莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶。在42 °C孵育60分钟以制备cDNA。
  5. 将1 µL cDNA与0.5 µL针对TNF、IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-10、TGF-β1以及作为对照的β-Actin的正向和反向qPCR引物混合，并加入2x荧光绿色染料，配制实时PCR反应体系。
  6. 以以下参数进行qPCR扩增：95 °C 预变性10 min，随后进行45个循环，每个循环为95 °C 变性10 s、50 °C 退火25 s、72 °C 延伸20 s。
  7. 使用2−ΔΔCt法计算基因表达的相对定量-ΔΔCt 方法15. 比较分析敲除样本中的基因表达水平 与野生型小鼠

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结果

通过向α-gustducin基因敲除（KO）小鼠和野生型（WT）小鼠的饮用水中添加3%的DSS，建立DSS诱导的炎症性肠病（IBD）模型。与WT小鼠相比，基因敲除小鼠表现出更严重的结肠炎症状，包括显著的体重下降、腹泻和肠道出血（图1）。在连续7天给予DSS后，采用H&E染色作为组织学方法分析组织完整性，结果显示，与WT小鼠相比，基因敲除小鼠的近端、中段和远端结肠组织损伤更为严重（图2）。此外，过度的免疫激活导致结肠炎，并伴有多种炎性细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的浸润。通过使用多种免疫细胞标志物进行免疫组织化学分析，以确定α-gustducin缺失是否影响免疫细胞的浸润。比较分析显示，与WT对照组小鼠相比，基因敲除小鼠中白细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著增加（图3）。最后，采用特异性基因引物通过qPCR检测DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织中部分细胞因子的表达水平。结果表明，与WT小鼠相比...

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讨论

该方法可用于定量评估特定味觉基因突变在DSS诱导的IBD小鼠模型中对炎症的影响。为充分发挥该方法的优势，IBD的优化诱导是关键步骤。结肠炎的发展受到多种因素影响，包括小鼠品系、饲养环境、肠道微生物群以及目标基因。建议使用少量小鼠进行预实验，以测试不同剂量和持续时间的DSS处理方案。在预实验过程中，应分析并比较实验组与饮用不含DSS水的对照组之间的大体症状，如体重减轻、腹泻、肠道出血，以及一些微观变化，如组织损伤、伴随免疫细胞浸润的炎症反应，以及细胞因子表达水平的变化16,17,18,19。在DSS处理期间，可通过监测小鼠每日体重变化及粪便评分来评估诱导性结肠炎的严重程度。DSS处理结束后，可通过结肠冷冻切片的H&E染色评估组织损伤情况，而免疫细胞浸润和细胞因子表达水平则可通过免疫组织化学和qPCR进行鉴定与定量。可通过调整DSS剂量、给药持续时间及饮食，以揭示味觉基因...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到中国国家自然科学基金（81671016、31471008 和 31661143030）、美国国立卫生研究院（DC010012、DC015819）以及思源基金会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
CD45BD Biosciences550539
CD3BD Biosciences555273
B220BD Biosciences550286
CD11bBD Biosciences550282
Ly6GBD Biosciences551459
试剂
硫酸葡聚糖钠盐（DSS）MP Biomedicals2160110
链霉亲和素-HRP 复合物BD Pharmingen551011
H&E 染色试剂盒BBI Life SciencesE607318
磷酸盐缓冲液（PBS）Sangon BiotechB548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)Roche4913850001
MMLV 逆转录酶，GPRClontech,TaKaRa639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA 提取试剂盒 TaKaRa9767
BD 10 mL 注射器BD Biosciences309604
仪器与设备
天平
剪刀 
镊子
离心机
qPCR 仪
染色缸
软件
Imag-Pro Plus Media Cybernetics, Inc. 

参考文献

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