味觉信号蛋白缺失对炎症性肠病小鼠模型肠道炎症的影响

摘要

本文介绍了一种研究味觉相关基因缺失对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病（IBD）小鼠模型免疫反应影响的实验方案。

摘要

炎症性肠病（IBD）是一类与免疫相关的胃肠道疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，影响着全球数百万人的生活质量。IBD 的症状包括腹痛、腹泻和直肠出血，这些症状可能是肠道微生物群、食物成分、肠上皮细胞和免疫细胞之间相互作用的结果。评估在肠上皮细胞和免疫细胞中表达的各个关键基因如何影响结肠炎症具有重要意义。G 蛋白偶联味觉受体，包括 G 蛋白 α 亚基 gustducin 及其他信号蛋白，已在肠道中被发现。本文以 α-gustducin 为代表，描述了一种葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的 IBD 模型，用于评估味觉相关基因突变对肠道黏膜免疫和炎症的影响。该方法结合了基因敲除技术与化学诱导的 IBD 模型，因此可用于评估味觉基因缺失以及其他可能增强或抑制 DSS 诱导结肠免疫反应的基因所产生的效应。将 DSS 给予突变小鼠一定时间，在此期间监测并记录其体重、粪便状况和直肠出血情况。在给药过程中的不同时间点，处死部分小鼠，测量其脾脏和结肠的大小与重量，并采集肠道组织进行组织学和基因表达分析。结果显示，与野生型小鼠相比，α-gustducin 基因敲除小鼠表现出更严重的体重下降、腹泻、肠道出血、组织损伤和炎症。vs. 由于诱导炎症的严重程度受小鼠品系、饲养环境和饮食的影响，在预实验中优化 DSS 浓度和给药持续时间尤为重要。通过调整这些因素，该方法可用于评估抗炎和促炎效应。

引言

炎症性肠病（IBD）主要有两种形式：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其特征是肠道出现慢性缓解性或进行性炎症，病因具有多因素性^1,2。IBD的发生取决于遗传因素以及某些环境因素，如饮食、抗生素使用，尤其是病原体感染。然而，IBD的病因及其调控的分子机制仍不明确。因此，已构建并应用了多种化学诱导的IBD动物模型，用于阐明其发病机制和调控机制，并评估人类治疗手段的有效性³。

味觉受体属于G蛋白偶联受体（GPCRs），可分为两大类：I型（T1Rs）和II型（T2Rs），分别感知甜味、鲜味和苦味物质。味觉信号级联反应由味觉刺激物与T1Rs或T2Rs结合而启动，进而激活由α-味导素（α-gustducin）和Gβγ二聚体组成的异源三聚体G蛋白，导致Gβγ亚基的释放。释放的Gβγ组分继而激活下游效应酶磷脂酶C-β2（PLC-β2）。活化的PLC-β2将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸水解为两种细胞内第二信使——肌醇-1,4,5-三磷酸（IP₃）和二酰甘油，其中IP₃与通道型受体IP₃R3结合并使其开放，促使钙离子从内质网中释放。最终导致瞬时受体电位离子通道Trpm5的开放，并将神经递质ATP释放至味觉神经上⁴

方案

所有涉及小鼠的实验均经过浙江大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准。建议在执行本方案前佩戴适当的个人防护装备。

1. 小鼠和DSS的准备

1. 将基因敲除小鼠（α-gustducin^-/-）与年龄、性别和体重相匹配的野生型对照小鼠（α-gustducin^+/+）C57BL/6 小鼠分别饲养于清洁的笼具中。
   注：基因敲除小鼠已与 C57BL/6 小鼠回交超过 20 代，具有接近 100% 的 C57BL/6 遗传背景。
2. 将 30 g 右旋糖酐硫酸钠（DSS）粉末溶于 1 L 经高压灭菌的水中，搅拌至溶液澄清，确保终工作浓度为 3%（w/v）。
   注：DSS 溶液可在室温下保存最多 1 周，或置于 4 °C 保存至使用。

2. 小鼠DSS结肠炎的诱导与评估

1. 称重并记录每只小鼠的初始体重。将小鼠分别放入标准塑料笼中，并对笼子进行标记。
2. 将普通饮用水替换为3% DSS溶液，持续7天，两组小鼠均可自由饮用（ad libitum）。
3. 在DSS处理期间，每天测量小鼠体重，记录DSS溶液消耗量，并收集和检查每只小鼠的粪便。观察腹泻和直肠出血的严重程度，并将其转换为DSS诱导的疾病指数¹²....

结果

通过向α-gustducin基因敲除（KO）小鼠和野生型（WT）小鼠的饮用水中添加3%的DSS，建立DSS诱导的炎症性肠病（IBD）模型。与WT小鼠相比，基因敲除小鼠表现出更严重的结肠炎症状，包括显著的体重下降、腹泻和肠道出血（图1）。在连续7天给予DSS后，采用H&E染色作为组织学方法分析组织完整性，结果显示，与WT小鼠相比，基因敲除小鼠的近端、中段和远端结肠组织损伤更为严重（图2）。此外，过度的免疫激活导致结肠炎，并伴有多种炎性细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的浸润。通过使用多种免疫细胞标志物进行免疫组织化学分析，以确定α-gustducin缺失是否影响免疫细胞的浸润。比较分析显示，与WT对照组小鼠相比，基因敲除小鼠中白细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著增加（图3）。最后，采用特异性基因引物通过qPCR检测DSS诱导结肠炎小鼠结肠组织中部分细胞因子的表达水平。结果表明，与WT小鼠相比.......

讨论

该方法可用于定量评估特定味觉基因突变在DSS诱导的IBD小鼠模型中对炎症的影响。为充分发挥该方法的优势，IBD的优化诱导是关键步骤。结肠炎的发展受到多种因素影响，包括小鼠品系、饲养环境、肠道微生物群以及目标基因。建议使用少量小鼠进行预实验，以测试不同剂量和持续时间的DSS处理方案。在预实验过程中，应分析并比较实验组与饮用不含DSS水的对照组之间的大体症状，如体重减轻、腹泻、肠道出血，以及一些微观变化，如组织损伤、伴随免疫细胞浸润的炎症反应，以及细胞因子表达水平的变化^16,17,18,19。在DSS处理期间，可通过监测小鼠每日体重变化及粪便评分来评估诱导性结肠炎的严重程度。DSS处理结束后，可通过结肠冷冻切片的H&E染色评估组织损伤情况，而免疫细胞浸润和细胞因子表达水平则可通过免疫组织化学和qPCR进行鉴定与定量。可通过调整DSS剂量、给药持续时间及饮食，以揭示味觉基因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体
CD45	BD Biosciences	550539
CD3	BD Biosciences	555273
B220	BD Biosciences	550286
CD11b	BD Biosciences	550282
Ly6G	BD Biosciences	551459
试剂
硫酸葡聚糖钠盐（DSS）	MP Biomedicals	2160110
链霉亲和素-HRP 复合物	BD Pharmingen	551011
H&E 染色试剂盒	BBI Life Sciences	E607318
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sangon Biotech	B548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)	Roche	4913850001
MMLV 逆转录酶，GPR	Clontech,TaKaRa	639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA 提取试剂盒	TaKaRa	9767
BD 10 mL 注射器	BD Biosciences	309604
仪器与设备
天平
剪刀
镊子
离心机
qPCR 仪
染色缸
软件
Imag-Pro Plus	Media Cybernetics, Inc.